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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN

AGUSTÍN
FACULTAD DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA DE
INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

BIOTECNOLOGIA DE
LOS ALIMENTOS

PRACTICA N°1:
BIOQUIMICA MICROBIANA

INTEGRANTES:

Hinojosa Ccama, Paola

Pulcha Parrillo, Judith

Santoyo Aranibar, Gabriela

TURNO:

Lunes 10:50 – 12:30

AREQUIPA - 2018
BIOTECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

PRÁCTICA N° 1
BIOQUÍMICA MICROBIANA

I. OBJETIVOS
 Estudiar la bioquímica microbiana a través del proceso reproductivo de
la levadura Saccharomyces Cerevisiae quien formara la biomasa.
 Estudiar la bioquímica microbiana a través del proceso fermentativo de
la levadura Saccharomyces Cerevisiae, quien formara el alcohol.
II. FUNDAMENTO TEÓRICO
Generalidades.
Levaduras:
Levadura es un organismo unicelular, que han sido utilizadas, desde la
antigüedad, en la elaboración de cervezas, pan y vino, pero los
fundamentos científicos de su cultivo y uso en grandes cantidades fueron
descubiertos por el microbiólogo francés Louis Pasteur en el siglo XIX (10 y
11). Se conocen cepas diferentes y específicas para cada labor
(panificación, destilería, producción de extractos de levadura y uso en
animales).
Las levaduras son organismos eucariotas con gran diversidad en tamaño,
forma y color. Son consideradas hongos unicelulares y generalmente sus
células son ovaladas, pero también pueden encontrarse en forma esférica,
cilíndrica o elíptica. Son más grandes que las bacterias, alcanzando un
diámetro máximo de entre cuatro y cinco μm (Almazán, 2008).
Saccharomyces cerevisiae.
Características generales:
Su nombre deriva del vocablo Saccharo (azúcar), myces (hongo) y
cerevisiae (cerveza). Es una levadura heterótrofa, que obtiene la energía a
partir de la glucosa y tiene una elevada capacidad fermentativa.
La Saccharomyces Cerevisiae posee una reproducción asexual, por
gemación. Una yema se forma a partir de la levadura original y, si las
condiciones son adecuadas, se desprende para formar un nuevo individuo.
La fermentación se produce cuando las levaduras extraen energía del
azúcar presente en la materia prima. Debido a que son anaerobias (es decir
que no necesitan la presencia de oxígeno para crecer) generan alcohol

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BIOTECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

como producto de la fermentación. Por ese motivo son utilizadas para


producir bebidas alcohólicas (Cabello, 2005).
En el caso de la producción de vino, las levaduras se alimentan del azúcar
de las uvas y lo reemplazan por alcohol. Al aumentar la concentración de
alcohol, las levaduras mueren y de esa forma finaliza el proceso de
fermentación.
La producción de cerveza se realiza mediante la fermentación de una
especie de levadura que se alimenta del azúcar presente en los granos de
cebada.

Factores a tener en cuenta para el crecimiento y desarrollo de la levadura:


Presión osmótica: la nutrición de la levadura es un proceso puramente
osmótico, es importante evitar medios hipertónicos o hipotónicos para evitar
la plasmoptisis y plasmólisis. El estrés osmótico puede causar una disminución
en el volumen celular, afecta además, la velocidad de fermentación, así
como la viabilidad celular.
Temperatura: Las altas temperaturas ocasionan una disminución de la
biomasa, producto de un descenso en el contenido de proteínas, RNA; DNA
y aminoácidos libres e induce a la rigidez de la membrana celular.
Temperaturas muy bajas provocan un estado de latencia en la célula,
deteniendo su desarrollo (Perez, 2007).
Desecación: Es uno de los principales agentes que inhiben las actividades y
desarrollo de los microorganismos.
Luz: Es perjudicial para los microorganismos que carecen de clorofila, o
cualquier otro pigmento que les permita usar la energía de las radiaciones
en el proceso de fotosíntesis.
pH: El pH óptimo en el cual se desarrollan mejor los microorganismos, está
entre 4 y 5. Las levaduras tienen la ventaja de soportar, medios más ácidos,

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que otros microorganismos, lo que es aprovechado en los procesos


industriales para mantener el medio controlado de bacterias que puedan
competir por el sustrato (Perez, 2007).
Alcohol: El efecto del etanol en la célula es una combinación de inhibición
del crecimiento y disminución de la viabilidad, puede actuar como inhibidor
de la fermentación a partir de un 8 %. Riegel afirma, que no es
recomendable terminar la fermentación con un grado alcohólico muy
elevado.
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Material, Instrumental y Equipos:
Materiales:
 Algarrobina
 Levadura (Saccharomyces cerevisiae)
 Peptona, levadura muerta como nitrógeno disponible.
 Azucares: glucosa, galactosa, maltosa, sacarosa.
 Agua destilada
Equipos:
 Matraz de 500 ml
 Fermentadores
 Vasos de 250 ml
 Tubos de ensayo de 20 ml
 Pipetas de 1 y 10 ml
 Placas Petri
 Probeta de 100 ml
 Alcoholímetro
 Termómetro
 Centrífuga
 Baño María (shaker)
 Equipo de destilación
 Balanza
 Cocina
 Mechero
 Refractómetro
 Arena bacteriológica

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3.2 Procedimiento:
a) Caracterización de levaduras:
 Preparar el medio de incubación; midiendo 110 ml de agua
destilada y agregarle 1% de peptona (1.1 gr).
 Separar 10 ml de la preparación anterior en 5 tubos de ensayo y
luego agregar a cada tubo 1% de cada tipo de azúcar; en este caso
se trabajó con cada azúcar. A uno de los tubos no se le agregara
ninguna azúcar y será considerado como blanco para hacer los
comparativos correspondientes.
 A cada tubo le será colocado tapones y será cubierto con papel
Graf la parte superior del tubo, para mantener el papel se amarrará
con pabilo de algodón.
 Llevar a esterilizar por 15 minutos, luego de ello bajar la temperatura
de los tubos a 30°C para inocular el 1% de levadura (0.1 gr) a cada
tubo.
 Luego llevar a incubación por 4 días en una estufa a 30° C.
 Luego de transcurrido los 4 días retirar de la estufa y mantener las
muestras en refrigeración.
b) Producción de Biomasa y Alcohol:
Primera parte: Sembrado
 Con el refractómetro medir los grados °Brix de la algarrobina, y según
el resultado obtenido, hacer los cálculos para estandarizar el medio
a 18 °Brix de la algarrobina en un volumen de 300 ml.
 Rectificar el pH a 4.5, de ser necesario agregar ácido cítrico para
obtener el pH deseado.
 Separar el 5 % del medio en un matraz de menor volumen para
posteriormente activar en él la levadura.
 Ambos matraces llevar a esterilización por 15 minutos.
 Se inocula 1% de levadura (3gr) en el matraz pequeño; para inocular
la levadura el medio debe estar a una temperatura de 30 °C.
Agregar la levadura activada en el primer matraz.
 Llevar a incubación a una temperatura de 30 °C por 4 días.
 Luego de transcurrido los 4 días retirar de la estufa y mantener las
muestras en refrigeración.

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Segunda parte: Obtención de Biomasa y Alcohol


 La muestra refrigerada será centrifugada por 15 minutos. Se
decantará el sobrenadante y el precipitado, para ser pesados
respectivamente y así registrar la cantidad total de biomasa que se
obtuvo al final del proceso.
 Separar 3 gr de biomasa y 3 gr de sobrenadante, colocarlos en dos
placas Petri, más 3 gr de arena bacteriológica en cada placa luego
llevarlos a estufa para obtener la cantidad de materia en base seca
de cada muestra.
 Por otro lado llevar a destilación 200 ml del sobrenadante, para
verificar con el alcoholímetro, el porcentaje de alcohol producido.

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES:

1. CARACTERIZACION DE LA LEVADURA.

1.1. Resultado visual de la producción de CO2 de las muestras

FIG.1: Muestra de azucares con su respectiva producción de CO2.


 Mayor producción: GLUCOSA
 MALTOSA
 SACAROSA
 GALACTOSA

Saccharomyces Cerevisiae: esta levadura convierte el azúcar (principalmente


la glucosa) bien el alcohol y dióxido de carbono, o bien, cuando actúa en un
medio rico en oxígeno, en dióxido de carbono y agua. Hay muchos distintos
tipos de azúcares, pero el mejor sustrato para las levaduras es la glucosa. Pero
al incorporar azúcar a la masa, estamos realmente añadiendo sacarosa, cuya
estructura es distinta, por lo que las levaduras tienen primero que transformarla
en glucosa para poder después metabolizarla en dióxido de carbono.

El desprendimiento de CO2 como desecho metabólico de la fermentación nos


ayuda de manera importante a entender el funcionamiento de este proceso
metabólico en S. cerevisiae, ya que este producto evidencia la cantidad de

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sustrato fermentado por la levadura, lo que ofrece información valiosa sobre el


alimento que favorece el crecimiento de este organismo. (PEREZ, 2007)

2. PRODUCCION DE BIOMASA Y ALCOHOL

2.1. Preparación de la algarrobina

CUADRO 1: Características de algarrobina

MUESTRA CARACTERISTICAS
 Algarrobina 77 °BRIX inicial
 Volumen total de muestra (75%) 187.5 ml

Cálculos para preparar la muestra

1: Para hallar el volumen total de la 2: Para determinar la cantidad de


muestra a preparar. En un matraz algarrobina en 16 – 20°brix.
de 250 mL.
𝑽𝟏𝑪𝟏 = 𝑽𝟐𝑪𝟐
250mL…………100%
X…………75% 𝑽𝟏(𝟕𝟕°𝑩𝒓𝒊𝒙) = 𝟏𝟖𝟕. 𝟓𝒎𝒍(𝟏𝟔°𝑩𝒓𝒊𝒙)
X=187.5Ml.
𝑽𝟏 = 𝟑𝟗𝒎𝑳. De algarrobina

 AGUA:148.5 ml.

𝑽𝟏𝑪𝟏 = 𝑽𝟐𝑪𝟐
𝑽𝟏(𝟕𝟕°𝑩𝒓𝒊𝒙) = 𝟏𝟖𝟕. 𝟓𝒎𝒍(𝟐𝟎°𝑩𝒓𝒊𝒙)
𝑽𝟏 = 𝟒𝟗 de algarrobina
 AGUA: 138.5ml.

3: Añadimos fosfato de amonio al 4:Muestra para inocular la levadura


1%.
 La adición del fosfato de 187.5……..100%
amonio no es importante. X………….5%
X=9.375 mL.preparada
187.5……………100%
X………………...1%
X=1.875 ml
5: Cantidad de levadura a 187.5………100%
incorporar. X……………3.5
X=6.56g de levadura

CUADRO 2: Obtención de muestra después de haber expuesto a diferentes


procesos.

INGRESO PROCESO SE OBTIENE

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CENTRIFUGACION 150ml (sobrenadante)


187.5ml

187.5ml…………100%
RENDIMIENTO TOTAL DE 150ml……………X
MUESTRA X=80%
Al obtener el sobrenadante se tiene que él % de
rendimiento es el 80%.

150ml DESTILACION 120ml (alcohol)


150ml…………….100%
RENDIMIENTO DE LA 120ml……………..X
MUESTRA X=80%
SOBRENADANTE El rendimiento en la obtencion de alcohol es de
80%.

El principio de la destilación se basa en las diferencias que existen entre los


puntos de fusión y el alcohol.

Una vez que la biomasa conteniendo hidratos de carbono se ha transformado


en una solución azucarada se puede someter esta a un proceso de
fermentación con objeto de convertir los azúcares en etanol. Apreciándolo en
la siguiente reacción:

C6H12O6 --------> 2 CH3-CH2-OH + 2 CO2 + Calor

Según esta reacción, de 100 kg de glucosa se obtienen 51,1 kg de etanol y


48,9 kg de dióxido de carbono. (CABELLO, 2005)

En la práctica, el rendimiento real en etanol es menor que el valor teórico, ya


que aproximadamente un 5% de glucosa es utilizado por el microorganismo
para producir nuevas células y otros productos de su metabolismo.

En la acción de las levaduras influye una gran cantidad de factores, entre los
que destaca la temperatura, el pH y la concentración de azúcares. En nuestra
muestra tuvimos gran concentración de azucares, PH ideal para nuestra
levadura y temperatura ideal, motivo por el cual obtuvimos buen rendimiento.

Se obtuvo un rendimiento para la muestra y el sobrenadante la cual dio como


resultado un 80 % lo que significa que se tuvo mucho cuidado durante su
procesamiento tanto para el proceso de destilación como en el sobrenadante
luego de realizar la centrifugación.

2.2. Obtención de biomasa y alcohol.

CUADRO 3: Obtención de BIOMASA


CARCTERISTICAS PESO
 Peso de la placa 43.58g

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BIOTECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

 Peso de placa + Biomasa 49.58g


(Pmuestra, 3gr) + Arena = Pi
 Peso final total (Pf) 48.28g
 Peso en base seca de biomasa 1.3g

Para la determinación de humedad tenemos:

𝑷𝒊 − 𝑷𝒇
%𝑯 = × 𝟏𝟎𝟎%
𝑷𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂
𝟒𝟗. 𝟓𝟖 − 𝟒𝟖. 𝟐𝟖
%𝑯𝒃𝒔 = × 𝟏𝟎𝟎% = 𝟒𝟑. 𝟑𝟑%
𝟑

Para la determinación de la masa seca tenemos:

%𝑴𝒔 = 𝟏𝟎𝟎% − %𝑯

%𝑴𝒔 = 𝟏𝟎𝟎% − 𝟒𝟑. 𝟑𝟑% = 𝟓𝟔. 𝟓𝟕%

Para la determinacion de Biomasa (gr/L):

56.57gr --- 100gr

X gr --- 12.88 gr

X = 7.2862 gr de biomasa

Biomasa:

7.2862gr/187.5ml= 0.03886 gr/ml * 1000ml/L = 38.86 gr/L

CUADRO 4: Obtención de ALCOHOL


CARCTERISTICAS PESO
 Obtención de alcohol 120ml
 Grado alcohólico de la muestra 11.5 cc

Para poder medir los grados alcohólicos de la muestra se enrasaron a 200ml


con agua, por lo que el resultado se debe corregir.

Para corregir la concentración del alcohol:

V1*C1 = V2*C2

(200)*(11.5) = (120)*(C2)

C2= 19.17 gr/100ml

* 1000ml/L = 191.70 gr/L

Despues de realizar la correcion podemos observar que nuestra concentracion


aumentó

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BIOTECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

V. CONCLUSIONES:

 Se pudo observar el funcionamiento del proceso metabólico de cada


azúcar, según la producción de CO2.
 Se determinó la producción de biomasa por la levadura Saccharomyces
Cerevisiae.
 Se pudo cuantificar la producción de biomasa y sobrenadante obtenidos
durante el proceso.

VI. ANEXOS:

a) MATERIALES:

Fig 1. Levadura Fig 2. Algarrobina Fig 3. Agua destilada

Fig. 4 Arena tratada Fig 5. Azucares Fig 6. Fosfato de


amonio

b) PROCEDIMIENTO

1. Caracterización del sustrato: Medición de los grados Brix: Se procederá a


hacer la medición de los grados Brix con ayuda del refractómetro.

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BIOTECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

Fig 7. Algarrobina

2. Caracterización de la levadura: Determinación de la capacidad


fermentativa de la levadura: se realizara una determinación visual,
colocándose 20ml de caldos nutritivos (suspensiones de los azúcares a
probar: 1% azúcar ,1 %g peptona en agua destilada), se inoculará la
levadura bajo condiciones asépticas. Los tubos serán incubados a 30°C
por 2 a 4 días, pasados este tiempo se notará que ciertos tubos presentan
formación de gas, ello indicara que dichos azúcares son fermentados por
la levadura en estudio.

Fig 8. Preparación para la inoculación de las levaduras.

3. Producción de biomasa y alcohol:

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BIOTECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

Fig.9 Pesaje de algarrobina Fig.10 Agua adicionada

Fig.12 Mezcla final


Fig.11 Coreccion de Ph

VII. BIBLIOGRAFIA:

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BIOTECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

 Almazán, O.A. Historia de la levaduras en: (M.A. Otero, J.R.


Wagner, I. Guerrero Legarreta, eds) Las levaduras y sus productos
derivados como ingredientes en la industria de alimentos".
Nacional de Quilmes, Serie Nuevos Enfoques en Ciencia y
Tecnología ISBN 978-987-558-156-2. (2008).
 Cabello, A. Las Levaduras como alimento animal. En: Las
levaduras. Realidad y potencialidades (Otero, M.A ed) pp. 99-113.
http//www.undp.org. (2005).
 Pérez, H. Evaluación y selección de cepas de levaduras con
características probióticas para uso como aditivo alimentario. Tesis
presentada en opción del Título Académico de Maestro en
Ciencias Microbiológicas Mención en Fermentaciones. La
Habana. (2007).

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