Contenido

I. Marco teórico. .............................................................................................................................................................. 2

Importancia biotecnológica ......................................................................................................................................... 2
Justificación de la clonación y expresión .................................................................................................................... 3
Acerca del gen............................................................................................................................................................. 4
Ubicación en el genoma .......................................................................................................................................... 4
Secuencia................................................................................................................................................................ 4
II. Diseño de los Primer para amplificación .................................................................................................................... 7
Procedimiento ............................................................................................................................................................. 7
Resultados de los primer ............................................................................................................................................ 8
Resultado final .......................................................................................................................................................... 30
III. Análisis filogenético ................................................................................................................................................. 31
Proteínas semejantes ............................................................................................................................................... 31
Alineamiento ............................................................................................................................................................. 34
Árboles filogenéticos ................................................................................................................................................. 35
IV. Estrategias de clonación y expresión....................................................................................................................... 39
Sitios de restricción................................................................................................................................................... 39
Vector de expresión .................................................................................................................................................. 41
Inserción del gen de interés en el vector .............................................................................................................. 41
Clonación .................................................................................................................................................................. 42
Expresión .................................................................................................................................................................. 43
Estrategia de expresión......................................................................................................................................... 43
V. Estructura de la proteína .......................................................................................................................................... 43
Estructura 3D ............................................................................................................................................................ 46
VI. Referencias .............................................................................................................................................................. 47

1
Expresión de la hemaglutinina del virus de la
influenza A/Puerto Rico/8/1934(H1N1) para
creación de vacunas recombinantes
I. Marco teórico.
La hemaglutinina (HA) es una glicoproteína de membrana presente en el virus de la influenza A. Se le llama así debido
a su capacidad para aglutinar eritrocitos. Esta es la responsable de la unión del virus con la célula que va a ser
infectada. El procedimiento comienza cuando la HA se une al ácido siálico, monosacárido que se encuentra en la
superficie de la célula hospedera. Luego, la célula hospedera endocita al virus con su membrana, formando la
endosoma. Este se transforma en lisosoma al disminuir su pH para digerir al virus. Posteriormente, al bajar a un pH
de 6, la HA cambia su conformación, dejando expuesta una porción muy hidrofóbica (a esto se le llama péptido de
fusión), que se inserta en la membrana endosomal como si fuera un gancho. Finalmente, la HA cambia su
conformación otra vez, provoca la fusión de la membrana del virus con la de la endosoma y el RNA del genoma viral
entra en el citoplasma de la célula.
Esta proteína es el antígeno que es reconocido por el sistema inmune de los organismos infectados y que puede
generar una respuesta inmunitaria como la producción de anticuerpos específicos, y así, neutralizar los efectos del
virus. Por lo tanto, su importancia recae en la posibilidad de la producción de vacunas recombinantes. Este tipo de
vacunas suelen tener la ventaja de que se producen en un período de tiempo más corto debido a que no están
limitadas por la selección de virus de vacuna que estén adaptados para el crecimiento en huevos o el desarrollo de
estos en células, sino que se produce el antígeno de manera directa [1].
El virus de la influenza A presenta su genoma segmentado para facilitar la variabilidad de su material genético. Esto
se debe a las mutaciones y recombinaciones genéticas, sobre todo cuando este pasa de una especie animal a otra,
generando nuevos subtipos virales. Los cambios más importantes se dan en nuestra glicoproteína de interés (HA) [2].
El genoma está dividido en 8 segmentos de RNA que codifican para proteínas diferentes. Entre ellas se encuentran
proteínas que no son estructurales y proteínas transmembranales (M2, hemaglutinina y neuraminidasa). Este RNA
es, además, de cadena sencilla y se encuentra empaquetado por una nucleoproteína (NP).
Los diferentes segmentos poseen polaridad negativa, por lo que no funcionan como mRNA y requieren de la RNA
polimerasa para su replicación a RNA de polaridad positiva. Estos fragmentos varían en tamaño de 890 a 2341
nucleótidos.

Importancia biotecnológica
A lo largo de la historia se han registrado diversas pandemias provocadas por el virus de la influenza A. Estas tuvieron
una mortalidad elevada en sus primeras apariciones y en la actualidad continúan impactando de manera significativa
en la salud y en la economía [1]. Por ello, es importante el desarrollo de vacunas que nos permitan enfrentar las
infecciones de este tipo de virus.
Si bien ya existen vacunas de este tipo, la mayoría son del tipo LAIV (vacunas contra influenza con virus vivos
atenuados) y IIV (vacunas contra influenza con virus inactivados). Estas también son llamadas como vacunas contra
influenza dependientes de crecimiento en células o huevos, debido a que para su producción se requiere del
crecimiento de virus en huevos de gallina o en células de mamíferos. El proceso de producción de estas lleva muchos
pasos, por lo que actualmente también existen las RIV (vacunas recombinantes) que son mucho más rápidas, al no
estar limitadas por la selección de virus para las vacunas que se hayan adaptado al crecimiento en huevos [2].

2
Justificación de la clonación y expresión
La proteína que se presenta en este trabajo es la hemaglutinina H1 que fue aislada en un paciente infectado con
virus de la influenza A en Puerto Rico en 1934.
Si bien en cada temporada de influenza se cambian los serotipos usados, la H1N1 debe estar presente en los shots
de vacunas.
Esta se clonará en Escherichia coli y se expresará en la levadura Pichia pastoris metilotrófica debido a que presenta
glicosilaciones y ciertas modificaciones pos-traducción.
La HA es sintetizada como un zimógeno HA0 de alrededor de 75 kDa en el retículo endoplasmático, asociado en homo
trímeros con uniones no covalentes. Luego es transportado a la superficie celular a través del aparato de Golgi.
Este zimógeno se activa luego de la traducción por actividad proteolítica por una exopeptidasa que corta en la región
del péptido señal y forma dos cadenas, la HA1 de alrededor de 329 aminoácidos (a.a.) y la HA2 de alrededor de 221
a.a. Estos polipéptidos se unen entre sí por un puente disulfuro y otros inter catenarios. El monómero HA tiene un
tallo constituido principalmente por el HA2. Y el HA1 es la parte de unión al receptor y es el objetivo principal de la
respuesta inmune.
P. pastoris es la levadura más usada para expresión de proteínas heterólogas actualmente. Esto se debe,
principalmente, a que posee un promotor fuerte y regulado correspondiente al gen del alcohol oxidasa 1 y a que su
metabolismo preferentemente respiratorio le permite alcanzar elevadas densidades celulares en biorreactores sin
que los productos del metabolismo como el etanol inhiban su crecimiento. Además de esto, su manipulación genética
es similar a la que tiene la levadura Saccharomyces cerevisiae, es capaz de realizar el plegamiento correcto de
proteínas y de generar las modificaciones pos-traduccionales de manera semejante a las células de organismos
superiores [3].
Hay que tomar en cuenta que cuando las células son cultivadas con elevadas concentraciones de metanol y oxígeno,
esto produce acumulación de formaldehído. Este en elevadas concentraciones resulta tóxico para las células e inhibe
su crecimiento. Por lo tanto, se debe controlar adecuadamente la concentración de metanol durante la etapa de
inducción para tener éxito en la producción de nuestra proteína.

3
Acerca del gen
Ubicación en el genoma
El segmento 4 es el que codifica para la hemaglutinina que es llamada así por su capacidad de aglutinar eritrocitos.
Este segmento es de aproximadamente 1765 nucleótidos y codifica para una región de 1698 nucleótidos (566 a.a.).
Por lo tanto, el gen de esta proteína se encuentra separado del resto en este segmento.
Como ya se mencionó, el genoma del virus de la influenza se encuentra en forma de RNA de polaridad negativa, por
lo que se debe sintetizar RNA de polaridad positiva con una RNA polimerasa, y así este pueda funcionar como mRNA
[4].

Figur a 1. Segm entos del gen oma en el vi rus de la i nfluen za A y l as prot eínas par a l as que codi fic an.

Figur a 2. Segmento 4 del genom a del virus de l a i nfl ue nza A/P uerto Rico /8/1934( H1N1 ) comp leto. En color c afé se sep aran
las secuen ci as q ue cor respo nden a las cade nas HA 1 ( de l l ado i zqui erdo ) y HA 2 (del lado derecho) . El fr agm ent o p equeño en
color negro rep resent a al pé pt ido señal.

Secuencia
La secuencia se buscó en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) introduciendo en el buscador
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)) e indicando que se quiere obtener genes como resultados.

4
Obteniendo los resultados siguientes:

El gen que buscamos es la segunda opción que dice haemagglutinin [Influenza A virus (A/Puerto
Rico/8/1934(H1N1))].
Se obtuvieron los documentos FASTA y GenBank del mismo.
>gi|8486125|ref|NC_002017.1|:33-1733 Influenza A virus (A/Puerto
Rico/8/1934(H1N1))
ATGAAGGCAAACCTACTGGTCCTGTTATGTGCACTTGCAGCTGCAGATGCAGACACAATATGTATAGGCT
ACCATGCGAACAATTCAACCGACACTGTTGACACAGTGCTCGAGAAGAATGTGACAGTGACACACTCTGT
TAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGAAAACTATGTAGATTAAAAGGAATAGCCCCACTACAATTGGGG
AAATGTAACATCGCCGGATGGCTCTTGGGAAACCCAGAATGCGACCCACTGCTTCCAGTGAGATCATGGT
CCTACATTGTAGAAACACCAAACTCTGAGAATGGAATATGTTATCCAGGAGATTTCATCGACTATGAGGA
GCTGAGGGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTCGAAAGATTCGAAATATTTCCCAAAGAAAGCTCATGG
CCCAACCACAACACAACCAAAGGAGTAACGGCAGCATGCTCCCATGCGGGGAAAAGCAGTTTTTACAGAA
ATTTGCTATGGCTGACGGAGAAGGAGGGCTCATACCCAAAGCTGAAAAATTCTTATGTGAACAAGAAAGG
GAAAGAAGTCCTTGTACTGTGGGGTATTCATCACCCGTCTAACAGTAAGGATCAACAGAATATCTATCAG
AATGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGTGACTTCAAATTATAACAGGAGATTTACCCCGGAAATAGCAGAAA
GACCCAAAGTAAGAGATCAAGCTGGGAGGATGAACTATTACTGGACCTTGCTAAAACCCGGAGACACAAT
AATATTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCACCAAGGTATGCTTTCGCACTGAGTAGAGGCTTTGGGTCC
GGCATCATCACCTCAAACGCATCAATGCATGAGTGTAACACGAAGTGTCAAACACCCCTGGGAGCTATAA
ACAGCAGTCTCCCTTTCCAGAATATACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGCCCAAAATACGTCAGGAGTGC
CAAATTGAGGATGGTTACAGGACTAAGGAACATTCCGTCCATTCAATCCAGAGGTCTATTTGGAGCCATT
GCCGGTTTTATTGAAGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGGATGGTACGGTTATCATCATCAGAATGAAC
AGGGATCAGGCTATGCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGGGATTACAAACAAGGTGAA
CTCTGTTATCGAGAAAATGAACATTCAATTCACAGCTGTGGGTAAAGAATTCAACAAATTAGAAAAAAGG
ATGGAAAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGATTTCTGGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTAG
TTCTACTGGAAAATGAAAGGACTCTGGATTTCCATGACTCAAATGTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTAAA
AAGCCAATTAAAGAATAATGCCAAAGAAATCGGAAATGGATGTTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAAT
GAATGCATGGAAAGTGTAAGAAATGGGACTTATGATTATCCCAAATATTCAGAAGAGTCAAAGTTGAACA
GGGAAAAGGTAGATGTGATGAGTGAAATTGGAATCAATGGGGATCTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAA
CTGTCGCCAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGTTCTAATGGATC
TTTGCAGTGCAGAATATGCATCTGA
Figur a 3. Se cuen cia de cDN A obt enida del do cumento FASTA del gen de l a HA en N CBI. En amaril l o se muestra l a secuencia
codifi cante del cod ón de i ni cio y e n verde l a del co dón de paro.

LOCUS NC_002017 1701 bp cRNA linear VRL 13-AUG-2018

DEFINITION Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)) segment 4, complete
sequence.
ACCESSION NC_002017 REGION: 33..1733
VERSION NC_002017.1 GI:8486125
DBLINK BioProject: PRJNA485481
KEYWORDS RefSeq.
SOURCE Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/1934(H1N1))
ORGANISM Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/1934(H1N1))
Viruses; ssRNA viruses; ssRNA negative-strand viruses;
Orthomyxoviridae; Alphainfluenzavirus.
REFERENCE 1 (bases 1 to 1701)
AUTHORS Winter,G., Fields,S. and Brownlee,G.G.

5
 TITLE Nucleotide sequence of the haemagglutinin gene of a human influenza
virus H1 subtype
JOURNAL Nature 292 (5818), 72-75 (1981)
PUBMED 7278968
REFERENCE 2 (bases 1 to 1701)
CONSRTM NCBI Genome Project
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (12-JUN-2000) National Center for Biotechnology
Information, NIH, Bethesda, MD 20894, USA
COMMENT REVIEWED REFSEQ: This record has been curated by NCBI staff. The
reference sequence was derived from V01088.
COMPLETENESS: full length.
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..1701
/organism="Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/1934(H1N1))"
/mol_type="viral cRNA"
/strain="A/Puerto Rico/8/1934"
/serotype="H1N1"
/db_xref="taxon:211044"
/segment="4"
/country="Puerto Rico"
/collection_date="1934"
gene 1..1701
/gene="HA"
/locus_tag="FLUAVs4gp1"
/db_xref="GeneID:956529"
CDS 1..1701
/gene="HA"
/locus_tag="FLUAVs4gp1"
/function="receptor binding and fusion protein"
/codon_start=1
/product="haemagglutinin"
/protein_id="NP_040980.1"
/db_xref="GI:8486126"
/db_xref="GOA:P03452"
/db_xref="UniProtKB/Swiss-Prot:P03452"
/db_xref="GeneID:956529"
/translation="MKANLLVLLCALAAADADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVT
HSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNS
ENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTTKGVTAACSHAGKSS
FYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPSNSKDQQNIYQNENAYVSV
VTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPRYAFALSR
GFGSGIITSNASMHECNTKCQTPLGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTG
LRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGI
TNKVNSVIEKMNIQFTAVGKEFNKLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENER
TLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPKYSE
ESKLNREKVDGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
"
sig_peptide 1..51
/gene="HA"
/locus_tag="FLUAVs4gp1"
mat_peptide 52..1032
/gene="HA"
/locus_tag="FLUAVs4gp1"
/product="HA1"
/protein_id="YP_163735.1"
/db_xref="GI:56605625"
mat_peptide 1033..1698
/gene="HA"
/locus_tag="FLUAVs4gp1"
/product="HA2"
/protein_id="YP_163736.1"
/db_xref="GI:56605626"
ORIGIN
1 atgaaggcaa acctactggt cctgttatgt gcacttgcag ctgcagatgc agacacaata
61 tgtataggct accatgcgaa caattcaacc gacactgttg acacagtgct cgagaagaat
121 gtgacagtga cacactctgt taacctgctc gaagacagcc acaacggaaa actatgtaga
181 ttaaaaggaa tagccccact acaattgggg aaatgtaaca tcgccggatg gctcttggga
241 aacccagaat gcgacccact gcttccagtg agatcatggt cctacattgt agaaacacca

6
 301 aactctgaga atggaatatg ttatccagga gatttcatcg actatgagga gctgagggag
361 caattgagct cagtgtcatc attcgaaaga ttcgaaatat ttcccaaaga aagctcatgg
421 cccaaccaca acacaaccaa aggagtaacg gcagcatgct cccatgcggg gaaaagcagt
481 ttttacagaa atttgctatg gctgacggag aaggagggct catacccaaa gctgaaaaat
541 tcttatgtga acaagaaagg gaaagaagtc cttgtactgt ggggtattca tcacccgtct
601 aacagtaagg atcaacagaa tatctatcag aatgaaaatg cttatgtctc tgtagtgact
661 tcaaattata acaggagatt taccccggaa atagcagaaa gacccaaagt aagagatcaa
721 gctgggagga tgaactatta ctggaccttg ctaaaacccg gagacacaat aatatttgag
781 gcaaatggaa atctaatagc accaaggtat gctttcgcac tgagtagagg ctttgggtcc
841 ggcatcatca cctcaaacgc atcaatgcat gagtgtaaca cgaagtgtca aacacccctg
901 ggagctataa acagcagtct ccctttccag aatatacacc cagtcacaat aggagagtgc
961 ccaaaatacg tcaggagtgc caaattgagg atggttacag gactaaggaa cattccgtcc
1021 attcaatcca gaggtctatt tggagccatt gccggtttta ttgaaggggg atggactgga
1081 atgatagatg gatggtacgg ttatcatcat cagaatgaac agggatcagg ctatgcagcg
1141 gatcaaaaaa gcacacaaaa tgccattaac gggattacaa acaaggtgaa ctctgttatc
1201 gagaaaatga acattcaatt cacagctgtg ggtaaagaat tcaacaaatt agaaaaaagg
1261 atggaaaatt taaataaaaa agttgatgat ggatttctgg acatttggac atataatgca
1321 gaattgttag ttctactgga aaatgaaagg actctggatt tccatgactc aaatgtgaag
1381 aatctgtatg agaaagtaaa aagccaatta aagaataatg ccaaagaaat cggaaatgga
1441 tgttttgagt tctaccacaa gtgtgacaat gaatgcatgg aaagtgtaag aaatgggact
1501 tatgattatc ccaaatattc agaagagtca aagttgaaca gggaaaaggt agatggagtg
1561 aaattggaat caatggggat ctatcagatt ctggcgatct actcaactgt cgccagttca
1621 ctggtgcttt tggtctccct gggggcaatc agtttctgga tgtgttctaa tggatctttg
1681 cagtgcagaa tatgcatctg a
//

Figur a 4. Informaci ón obtenida del docum ent o Gen Ba nk de la HA en NCBI. En turq uesa se resalt an los a.a. del pépt i do
señal , en ros a los de la cade na HA 1 y e n rojo los de l a HA 2 .

La secuencia que se viene en estos archivos es del cDNA al RNA de polaridad negativa, por lo que contiene la
información que contendría el mRNA, pero en forma de DNA (timina en vez de uracilo).

II. Diseño de los Primer para amplificación

Procedimiento
El diseño de los primer se hizo por medio de Primer-Blast del NCBI. Se realizaron utilizando el segmento 4 del genoma
viral completo. Este se buscó en el NCBI, ya que la secuencia mostrada en las Figuras 3 y 4 solo contienen la
codificante de la proteína y no el resto de las secuencias aledañas dentro del segmento 4.
>gi|145322852|gb|EF190982.1|:1-1775 Influenza A virus (A/lvPR8/34(H1N1)) segment
4, complete sequence
AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAACCAAAATGAAGGCAAACCTACTGGTCCTGTTATGTGCACTTGCAGCTGCAGAT
GCAGACACAATATGTATAGGCTACCATGCGAACAATTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTCGAGAAGAATGTGACAGT
GACACACTCTGTTAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGAAAACTATGTAGATTAAAAGGAATAGCCCCACTACAATTGG
GGAAATGTAACATCGCCGGATGGCTCTTGGGAAACCCAGAATGCGACCCACTGCTTCCAGTGAGATCATGGTCCTACATT
GTAGAAACACCAAACTCTGAGAATGGAATATGTTATCCAGGAGATTTCATCGACTATGAGGAGCTGAGGGAGCAATTGAG
CTCAGTGTCATCATTCGAAAGATTCGAAATATTTCCCAAAGAAAGCTCATGGCCCAACCACAACACAAACGGAGTAACGG
CAGCATGCTCCCATGAGGGGAAAAGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTATGGCTGACGGAGAAGGAGGGCTCATACCCAAAG
CTGAAAAATTCTTATGTGAACAAAAAAGGGAAAGAAGTCCTTGTACTGTGGGGTATTCATCACCCGCCTAACAGTAAGGA
ACAACAGAATCTCTATCAGAATGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGTGACTTCAAATTATAACAGGAGATTTACCCCGGAAA
TAGCAGAAAGACCCAAAGTAAGAGATCAAGCTGGGAGGATGAACTATTACTGGACCTTGCTAAAACCCGGAGACACAATA
ATATTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCACCAATGTATGCTTTCGCACTGAGTAGAGGCTTTGGGTCCGGCATCATCAC
CTCAAACGCATCAATGCATGAGTGTAACACGAAGTGTCAAACACCCCTGGGAGCTATAAACAGCAGTCTCCCTTACCAGA
ATATACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGCCCAAAATACGTCAGGAGTGCCAAATTGAGGATGGTTACAGGACTAAGGAAC
ATTCCGTCCATTCAATACAGAGGTCTATTTGGAGCCATTGCCGGTTTTATTGAAGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGG
ATGGTATGGTTATCATCATCAGAATGAACAGGGATCAGGCTATGCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACG
GGATTACAAACAAGGTGAACACTGTTATCGAGAAAATGAACATTCAATTCACAGCTGTGGGTAAAGAATTCAACAAATTA
GAAAAAAGGATGGAAAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGATTTCTGGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTAGT
TCTACTGGAAAATGAAAGGACTCTGGATTTCCATGACTCAAATGTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTAAAAAGCCAATTAA
AGAATAATGCCAAAGAAATCGGAAATGGATGTTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAATGAATGCATGGAAAGTGTAAGA

7
 AATGGGACTTATGATTATCCCAAATATTCAGAAGAGTCAAAGTTGAACAGGGAAAAGGTAGATGGAGTGAAATTGGAATC
AATGGGGATCTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAACTGTCGCCAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCA
GTTTCTGGATGTGTTCTAATGGATCTTTGCAGTGCAGAATATGCATCTGAGATTAGAATTTCAGAGATATGAGGAAAAAC
ACCCTTGTTTCTACT
Figur a 5. Secuenci a de cDN A obtenida del do cument o FASTA del segmento 4 del ge noma viral compl et o. En am aril lo se
muest ra la secuen cia co dif i cante p ara el co dón de ini cio y en verde l a del codó n de paro.

El diseño se realizó ingresando los datos que se ven en la imagen anterior. Como en esta página no nos permitió
hacer el BLAST usando al virus, entonces se procedió a realizarlo por separado para cada primer.

Resultados de los primer

Se obtuvieron diez pares de primer posibles para amplificar nuestra secuencia que codifica para la HA:

8
Figur a 6. Pares de primer o bt eni dos co n Primer- Bl ast c on su l ongi tu d, lug ar de ini c io, de t erm ina ció n, t emperat ura de fusió n
(Tm), p or cent aje de GC, aut o complementariedad y l ongi t ud del producto de PCR q ue se obt endría al usarl os.

La imagen anterior nos muestra un ejemplo de cómo se hizo el BLAST para cada una de las secuencias de los
primer forward de cada par. Siendo el ejemplo del primer forward del par 1.

9
Y esta imagen anterior nos muestra un ejemplo de cómo se introdujeron en el BLAST las secuencias de los primer
reverse. Siendo el ejemplo del primer reverse del par 1.

Par de primer 1

Primer Forward
Se obtuvieron los siguientes resultados para el segmento 4 del genoma:

10
Se obtuvieron los siguientes resultados para cada segmento del genoma del virus:

11
12
Como podemos ver en este solo hay coincidencias dentro de los demás segmentos del genoma no mayor a un 39%
(9 nucleótidos de 23 del primer), sin contar el correspondiente al primer dentro del segmento 4.

Primer Reverse
Se obtuvieron los siguientes resultados para el segmento 4 del genoma:

13
Se obtuvieron los siguientes resultados para cada segmento del genoma:

14
15
Como podemos ver en este hay coincidencias dentro del segmento 8 y 5 de un 78%.

Par de primer 2

Primer forward
Se obtuvieron los siguientes resultados para el segmento 4 del genoma:

16
Se obtuvieron los siguientes resultados para el resto de los segmentos del genoma:

17
18
En este obtenemos no más de un 39% de semejanza con los demás segmentos del genoma.

Primer Reverse
Se obtuvieron los siguientes resultados para el segmento 4:

19
Se obtuvieron los siguientes resultados para los demás segmentos del genoma:

20
En este obtuvimos una semejanza de un 73% para el fragmento 8 y 5.

21
Par de primer 3

Primer Forward
Se obtuvieron los siguientes resultados para el segmento 4:

22
Para el resto de los segmentos:

23
24
En los segmentos 8 y 5 tenemos un 56% de semejanza con otras secuencias.

Primer Reverse
Resultados para el segmento 4:

25
Para el resto de los segmentos:

26
En este también obtenemos un alto porcentaje de semejanza en los segmentos 8 y 5.
Como el resto de las secuencias de los demás pares de primer son muy parecidas a las de los primeros tres pares y
no se alejan demasiado de la misma secuencia, podemos suponer que no se obtendrán mejores resultados de
especificidad. Por lo tanto, entre los tres pares evaluados tomaremos el par 2, debido a que posee una menor
semejanza en comparación a los otros pares.

27
Sonda
Resultado en Primer 3:

Resultado de BLAST para cada segmento del genoma:

28
Para la sonda ninguna de las secuencias sobrepasa un 35% de semejanza dentro de las secuencias de los segmentos
del genoma viral, por lo que es suficientemente específica.

29
Resultado final
AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAACCAAAATGAAGGCAAACCTACTGGTCCTGTTATGTGCACTTGCAGCTGCAGAT
GCAGACACAATATGTATAGGCTACCATGCGAACAATTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTCGAGAAGAATGTGACAGT
GACACACTCTGTTAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGAAAACTATGTAGATTAAAAGGAATAGCCCCACTACAATTGG
GGAAATGTAACATCGCCGGATGGCTCTTGGGAAACCCAGAATGCGACCCACTGCTTCCAGTGAGATCATGGTCCTACATT
GTAGAAACACCAAACTCTGAGAATGGAATATGTTATCCAGGAGATTTCATCGACTATGAGGAGCTGAGGGAGCAATTGAG
CTCAGTGTCATCATTCGAAAGATTCGAAATATTTCCCAAAGAAAGCTCATGGCCCAACCACAACACAAACGGAGTAACGG
CAGCATGCTCCCATGAGGGGAAAAGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTATGGCTGACGGAGAAGGAGGGCTCATACCCAAAG
CTGAAAAATTCTTATGTGAACAAAAAAGGGAAAGAAGTCCTTGTACTGTGGGGTATTCATCACCCGCCTAACAGTAAGGA
ACAACAGAATCTCTATCAGAATGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGTGACTTCAAATTATAACAGGAGATTTACCCCGGAAA
TAGCAGAAAGACCCAAAGTAAGAGATCAAGCTGGGAGGATGAACTATTACTGGACCTTGCTAAAACCCGGAGACACAATA
ATATTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCACCAATGTATGCTTTCGCACTGAGTAGAGGCTTTGGGTCCGGCATCATCAC
CTCAAACGCATCAATGCATGAGTGTAACACGAAGTGTCAAACACCCCTGGGAGCTATAAACAGCAGTCTCCCTTACCAGA
ATATACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGCCCAAAATACGTCAGGAGTGCCAAATTGAGGATGGTTACAGGACTAAGGAAC
ATTCCGTCCATTCAATACAGAGGTCTATTTGGAGCCATTGCCGGTTTTATTGAAGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGG
ATGGTATGGTTATCATCATCAGAATGAACAGGGATCAGGCTATGCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACG
GGATTACAAACAAGGTGAACACTGTTATCGAGAAAATGAACATTCAATTCACAGCTGTGGGTAAAGAATTCAACAAATTA
GAAAAAAGGATGGAAAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGATTTCTGGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTAGT
TCTACTGGAAAATGAAAGGACTCTGGATTTCCATGACTCAAATGTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTAAAAAGCCAATTAA
AGAATAATGCCAAAGAAATCGGAAATGGATGTTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAATGAATGCATGGAAAGTGTAAGA
AATGGGACTTATGATTATCCCAAATATTCAGAAGAGTCAAAGTTGAACAGGGAAAAGGTAGATGGAGTGAAATTGGAATC
AATGGGGATCTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAACTGTCGCCAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCA
GTTTCTGGATGTGTTCTAATGGATCTTTGCAGTGCAGAATATGCATCTGAGATTAGAATTTCAGAGATATGAGGAAAAAC
ACCCTTGTTTCTACT
Figur a 7 . Representació n de la secuen cia com pl eta del segment o 4 del genom a del vi rus co n los pri mer y sonda. En color
turquesa y m orado se muestran el primer for war d y reverse, resp ect ivam ent e, y en col or roj o, l a sonda.

Tabla 1. Características del par de primer elegido y de la sonda.

Sonda AAGGGGGATGGACTGGAATG 20 1093 1113 60.02 55.00 0.00

30
III. Análisis filogenético
Este se realizará tanto para el gen como para las proteínas.
Nos servirá para representar y analizar las relaciones evolutivas entre nuestro virus y sus serotipos sin dejar de olvidar
que los árboles filogenéticos son solo hipótesis y no hechos definitivos.
Proteínas semejantes
Utilizando BLAST se obtuvieron diferentes serotipos de la proteína HA.
Tabla 2. Secuencias de los genes de HA de los serotipos de Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/1936(H1N1)).
Serotipo
Influenza A virus
(A/Henry/1936(H1N1))
Influenza A virus
(A/AA/Huston/1945(H1N1))
Secuencia FASTA del gen
>gi|133754131|gb|CY020445.1|:1-1733 Influenza A virus
(A/Henry/1936(H1N1)) segment 4, complete sequence
AACAACCAAAATGAAGGCAAGACTACTGGTCCTGTTATGTGCACTTGCAGCTACAGATGCAGACACAATA
TGTATAGGCTACCATGCGAACAATTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTCGAGAAGAATGTGACAGTGA
CACACTCTGTTAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGGAAATTATGTAGATTAAAAGGAATAGCCCCACT
ACAATTGGGGAAATGTAACATCGCCGGATGGCTCTTGGGAAACCCAGAATGCGACCCACTGCTTCCAGCG
AGATCATGGTCCTACATTGTAGAAACACCAAACTCTGAGAATGGAATATGTTATCCAGGAGCTTTCATCG
ACTATGAGGAACTGAGGGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTCGAAAGATTCGAAATATTTCCCAAAGA
AAGCTCATGGCCCAACCACAACACAAACATAGGAGTAACGGCAGCATGCTCCCATGCGGGGAAAAGCAGT
TTTTACAGAAATTTGCTATGGCTGACGAAGAAGGGGGGCTCATACCCAAAGCTGAAAAATTCCTATGTGA
ACAAAAAAGGGAAAGAAGTCCTTGTACTATGGGGTATTCATCACCCGTCTAACAGTAAGGATCAACAGAC
TCTCTATCAGAATGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGTGTCTTCAAATTATAACAGGAGATTCACCCCGGAA
ATAGCAGAAAGACCCGAAGTAAGAGATCAAGCTGGGAGGATGAACTATTACTGGACCTTGCTAGAACCCG
GAGACACAATAATGTTTGAGGCAAATGGAAATCTGGTAGCACCATGGTATGCTTTCGCACTGAGTAGAGG
CTTTGGGTCCGGCATCATCACCTCAAACGCATCAATGCATGAGTGTAACACGAAGTGTCAAACACCCCAG
GGAGCTATAAACAGCAGTCTCCCTTTCCAGAATATACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGCCCAAAATACG
TCAGGAGTGCCAAATTGAGGATGGTTACAGGACTAAGGAACATCCCGTCCATTCAATCCAGAGGTCTATT
TGGAGCCATTGCCGGTTTTATTGAAGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGGATGGTATGGTTATCATCAT
CAGAATGAACAGGGATCAGGCTATGCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGGGATTACAA
ACAAGGTGAACTCTGTTATCGAGAAAATGAACACTCAATTCACAGCTGTGGGTAAAGAATTCAACAACTT
AGAAAAAAGGATGGAAAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGATTTCTGGACATTTGGACATATAATGCA
GAATTGTTAGTTCTACTGGAAAATGAAAGGACTCTGGATTTCCATGACTCAAATGTGAAGAATCTGTATG
AGAAAGTAAAAAGCCAATTAAAGAATAATGCCAAAGAAATCGGAAATGGATGTTTTGAGTTCTACCACAA
GTGTGACAATGAATGCATGGAAAGTGTAAGAAATGGGACTTATGATTATCCCAAATATTCAGAAGAGTCA
AAATTGAACAGGGAAAAGATAGATGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGGGTCTATCAGATTCTGGCGATCT
ACTCAACTGTCGCCAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGTTCTAA
TGGATCTTTGCAGTGCAGAATATGCATCTGAGATTAGAATTTCAGAAATATAA
>gi|145278809|gb|CY021709.1|:1-1751 Influenza A virus
(A/AA/Huston/1945(H1N1)) segment 4, complete sequence
AAAATAAAAACAACCAAAATGAAGGCAAGACTACTGGTCCTGTTATGTGCACTTGCAGCTACAGATGCAG
ACACAATATGTATAGGCTACCATGCGAACAACTCAACCGATACTGTTGACACAGTACTCGAAAAGAATGT
GACAGTGACACACTCTGTCAACCTACTCGAAGACAGCCACAACGGGAAATTATGTAGATTAAAAGGAATA
GCCCCACTACAATTGAGGAAATGTAACATTGCTGGATGGATCCTGGGAAACCCAGAATGCGAATCACTGC
TTTCAGAGAGATCATGGTCCTACATTGTTGAAACACCAAACTCTGAGAATGGAACATGTTACCCAGGAGA
TTTTACCAACTATGAGGAACTGAGGGAGCAATTGAGCTCTGTATCATCATTCGAAAGATTCGAAATATTC
CCCAAGGAAAGCTCATGGCCCAAACACAACACAACCAGAGGAGTAACGGCAGCATGCTCCCATGCGGGAA
AAAGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTATGGCTGACGGAGAAGGATGGCTCATATCCGAATCTGAACAATTC
CTATGTGAACAAGAAAGGGAAAGAAGTCCTTGTACTATGGGGTGTTCATCACCCGTCCAACATAAAGGAT
CAACAGACCCTCTATCAGAAAGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGTGTCTTCAAACTATAACAGGAGATTCA
CCCCGGAAATAGCAGAAAGACCCAAAGTAAGAGGTCAAGCAGGGAGGATGAACTATTACTGGACCTTGCT
AAAACCCGGAGACACAATAATGTTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCGCCATGGTATGCTTTCGCACTA
AGTAGAGGCTTTGGGTCAGGCATCATCACCTCAAACGCATCGATGCATGAGTGTGACACGAAGTGTCAAA
CACCCCAGGGAGCTATAAACAGCAGTCTCCCTTTCCAGAATATCCACCCAGTCACAATAGGAGAGTGCCC
AAAATACGTCAGGAGTACCAAATTGAGGATGGTTACAGGACTACGGAACATCCCATCCATTCAATCCAGA
GGTCTATTTGGAGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGGATGGTATGGTT
ATCATCATCAGAATGAACAGGGATCAGGCTATGCTGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGG
GATTACAAACAAGGTGAACTCTGTTATCGAGAAGATGAACACTCAATTCACTGCTGTGGGTAAAGAATTC
AACAACTTAGAAAAAAGGATGGAAAACTTAAACAAAAAAGTTGATGATGGATTTCTGGACATTTGGACAT
ATAATGCAGAATTGTTGATTCTACTGGAAAATGAAAGGACTCTGGATTTCCATGACTCAAATGTGAAGAA
TCTGTATGAAAAAGTTAAAAGCCAATTAAGGAATAATGCCAAAGAAATAGGAAACGGGTGTTTTGAGTTC
TACCACAAGTGTAACAATGAATGCATGGAAAGTGTAAAAAATGGAACTTATGATTATCCAAAATATTCAG
AAGAATCAAAGTTGAACAGGGAAAAAATAGATGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGGGTCTATCAGATTCT
GGCGATCTACTCAACTGTCGCCAGTTCACTGGTGCTTCTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGCTTCTGGATG
TGTTCTAATGGGTCTTTGCAGTGCAGAATATGCATCTGAGATCAGAATTTCAGAAATATAAGGAAAAAAA
C
>gi|89148076|gb|CY009324.1|:1-1749 Influenza A virus
(A/Melbourne/35(H1N1)) segment 4, complete sequence
GAAAATAAAACAACCAAAATGAAGGCAAGACTACTGATCCTGTTGTGTGCACTTGCAGCTACAGATGCAG
ACACAATATGTATAGGCTACCATGCGAACAATTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTCGAGAAGAATGT
GACAGTGACACACTCTGTTAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGGAAACTATGTAGATTAAAAGGAATA
31
 Influenza A virus GCCCCACTACAATTGGGGAAATGTAACATCGCCGGATGGCTCTTGGGAAACCCAGAATGCGACTCATTGC
(A/Melbourne/35(H1N1)) TTCCAGCGAGTTCATGGTCCTACATTGTAGAAACACCAAACTCTAAGAATGGAATATGTTATCCAGGAGA
TTTCATCGACTATGAGGAACTGAGGGAGCAATTGAGCTCAGTATCATCATTCGAAAGATTCGAAATATTT
CCCAAGGAAAGCTCATGGCCCAAACACAACACAACCAAAGGAGTGACGGCAGCATGCTCCCATGCGGGAA
AGAGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTATGGCTGACGAAGAAGGAGGACTCATACCCAAAGCTGAGCAATTC
CTATGTGAACAAGAAAGGGAAAGAAGTCCTTGTACTATGGGGTGTTCATCACCCGTCTAACAGTAAAGAG
CAACAGACTCTCTATCAGAATGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGTGTCTTCAAATTATAACAGGAGATTCA
CCCCGGAAATAGCAGAAAGACCCAAAGTAAGAGATCAAGCTGGGAGGATGAACTATTACTGGACCTTGCT
AGAACCCGGAGACACAATAATATTTGAGGCTAATGGAAATCTAATAGCACCATGGTATGCTTTCGCACTG
AGTAGAGGCTTTGGGTCCGGCATCATCACCTCAAACGCATCAATGCATGAGTGTAACACGAAGTGTCAAA
CACCCCAGGGAGCTATAAACAGCAGTCTCCCTTTCCAGAATATACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGCCC
AAAATACGTCAAGAGTGCCAAATTGAGGATGGTTACAGGACTAAGAAACATCCCATCCATTCAATCCAGA
GGTCTATTTGGAGCCATTGCCGGTTTTATTGAAGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGGATGGTATGGTT
ATCATCATCAGAATGAACAGGGATCAGGCTATGCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGG
GATTACAAACAAGGTGAACTCTGTTATCGAGAAAATGAACACTCAATTCACTGCTGTGGGTAAAGAATTC
AACAACTTAGAAAAAAGGATGGAAAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGATTCCTGGACATTTGGACGT
ATAATGCAGAATTGTTAGTTCTACTGGAAAATGAAAGAACTCTGGATTTCCATGACTCAAATGTGAAAAA
TCTGTATGAGAAAGTAAAAATCCAATTAAAGAATAATGCCAAAGAAATCGGAAATGGGTGTTTTGAGTTC
TACCACAAGTGTGACAATGAATGCATGGAAAGTGTGAGAAATGGGACTTATGATTATCCAAAATATTCAA
AAGAATCAAAGTTGAACAGGGAAAAGATAGATGGAGTGAAATTGGAACCAATGGGGGTCTATCAGATTCT
GGCGATATACTCAACTGTCGCCAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATG
TGTTCTAATGGGTCTTTGCAGTGCAGAATATGCATCTGAGATTAGAATTTCAGAAATATAAGGAAAAAA
>gi|133754188|gb|CY020469.1|:1-1738 Influenza A virus
(A/Phila/1935(H1N1)) segment 4, complete sequence
ACAACCAAAATGAAGGCAAGACTACTGGTCCTGTTATGTGCACTTGCAGCTGCAGATGCAGACACAATAT
GTATAGGCTACCATGCGAACAATTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTCGAGAAGAATGTGACAGTGAC
ACACTCTGTTAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGGAAACTATGTAGATTAAAAGGAATACCCCCACTA
CAATTGGGGAAATGTAACATCGCCGGATGGCTCTTGGGAAACCCAGAATGCGACTCACTGCTTCCAGCGA
GATCATGGTCCTACATTGTAGAAACACCAAACTCTGAGAATGGAGCATGTTATCCAGGAGATTTCATCAA
CTATGAGGAACTGAGGGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGATTCGAAATATTTCCCAAGGAA
AGCTCATGGCCCAAACACAACACAACCAAAGGAGTAACGGCGGCATGCTCCCATGCGGGAAAAAGCAGTT
TTTACAGAAATTTGCTATGGCTGACGAAGAAGGAGGACTCATACCCAAAGCTGAAAAATTCCTATGTGAA
CAAGAAAGGGAAAGAAGTCCTTGTACTATGGGGTGTTCATCACCCGTCTAGCAGTAAGGAGCAACAGACT
CTCTATCAGAATGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGTGTCTTCAAATTATAACAGGAGATTCACCCCGGAAA
Influenza A virus TAGCAGAAAGACCCAAAGTAAGAGATCAAACTGGGAGGATGAACTATTACTGGACCTTGCTAGAACCCGG
(A/Phila/1935(H1N1)) AGACACAATAATATTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCACCATGGTATGCTTTCGCACTGAGTAGAGGC
TTTGGGTCCGGCATCATCACCTCAAACGCATCAATGCATGAGTGTAACACGAAGTGTCAAACACCCCAGG
GAGCTATAAACAGCAGTCTCCCTTTCCAGAATATACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGCCCAAAATACGT
CAGGAGTGCCAAATTGAGGATGGTTACAGGACTAAGGAACATCCCATCCATTCAATCCAGAGGTCTATTT
GGAGCCATTGCCGGGTTTATTGAAGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGGATGGTATGGTTATCATCATC
AGAATGAACAGGGATCAGGCTATGCAGCAGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGGGATTACAAA
CAAGGTGAACTCTGTTATCGAGAAAATGAACACTCAATTCACAGCTGTGGGTAAAGAATTCAACAACTTA
GAAAAAAGGATGGAAAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGATTTCTGGACATTTGGACATATAATGCAG
AATTATTAGTTCTACTGGAAAATGAAAGGACTCTGGATTTCCATGACTCAAATGTGAAGAATCTGTATGA
GAAAGTAAAAAGCCAATTAAAGAATAATGCCAAAGAAATCGGAAATGGATGTTTTGAGTTCTACCACAAG
TGTGACAATGAATGCATGGAAAGTGTAAGAAATGGGACTTATGATTATCCCAAATATTCAGAAGAGTCAA
AGTTGAACAGGGAAAAGATAGATGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGGGTCTATCAGATTCTGGCGATCTA
CTCAACTGTCGCCAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGTTCTAAT
GGATCTTTGCAGTGCAGAATATGCATCTGAGATTAGAATTTCAGAAATATAAGAAAAA
>gi|1022914|gb|U38242.1|IAU38242:1-1746 Influenza A virus
(A/Tokyo/3/1967(H1)) hemagglutinin mRNA, complete cds
ATGAAGGCAAAACTACTGGTCCTGTTATGTGCACTTGCAGCTACAGATGCAGACACAATATGTATAGGCT
ACCATGCGAACAACTCAACCGACACTGTTGACACACTACTCGAGAAGAATGTGACAGTGACACATTCTGT
TAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGGAAACTATGTAAATTAAAAGGAATAGCCCCACTACAATTGGGG
AAATGTAACATCGCCGGATGGCTCTTGGGAAACCCAGAATGCGACTCACTGCTTCCAGCGAGATCATGGT
CCTACATTGTAGAAACACCAAACTCTGAGAATGGAGCATGTTATCCAGGAGATTTCATCGACTATGAGGA
ACTGAAGGAGCAATTGAGCTCAGTATCATCATTAGAAAGATTCGAAATATTTCCCAAGGAAAGTTCATGG
CCCAACCACAACACACTCAAAGGAGTAACAGCATCATGCTCCCATGGGGGAAAAAGCAGTTTTTACAGAA
ATTTGCTATGGCTGACGAAAACGGAGGACTCATACCCAAAGCTGAGCAATTCCTATGTGAACAATAAAGG
GAAAGAAGTCCTTGTACTATGGGGTGTTCATCACCCGTCTAGCAGTGATGAGCAACAGAGTCTCTATCAT
AATGTAAATGCTTATGTCTCTGTAGTGTCTTCAAATTATAACGGGAGATTCACCCCGGAAATAGCTGCAA
Influenza A virus GACCCAAAGTAAGAAATCAACCTGGGAGGATGAACTATTACTGGACCTTGCTAGAACCCGGAGACACAAT
(A/Tokyo/3/1967(H1)) AATATTTGAGGCAACTGGTAATCTAATAGCACCATGGTATGCTTTCGCACTGAGTAGAGGGTTTGGGTCC
GGCATCATCACCTCAAACGCGTCAATGCATGAGTGTAACACGAAGTGTCAAACACCCCAGGGAGCTATAA
ACAGCAGTCTCCCTTTCCAGAATATACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGCCCAAAATATGTCAGGAGTAC
CAAATTGAGGATGGTTACAGGACTAAGAAACATCCCATCCATTCAATTCAGAGGTCTATTTGGAGCCATT
GCTGGTTTTATTGAGGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGGATGGTATGGTTATCATCATCAGAATGAAC
AGGGATCAGGCTATGCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGGGATTACAAACAAGGTGAA
CTCTGTTATCGAGAAAATGAACACTCAATTCACAGCTGTGAGTAAAGAATTCAACAACTTAGAAAAAAGG
ATGGAAAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGATTTCTGGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTAG
TTCTACTGGAAAATGAAAGGACTTTGGATTTCCATGATTTAAATGTGAAGAATCTGTACGAGAAAGTAAA
AAGCCAATTAAAGAATAATGCCAAAGAAATCGGAAATGGGTGTTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAAT
AAATGCATGGAAAGTGTAAGAAATGGGACTTATGATTATCCAAAATATTCAGAAGAATCAAAGTTGAACA
GGGAAAAGATAGATGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGGGTGTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAACTGT
CGCCAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGTTCTAATGGGTCTTTG
CAGTGCAGAATATGCATCTGAGATTAGGATTTCAGAAATATAAGAAAAAACACCCTTGTTTCTACT

32
Tomando en cuenta el método que los virus de la influenza A tienen para garantizar la variabilidad genética, podemos
observar que los serotipos encontrados con mayor parecido a nuestro gen, el virus de la influenza A de Puerto Rico
en 1936, son todos de años no muy lejanos. Esto podría deberse a que, entre más tiempo pasa, la variabilidad
genética del virus de la influenza A va aumentando de infección a infección.
Esto nos lleva a deducir que para las vacunas que se generen en cada temporada se requiere de investigación previa
para asegurar la elección de un serotipo lo más parecido posible.

Tabla 3. Secuencia de los a.a. de los serotipos de Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/1936(H1N1)).
Serotipo Secuencia FASTA de a.a.
MKARLLVLLCALAATDADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVT

HSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPARSWSYIVETPNS

ENGICYPGAFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNIGVTAACSHAGKSS

FYRNLLWLTKKGGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPSNSKDQQTLYQNENAYVSV

VSSNYNRRFTPEIAERPEVRDQAGRMNYYWTLLEPGDTIMFEANGNLVAPWYAFALSR

GFGSGIITSNASMHECNTKCQTPQGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTG
Influenza A virus
(A/Henry/1936(H1N1)) LRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGI

TNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNNLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENER

TLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPKYSE

ESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

MKARLLVLLCALAATDADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVT

HSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLRKCNIAGWILGNPECESLLSERSWSYIVETPNS

ENGTCYPGDFTNYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPKHNTTRGVTAACSHAGKSS

FYRNLLWLTEKDGSYPNLNNSYVNKKGKEVLVLWGVHHPSNIKDQQTLYQKENAYVSV

Influenza A virus VSSNYNRRFTPEIAERPKVRGQAGRMNYYWTLLKPGDTIMFEANGNLIAPWYAFALSR

(A/AA/Huston/1945(H1N1))
GFGSGIITSNASMHECDTKCQTPQGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRSTKLRMVTG

LRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGI

TNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNNLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLILLENER

TLDFHDSNVKNLYEKVKSQLRNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSE

ESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
MKARLLILLCALAATDADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVT

HSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDSLLPASSWSYIVETPNS

KNGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPKHNTTKGVTAACSHAGKSS

FYRNLLWLTKKEDSYPKLSNSYVNKKGKEVLVLWGVHHPSNSKEQQTLYQNENAYVSV

Influenza A virus VSSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSR

(A/Melbourne/35(H1N1))
GFGSGIITSNASMHECNTKCQTPQGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVKSAKLRMVTG

LRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGI

TNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNNLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENER

TLDFHDSNVKNLYEKVKIQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPKYSK

ESKLNREKIDGVKLEPMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
MKARLLVLLCALAAADADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVT

HSVNLLEDSHNGKLCRLKGIPPLQLGKCNIAGWLLGNPECDSLLPARSWSYIVETPNS

ENGACYPGDFINYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPKHNTTKGVTAACSHAGKSS

33
 Influenza A virus FYRNLLWLTKKEDSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGVHHPSSSKEQQTLYQNENAYVSV
(A/Phila/1935(H1N1))
VSSNYNRRFTPEIAERPKVRDQTGRMNYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSR

GFGSGIITSNASMHECNTKCQTPQGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTG

LRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGI

TNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNNLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENER

TLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPKYSE

ESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
MKAKLLVLLCALAATDADTICIGYHANNSTDTVDTLLEKNVTVT

HSVNLLEDSHNGKLCKLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDSLLPARSWSYIVETPNS

ENGACYPGDFIDYEELKEQLSSVSSLERFEIFPKESSWPNHNTLKGVTASCSHGGKSS

FYRNLLWLTKTEDSYPKLSNSYVNNKGKEVLVLWGVHHPSSSDEQQSLYHNVNAYVSV
Influenza A virus
(A/Tokyo/3/1967(H1)) VSSNYNGRFTPEIAARPKVRNQPGRMNYYWTLLEPGDTIIFEATGNLIAPWYAFALSR

GFGSGIITSNASMHECNTKCQTPQGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRSTKLRMVTG

LRNIPSIQFRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGI

TNKVNSVIEKMNTQFTAVSKEFNNLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENER

TLDFHDLNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNKCMESVRNGTYDYPKYSE

ESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

Alineamiento
Se realizó el alineamiento usando la aplicación MEGA.

En estas imágenes se muestra el alineamiento de DNA de la HA del virus con sus serotipos realizado con MUSCLE.
En la de arriba se muestra el principio, en la del medio secuencias intermedias y en la de abajo, las últimas
secuencias. Se puede observar que no hubo necesidad de agregar gaps. Esto puede ser debido a la cercanía en el
tiempo del ancestro común entre los serotipos (aunque para virus no se puede hablar de un ancestro común, me
refiero al virus del cual pudieron partir todos).

34
En estas imágenes se muestra el alineamiento realizado para los a.a. de la misma proteína y sus serotipos por
MUSCLE. En la parte de arriba se muestran secuencias primeras, en medio secuencias del medio y hasta abajo,
secuencias últimas. En este caso tampoco hubo necesidad de gaps.

Árboles filogenéticos
Tabla 4. Árboles filogenéticos (originales) de DNA sin enraizar.

Se usó UPGMA como

método de distancia
genética. Se realizaron
1000 replicaciones. Las
distancias evolucionarias
fueron computadas
usando el método de
distancia p.

35
 Se usó UPGMA como
método de distancia
genética. Se realizaron
1000 replicaciones. Las
distancias evolucionarias
fueron computadas
usando el método de
Kimura 2 p.

Se usó el método de
Máxima Probabilidad (ML)
basado en el modelo de
Kimura 2 p. Se realizaron
1000 replicaciones.

Se usó el método de
Máxima Parsimonia
usando el algoritmo SPR.
Se realizaron 1000
replicaciones.

Como se puede observar solo los árboles realizados por UPGMA se parecen entre sí, con porcentajes idénticos,
excepto el de la última rama. De esta manera se puede decir que, a pesar de haber dos iguales, las ramas no están
resueltas si tomamos en cuenta el resto de los árboles.

36
Tabla 5. Árboles filogenéticos (originales) de a.a. sin enraizar.

Se usó Máxima
Probabilidad (ML). Se
realizaron 1000
replicaciones.

Se usó el método de
Máxima Parsimonia.
Se realizaron 1000
replicaciones.

37
 Se usó UPGMA como
método de distancia
genética. Se
realizaron 1000
replicaciones. Se usó
el método de Poisson
como método de
corrección.

Se usó UPGMA como

método de distancia
genética. Se
realizaron 1000
replicaciones. Las
distancias se
computaron usando
el método de
distancia p.

Los únicos parecidos entre sí son los realizados con UPGMA, con porcentajes similares para cada rama. Pero, aún
así, parece ser que las ramas tampoco están resueltas con los árboles de a.a ya que no hay similitud con el resto de
los árboles.

38
IV. Estrategias de clonación y expresión
Como se estuvo mencionando a lo largo de este trabajo, el genoma del virus, que se va a obtener de la American Type
Culture Collection (ATCC) con el producto Quantitative Genomic RNA from Influenza A virus (H1N1) (ATCC® VR-
95DQ™), está en forma de RNA de polaridad negativa, por lo que primero se debe exponer ante una RNA polimerasa
para obtener el cRNA, que sirve como mRNA.
Para que esto se lleve a cabo se requiere de la RNA polimerasa dependiente de RNA aislada del virus, de primer de
RNA con caps, y del resto de reactivos necesarios para una polimerización de RNA (dNTPs, buffer, etc). Esta RNA
polimerasa especial sintetiza el mRNA poliadenilado y con caps a partir de los primer de RNA con caps, que es
como se requiere [6;7].
Posteriormente, a este producto de mRNA se le realiza una RT-PCR de un solo paso. Usando para la transcripción
inversa un primer poli T, para transcribir a cDNA el fragmento de mRNA poliadenilado por completo. Luego para la
PCR se usan los primer diseñados en el apartado II del presente trabajo.
Así, entonces, obtenemos el cDNA al mRNA complementario al RNA de polaridad negativa del genoma viral y se
puede proseguir a los siguientes pasos para la clonación y expresión.

Sitios de restricción
Se buscaron diferentes secuencias de restricción usando la secuencia FASTA.

Figur a 8. Secuen cias de rest ricci ó n en co nt radas en el ge n m edi ant e el programa Snap Gene.

No se encontraron secuencias de restricción fuera del gen de interés que a su vez puedan ser usadas correctamente
en el vector, por lo que se debe recurrir a agregarlas por métodos de biología molecular junto con los primer de
amplificación. Se agregaron secuencias de KpnI y FseI (en el extremo 5’ y 3’, respectivamente), ya que no se
encontraron secuencias de estas enzimas dentro del gen, por lo que este no será cortado por en medio; además de
que son apropiadas para digerir también al vector (se hablará de él más adelante).
Ninguna de las enzimas cuyas secuencias están presentes en el gen (Fig. 8) serán usadas en el proceso de clonación.

39
 GGTACCGCAGGGGAAAATAAAAACAACCAAAATGAAGGCAAACCTACTGGTCCTGTTATGTGCACTTGCAGCTGCAGATG
CAGACACAATATGTATAGGCTACCATGCGAACAATTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTCGAGAAGAATGTGACAGTG
ACACACTCTGTTAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGAAAACTATGTAGATTAAAAGGAATAGCCCCACTACAATTGGG
GAAATGTAACATCGCCGGATGGCTCTTGGGAAACCCAGAATGCGACCCACTGCTTCCAGTGAGATCATGGTCCTACATTG
TAGAAACACCAAACTCTGAGAATGGAATATGTTATCCAGGAGATTTCATCGACTATGAGGAGCTGAGGGAGCAATTGAGC
TCAGTGTCATCATTCGAAAGATTCGAAATATTTCCCAAAGAAAGCTCATGGCCCAACCACAACACAAACGGAGTAACGGC
AGCATGCTCCCATGAGGGGAAAAGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTATGGCTGACGGAGAAGGAGGGCTCATACCCAAAGC
TGAAAAATTCTTATGTGAACAAAAAAGGGAAAGAAGTCCTTGTACTGTGGGGTATTCATCACCCGCCTAACAGTAAGGAA
CAACAGAATCTCTATCAGAATGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGTGACTTCAAATTATAACAGGAGATTTACCCCGGAAAT
AGCAGAAAGACCCAAAGTAAGAGATCAAGCTGGGAGGATGAACTATTACTGGACCTTGCTAAAACCCGGAGACACAATAA
TATTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCACCAATGTATGCTTTCGCACTGAGTAGAGGCTTTGGGTCCGGCATCATCACC
TCAAACGCATCAATGCATGAGTGTAACACGAAGTGTCAAACACCCCTGGGAGCTATAAACAGCAGTCTCCCTTACCAGAA
TATACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGCCCAAAATACGTCAGGAGTGCCAAATTGAGGATGGTTACAGGACTAAGGAACA
TTCCGTCCATTCAATACAGAGGTCTATTTGGAGCCATTGCCGGTTTTATTGAAGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGGA
TGGTATGGTTATCATCATCAGAATGAACAGGGATCAGGCTATGCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGG
GATTACAAACAAGGTGAACACTGTTATCGAGAAAATGAACATTCAATTCACAGCTGTGGGTAAAGAATTCAACAAATTAG
AAAAAAGGATGGAAAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGATTTCTGGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTAGTT
CTACTGGAAAATGAAAGGACTCTGGATTTCCATGACTCAAATGTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTAAAAAGCCAATTAAA
GAATAATGCCAAAGAAATCGGAAATGGATGTTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAATGAATGCATGGAAAGTGTAAGAA
ATGGGACTTATGATTATCCCAAATATTCAGAAGAGTCAAAGTTGAACAGGGAAAAGGTAGATGGAGTGAAATTGGAATCA
ATGGGGATCTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAACTGTCGCCAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAG
TTTCTGGATGTGTTCTAATGGATCTTTGCAGTGCAGAATATGCATCTGAGATTAGAATTTCAGAGATATGAGGAAAAACA
CCCTTGTTTCGGCCGGCC

Figur a 9. Secuen cia ext endi da co n secuenci as de rest ricción de: Kp nI e n am ari ll o y FseI en verde por mét odos de bi ol ogí a
mol ecul ar agregan do estas secuenci as a los ext remos de los pri mers de am pl ifi caci ó n (en turq uesa y ros a).

40
Vector de expresión
Como ya se ha mencionado, la expresión se realizará en la levadura Pichia pastoris metilotrófica, es decir que
puede usar metanol como única fuente de carbono.
Para ello se usará el vector pPink-HC dentro del cual el gen de la HA del virus de la influenza estará regulado por el
promotor de la enzima alcohol oxidasa 1 (AOX1).

Figur a 10. Pl ás mi do p Pin k-HC. pUC ori es el siti o de or igen de repl icació n p ara cl onar en Escheri chi a coli T OP 10, AmpR es el
gen de resistenci a a am pi cil i na que es el selecti vo para l a clonaci ó n, PAOX1 es el p romot or de l a al cohol ox idasa 1 de P.
pastoris, que es act ivado p or el met anol, CYC1 TT es un siti o de t ermi naci ón de t ranscripció n para levaduras, PA DE2 es el
promotor fuerte para el g en AD E2 que si nt et iza l a fosforibosil am inoimi dazol carbox ilasa esen cial par a b i osínt esis de
nu cleótidos púricos, TRP 2 que posee l as secue nci as d e rest ricción p ara linealiza r el vector e int egrarlo al genoma de l a
levadura.

Inserción del gen de interés en el vector

Se digieren el vector y el producto de la PCR amplificado con las enzimas KpnI y FseI para que el gen de interés quede
insertado en la dirección correcta. El ensamblado queda como se establece en la Figura 11.

41
Figur a 11. P ro ducto del ensa mblado co n el vector di geri do y el gen de i nterés digeri do con l as e nzimas de rest ricci ón KpnI y
FseI.

Figur a 12 . Pro ceso de e nsam blado del vect or y el gen de int erés.

Clonación
La clonación se realiza en una cepa de Escherichia coli TOP10 competente.
El gen de resistencia a ampicilina nos sirve para verificar si el vector fue insertado. Se cultivan las células en placas
de medio LB con ampicilina, realizando los controles de viabilidad y esterilidad del medio determinados. Se revisa

42
que haya crecimiento en las placas con ampicilina para asegurar la transformación de las células, que haya
crecimiento en el control de viabilidad y no lo haya en el de esterilidad del medio.
Para verificar la presencia del inserto (gen de interés) en el vector, se seleccionan algunas colonias de la bacteria y
se realiza una amplificación mediada por PCR con los mismos primer de la sección II y se corre una electroforesis en
gel. Se revisa la presencia de banda en 1778 pb.

Expresión
Al verificar que el vector con el gen de interés fue clonado se lisan las células bacterianas y se purifica el DNA
siguiendo los protocolos determinados. Se induce la competencia de la cepa de P. pastoris mediante electroporación
para que pueda ingresar el vector a su interior. Se puede digerir previamente el vector con enzimas de restricción AflI,
SpeI o EcoNI, que cortan en la región del gen TRP2 que codifica para una enzima que es el primer paso para la síntesis
de triptófano, para que este se inserte en el genoma de la levadura.

Estrategia de expresión
El plásmido pPink-HC es un vector comercializado por la Corporación Invitrogene que fue especialmente diseñado
para expresión en la levadura Pichia pastoris metilotrófica.
Para poder sobre expresar una proteína heteróloga con este se debe usar una cepa de esta levadura que sea
auxótrofa a adenina y que no produzca las proteasas A, B y la carboxipeptidasa (que rompen las proteínas producidas).
Además, se debe de cultivar en medio de glicerol con metanol como inductor del promotor de la alcohol oxidasa 1.
No se usa un medio con metanol como única fuente de carbono para evitar la extra producción de formaldehido.
Se usa la cepa 3 PichiaPink™ que es comercializada por la misma empresa que el pPink-HC. Esta posee las
características mencionadas anteriormente [8].
La auxotrofía a adenina se requiere ya que el gen ADE2 del plásmido le brinda de nuevo la habilidad de crecer en
medio sin adenina. Por lo tanto, nos sirve como un gen selectivo sin la necesidad de añadir antibióticos al medio. Así,
las células que crezcan en medio sin adenina son las que sí fueron transformadas.

V. Estructura de la proteína
La hemaglutinina es un homotrímero. Cada monómero tiene un tallo constituido principalmente por la HA2. El péptido
HA1 es una proteína de unión al receptor, como ya se mencionó, y forma la región de reconocimiento hipervariable
llamada cabeza globular de la hemaglutinina; además forma cinco regiones con función de epítopos que rodean el
sitio donde se une el ácido siálico. [5].
Se utilizó Protein Data Bank (PDB) para obtener la información de la proteína, buscando la secuencia específica de
la HA y se tuvo suerte.

43
Figur a 13. In formación de l a p roteína HA: p eso de la es truct ura cont ando sol o l os a.a., la cant i dad de átomos, de residuos y
de caden as.

En esta página se consultó la secuencia secundaria de cada una de las cadenas que integran la proteína obteniendo
los resultados de las Fig. 14 y 15.

Figur a 14. Sec uen cia de P DB de l a HA 1 con el tipo de est r uc tur a secun dar i a qu e repr esenta cada figura .

Figur a 15 . Secue nci a de P DB de l a HA 2 con el t ipo de estr uct ur a secu n dari a que r epr esenta cada figur a.

44
Figur a 16. Inf ormaci ón adicional de l a est ructura de la proteí na HA.

En la parte verde de la Fig. 16 se puede ver claramente la región de la secuencia que pertenece al péptido señal y al
resto de la proteína, las dos cadenas HA1 y HA2 y los sitios de glicosilación ( ). En la parte naranja aparece la región
que es un dominio de proteína viral. En la parte gris se muestran las regiones de hidrofobicidad (en rojo) y de hidrofilia
(en azul) y las regiones con desorden (en rojo) y con orden probable (en azul). Y las regiones validadas por PDB son
las que aparecen en la parte azul junto con la estructura secundaria.
La estructura de la proteína se obtuvo mediante difracción de rayos X. Para ello primero se debe realizar la
cristalización. A continuación, se mostrarán los resultados de la cristalización y difracción publicados en PDB.

Tabla 6. Datos de la cristalización y de los cristales que se obtuvieron.

Tabla 7. Datos de la difracción de rayos por los cristales.

45
Estructura 3D

Figur a 17 . Est ructur a 3D de la HA de la influe nza A /Pue rto Ri co/8/1934 (H1 N1 ). E n l a pri mera fi gur a ca da col or represent a
un a estruct ura sec un daria d iferent e. En l a segun da f i gura se muestran l os tres monómeros de l a p roteína consti t ui dos p or
las cadenas HA 1 y HA 2 vist o s desde arriba.

Figur a 18. Est ruct ura 3D co n f o ndo negro y vi sta desde arri ba.

46
VI. Referencias
[1] Manjarrez, M. E. (1999) Virus influenza:
Enigma del pasado y del presente. Revista del
Instituto Nacional de Enfermedades
Respiratorias. Vol. 12, número 14. 290-299.
[6]
[2] Centers for Disease Control and Prevention.
(24 de septiembre de 2018) How Influenza
(Flu) Vaccines Are Made. [Consultado el 20 de
noviembre de 2018]. Recuperado de:
https://www.cdc.gov/flu/protect/vaccine/how
-fluvaccine-made.htm
[3] [7]
[4] Racaniello, V. (1 de mayo del 2009) Influenza
virus RNA genome. Virology Blog: about viruses
and viral disease. [Consultado el 20 de
noviembre de 2018]. Recuperado de:
http://www.virology.ws/2009/05/01/influenz
a-virus-rna-genome/ [8]
[5] Echeverry, D. M. (2012) Antigenicidad de la
hemaglutinina del virus de la influenza porcina
subtipo (H1N1) clásico como candidato a
vacuna en un vector de expresión de células de
mamífero. Universidad Nacional de Colombia.
47
Bogotá, Colombia. Recuperado de:
http://bdigital.unal.edu.co/10708/1/dianama
rcelaecheverrymunoz.2012.pdf
Fodor, E. (2013) The RNA polymerase of
influenza virus: mechanisms of viral
transcription and replication. PubMed.
57(2):113-22. [Consultado el 01 de diciembre
del 2018]. Recuperado de:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2360
0869
Racaniello, V. (8 de mayo del 2009) Influenza
viral RNA synthesis. Virology Blog: about viruses
and viral disease. [Consultado el 01 de
diciembre del 2018]. Recuperado de:
http://www.virology.ws/2009/05/08/influenz
a-viral-rna-synthesis/
Invitrogen. (2014) PichiaPink™ Expression
System. User guide. Life Technologies
Corporation. Recuperado de:
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/m
anuals/pichiapink_expression_system_man.p
df