CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

PROYECTO PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO EN ​Yarrowia

lipolytica

Alumnos:
Samantha Denise Correa Nieto
Aidee Florencia Muñoz Prieto
Josué Agustín Prieto Hernández
Cynthia Lisset Ulloa Valdés

ING. BIOQUÍMICA

Semestre: 4° Grupo: “A”

PROFESOR: Dr. José Francisco Morales Domínguez

Aguascalientes, Ags. a 30 de marzo de 2018

Introducción

El ácido cítrico es un ácido orgánico muy frecuente en la naturaleza ya

que es un compuesto intermedio en el ciclo de Krebs, también está
presente en gran cantidad de frutas tales como limón, naranja, piña,
ciruela, pera y melocotón, también se encuentra en los huesos de los
animales, músculos y sangre.
El nombre de este ácido orgánico se deriva de la palabra latina cítricos,
que se refiere a los árboles del género Citrus, incluidos los limoneros.
El ácido cítrico en su forma pura es fácilmente soluble en agua e
incoloro. Es sólido a temperatura ambiente. El ácido cítrico tiene un
punto de fusión de 153 ° C y se descompone a temperaturas más altas.
El ácido cítrico tiene un peso molecular de 210.14 g / mol y posee tres
valores diferentes de pKa, a pH 3.1, 4.7 y 6.4, debido a la presencia de
tres grupos funcionales de ácido
carboxílico en su estructura.

La fermentación del ácido cítrico

fue observada por primera vez
por Wehmer en 1893, en un
cultivo de Penicillium glaucum en
un medio “dulce” o azucarado.
Después de dos años aisló dos
nuevas cepas con la habilidad
de acumular ácido cítrico, a las que designó citromyces; sin embargo no
pudo ser industrializado debido a problemas de contaminación y el
tiempo que tomaba la fermentación. No fue si no hasta 1916 que Currie
abrió el camino para una exitosa producción del ácido cítrico, él
encontró que numerosas cepas de Aspergillus niger producían una
considerable cantidad de ácido cítrico y que éste crecía bien en un
medio muy ácido y altas concentraciones de azúcares.
Fue aislado por primera vez por Scheele al mezclar zumo de limón con
cal y disolviendo el precipitado con ácido sulfúrico. A principios del siglo
XX la obtención del ácido cítrico se hacía a partir de limones, pero a
mediados de siglo ese proceso se hizo cada vez menos rentable,
optándose posteriormente, cada vez más, por la producción mediante la
fermentación de un microorganismo.
El ácido cítrico forma quelatos, una formulación química de muchos
minerales y metales que es fácilmente digerible y absorbible por el
estómago e intestinos en el proceso de la digestión. Tener presente una
buena cantidad de ácidos en el estómago ayuda con la digestión y, los
suplementos con vitaminas y minerales que lo añaden son más fáciles
de digerir.
Es uno de los ácidos orgánicos que más se utiliza en el mundo. Es un
ácido dibásico, lo que permite la formación de sales neutras, una de tipo
mono alcalino y dos sales diferentes dialcalinas. También forma sales
de tipo complejos solubles con varios iones metálicos, además, es muy
usado como consumo humano ya que presenta alta solubilidad, baja
toxicidad, fuerte poder quelante y sabor agradable, por lo que tiene
numerosas aplicaciones en la industria alimentaria, farmacéutica y
otras.(Blanco, G.; Herryman, M.2001).
Los usos del ácido cítrico están dados fundamentalmente por las
siguientes propiedades: acidez, formación de complejos y
emulsificación. El 75% de la producción de ácido cítrico se utiliza en la
industria alimentaria como acidulante, tampón, emulsificante,
estabilizador de grasas y aceites y para acentuar el sabor.
El ácido cítrico es usado principalmente en la industria de la
alimentación para la elaboración de bebidas y otros productos, también
como saborizante y conservante, aunque tiene otras muchas
propiedades por las que es utilizado en esta industria. El ácido cítrico
también es utilizado en la industria farmacéutica, textil, cosmética,
agrícola y de detergentes.
El 15% de su producción tiene uso industrial, principalmente en
detergentes, limpieza de calderas, acondicionador de agua, pulido de
aceros inoxidables, y en las industrias del cuero y textil como s de la
leche esterilizada o mordientes. Se emplea el 10% de la producción con
fines farmacéuticos en jarabes, pastillas, ungüentos, preparados
digestivos; en forma de sales de Na y K como preservante de sangre, y
de citrato de Fe y NH3 para combatir la anemia.
También se utiliza en la elaboración de encurtidos, pan, conservas de
pescado y crustáceos frescos y congelados entre otros alimentos. Los
citratos sódico o potásico se utilizan como estabilizante UHT. Se utiliza
además en limpiadores de membranas de osmosis invertida: las
soluciones de ácido cítrico se usan para quitar hierro, calcio y otros
cationes que ensucian el acetato celuloso y otras membranas en
osmosis invertida y sistemas de electrodiálisis. (López R., 2002).

Desarrollo

Actualmente, los biocombustibles representan un tema importante en el

contexto del petróleo y la disminución de los productos adyacentes. A
medida que la producción de biocombustibles aumenta, también lo hace
la producción de su subproducto principal, a saber, el glicerol en bruto.
El uso eficiente de glicerol en bruto tiene mucha relación con la
viabilidad del biodiesel. Como un desperdicio inevitable de la fabricación
de biodiesel, el glicerol es un sustrato potencialmente atractivo para la
producción de productos de valor agregado mediante procesos de
fermentación, debido a sus grandes cantidades, bajo costo y alto grado
de reducción. Uno de los usos más importantes del glicerol es su
bioconversión a través de la fermentación microbiana a materiales de
valor agregado como 1,3-propanodiol y ácido cítrico. Existe un
considerable interés industrial en la producción de 1,3-propanodiol y
ácido cítrico basada en fermentaciones microbianas, ya que parece
estar en competencia con las tecnologías tradicionales utilizadas para
estos productos.
En ésta ocasión nos centraremos en el uso del glicerol de desperdicio
para producir ácido cítrico.
El ácido cítrico es un producto industrial bien conocido y se puede
obtener principalmente por fermentación. Debido a su baja toxicidad en
comparación con otros acidulantes, el ácido cítrico se utiliza para
agregar un agradable y astringente favor a las bebidas y alimentos;
además de ser un aditivo funcional en fármacos, cosméticos y
detergentes.
Fue descrito por primera vez como un compuesto obtenido de plantas
de cítricos y conocido como un intermediario del ciclo del ácido
tricarboxílico (TCA).
El ácido cítrico es el primero de los ácidos orgánicos sintetizados por
bacterias. Múltiples microorganismos, principalmente Yarrowia lipolytica
y Aspergillus niger se utilizan para fermentar diversas fuentes de
nutrientes con el fin de obtener altos rendimientos de ácido cítrico.
La conversión química de glicerol puede interpretarse de tres maneras:
(a) por oxidación y reducción de glicerol en otros compuestos de 3
carbonos; (b) por síntesis de compuestos de carbono superiores con
glicerol y otros substratos; (c) por combustión industrial. Estos método
catalíticos tradicionales suelen ser costosos y tóxicos, Además, es muy
difícil quemar glicerol productivamente. Así pues, la conversión de
glicerol utilizando microorganismos es una opción viable en
comparación con la aplicación directa y la transformación química, y de
esta manera, ciertos inconvenientes tales como baja especificidad del
producto, requisitos intensivos de pretratamiento y alta ingesta de
energía se puede evitar.
La producción industrial de ácido cítrico también se puede llevar a cabo
de tres maneras distintas: mediante fermentación sumergida,
fermentación superficial y fermentación en estado sólido.
Todos los métodos mencionados exigen una excelente materia prima y
un fermentador de producción adecuado para una inoculación de cepa
directa. La acumulación de AC está fuertemente influida por el tipo y la
concentración de la fuente de carbono. Esta fuente pueden ser algunos
de los carbohidratos más fácilmente metabolizados, la sacarosa es la
fuente de carbono más favorecida, seguida por la glucosa, la fructosa y
la galactosa.
Durante la fermentación de glicerol por cepas específicas, la síntesis de
ácido cítrico implica el agotamiento de la fuente de nitrógeno de los
medios de cultivo. El agotamiento de nitrógeno produce una disminución
repentina de la concentración intracelular de AMP, debido a su
separación causada por AMP-desaminasa. La NAPD + -isocitrato
deshidrogenasa (la enzima que es responsable del cambio isocítrico a
ácido a-cetoglutárico) pierde su actividad debido a que es activada
alostéricamente por el AMP intracelular, fenómeno que conduce a la
acumulación de ácido cítrico dentro de las mitocondrias. Si la
concentración de ácido cítrico excede el valor crítico, el AC se secreta
en la matriz citoplásmica. Existen algunas levaduras oleaginosas que
pueden disociar la AC citoplásmica en acetil-CoA y oxalacetato
mediante el uso de ATP-citrato liasa (ACL), una enzima responsable del
proceso de acumulación de lípidos. La acetil-CoA se somete luego a
una reacción de β-oxidación cuasi-invertida a los ácidos grasos
celulares. Es decir, el ácido cítrico es utilizado por los microorganismos
oleaginosos como un donante de acetil-CoA en la ruta anabólica de la
síntesis de ácidos grasos. Por el contrario, los microorganismos no
oleaginosos excretan el ácido cítrico acumulado en el caldo de cultivo .

Producción de ácido cítrico en YARROWIA

Al utilizar la levadura Yarrowia lipolytica se ha registrado un aumento en

el rendimiento de la producción de ácido cítrico. Se considera que el
microorganismo es la cepa más productiva para el ácido cítrico
convertido a partir de glicerol crudo. El cultivo de cepas naturales de Y.
lipolytica tanto en glicerol en bruto a partir de la producción de biodiesel
como en glicerol puro dio resultados similares con respecto a los
rendimientos de AC.
En los procesos biotecnológicos, la biosíntesis del ácido cítrico se
realiza en lotes, en lotes alimentados, así como también en cultivos
repetidos, ocasionalmente con reciclaje de células y reemplazo medio.
En su estudio, Rywińska investigó el rendimiento y la producción de AC
de Y. lipolytica Wratislavia AWG7, que es un mutante negativo en
acetato con un fenotipo de colonia lisa. El proceso se llevó a cabo en
condiciones de estado estable, donde el aumento de la tasa de dilución
se realizó simultáneamente mediante la reducción de la concentración
de AC que oscilaba entre 86,5 y 51,2 g / l. Se registró un aumento
similar para la tasa volumétrica (de 0,78 a 1,59 g / l / h) y la tasa
específica (de 0,05 a 0,18 g / g / h) de producción de ácido cítrico. El
rendimiento del proceso de producción varió de 0.59 a 0.67 g / g.
En otro estudio, se compararon 3 mutaciones de Y. lipolytica según su
capacidad de producción de ácido cítrico a partir de glucosa pura o
glicerol crudo derivado del biodiesel en fermentaciones por lote. Estos
compuestos fueron empleados como sustrato y fuente de carbono. La
mayor cantidad de ácido cítrico fue producida por la A-101: hasta
82.2g/L.

Camino general de la producción de ácido cítrico

Las cepas Wratislavia 1.31 y y Wratislavia AWG7 se probaron en

sistemas con elevada concentración de glicerol, obteniendo
concentraciones de ácido cítrico de 126g/L y 113.5 g/L respectivamente,
después de 100 horas de fermentación.
Por otra parte, 66 cepas de levadura de diferentes géneros fueron
evaluadas para examinar su producción de ácido cítrico. Entre estas
destacó la Yarrowia lipolytica N15, produciendo hasta 98 g/L del ácido.
De todas las cepas evaluadas, la mejor en cuanto a producción de ácido
cítrico fue la cepa NRRL YB-423 con un rendimiento del 54%,
empleando glicerol crudo como sustrato. Cuando se inactiva la enzima
2-metilcitrato hidratasa en la Y. lipolytica en condiciones de nitrógeno
limitado, el rendimiento de producción alcanza aproximadamente el 92%
(Mitrea ​et al. ​2017).
Producción de ácido cítrico en ASPERGILLUS
En general, el ácido cítrico se crea por fermentación microbiana
sumergida en melaza usando Aspergillus niger. Aunque el Aspergillus
Niger es considerado el principal productor de AC por fermentación de
diferentes fuentes de carbono orgánico, parece ser que ese glicerol
crudo no representa un buen sustrato para la producción de ácido
cítrico. En este sentido, los estudios se han dirigido a cepas de levadura
(por ejemplo, Yarrowia lipolytica) como una sustitución apropiada. Esto
se puede explicar por su resistencia a altas concentraciones de sustrato
y mayor tolerancia a las impurezas, permitiendo el uso de sustratos de
baja calidad.
Se investigó el efecto de la concentración y tipo de fuente de carbono en
la acumulación de ácidos cítricos en un fermentador discontinuo
inducido por Aspergillus niger. En su informe, presentaron una lista de
fuentes de carbono (sacarosa, maltosa, fructosa, glucosa, glicerol,
etanol, succinato) probado para una alta producción de CA. La
producción de ácido cítrico en glicerol fue de 17 mg / mL, comenzando a
partir de una concentración inicial de fuente de carbono del 14%,
mientras los resultados en maltosa fueron más altos (49 mg / ml). Sus
trabajos demuestran que la concentración y el tipo de fuente de
carbohidratos tienen un impacto significativo sobre la producción de
ácido cítrico por Aspergillus niger.
El ácido cítrico se produce durante la trofofase como resultado de la
interrupción del ciclo del ácido tricarboxílico. En A. níger,
aproximadamente el 78% de azúcar pasa a través de la vía EMP y da
como resultado la producción de acetil CoA que se condensa con ácido
oxalacético para producir ácido cítrico.
El ciclo de ácido cítrico adicional se interrumpe por la inhibición de la
aconitasa y la deshidrogenasa isocírica mediante cobre o peróxido de
hidrógeno. Sin embargo, el hierro es un cofactor esencial de estas
enzimas. El Cu y el Fe en una proporción de 0.3: 2 (mg / litro)
interrumpen la actividad de estas enzimas a pH 2.0.

Purificación
Los principales problemas en la producción de ácido cítrico siguen
siendo los pasos de separación y purificación. Varias etapas de
filtración, precipitación, cristalización y secado
hacen el proceso caro y complicado. En años recientes algunos
métodos se desarrollaron para disminuir el costo de la recuperación,
tratando de superar el inconveniente de la precipitación, que es
responsable de la formación y eliminación de enormes cantidades de
sulfato de calcio, llevando a problemas de contaminación. La
electrodiálisis es un proceso de separación electroquímica en el cual las
membranas cargadas eléctricamente y el diferencia de potencial
eléctrico se utilizan para separar especies iónicas de soluciones
acuosas. Esta técnica fue probada en la recuperación de ácido cítrico y
muestra que la separación de especies iónicas de caldos de
fermentación clarificada es más económico. El problema es que de la
técnica de electrodiálisis se descubrió que los costos son
aproximadamente un 50% mayores que proceso actual de recuperación
de ácido cítrico a escala industrial. Los grandes costos específicos de
electro membrana y energía eléctrica parecen limitar las aplicaciones de
electrodiálisis solo a productos de alto valor agregado. El uso de
electrodiálisis necesitaría el desarrollo de una nueva fermentación
integrada y de procesos para minimizar la formación de residuos y
mejorar productividad.

Aplicaciones
El ácido cítrico es ampliamente utilizado como un agente acidificante,
conservante y antioxidante en los alimentos, bebidas y la industria
farmacéutica, así como en detergentes y productos de limpieza,
cosméticos, artículos de higiene personal, entre otros.
Se considera un producto de alta demanda, por lo tanto la oferta lo es
también, sin embargo el mercado es liderado por China pues del 35 %
al 40 % de la producción mundial les corresponde.
Aplicaciones más comunes:
● Reducir el pH.
● Componente de cosméticos.
● Antioxidante para la piel, antimanchas y despigmentante.
● Prevenir la formación de cálculos renales y mejorar el
funcionamiento de los riñones.
● Eliminar infecciones.
● Reducir la sensación de acidez gástrica, gases y ardores.
Añadido en forma de zumo de limón a un vaso grande de agua
consigue beneficios para el estómago.
● Impedir el estreñimiento.
● Conservante para alimentos envasados.
● Revelado de fotografías en sustitución del ácido acético.
● Eliminación de la cal.
● Abrillantado y eliminación del óxido en metales como el cobre
y aleaciones como el latón.
● Eliminar el jabón de superficies.
● Acidulante.

En suplementos dietéticos es añadido para dar el típico sabor de frutas

ácidas: sabor naranja y limón. Es un ingrediente fundamental en todos
los productos elaborados y en la creación de suplementos de vitamina
C.

Sector de la industria Uso y aplicación

alimenticia
Ácido cítrico para la producción Saborizante y regulador del pH;
de Bebidas incrementa la efectividad de los
conservantes antimicrobianos.

Figura 2. Acercamiento a los

Figura 1. Etiqueta de la bebida ingredientes de la etiqueta de la
comercial “fanta” figura 1. en la que se lee “ácido
cítrico”

Ácido cítrico para la producción Acidulante y regulador del pH para

de Dulces y Conservas lograr una óptima gelificación.

Figura 3. lista de ingredientes de las

gomitas “Life savers”, donde puede
leerse “Citric acid”
Ácido cítrico para la producción Acidulante y regulador del pH con el
de Caramelos objetivo de alcanzar la máxima
dureza de los geles.

Figura 5. Paletas Mega double

lollies
Figura 5. Lista de ingredientes de
las Paletas Mega double lollies

Ácido cítrico para la producción En combinación con ácido

de Verduras procesadas ascórbico, previene la oxidación.

Ácido cítrico para la producción Ayuda a la acción de los

de Alimentos congelados antioxidantes; inactiva enzimas
previniendo efectos indeseables;
inhibe el deterioro del sabor y color.

Ácido cítrico para la producción Disminuye el pH; al actuar como

de Frutas y hortalizas enlatadas quelante: previene la oxidación
enzimática y la degradación del
color, resalta el sabor.
Ácido cítrico para la producción Previene la oxidación.
de Aceites y grasas

Ácido cítrico para la producción Se utiliza como acidulante,

de Confitería y repostería resaltador de sabores y para
optimizar las características de los
geles.

Figura. 6 Etiqueta de mermelada

Ácido cítrico para la producción En forma de sal, como emulsificante

de Quesos pasteurizados y y texturizante.
procesados

Ácido cítrico para la producción Estimulante en cremas batidas.

de Lácteos

Ácido cítrico para la producción Para bajar el pH en presencia de

de Productos de la pesca otros conservantes o antioxidantes.

Carnes Se utiliza como auxiliar del

procesado y modificador de textura.
Muchos de los usos del ácido cítrico para el cuidado de la salud están
relacionados con su acción antioxidante. Ayuda a proteger la piel del
estrés oxidativo y también mejora la acción de vitaminas y compuestos
orgánicos necesarios cada día. Es muy utilizado en cremas para la cara
y gel para el cuerpo en pequeñas cantidades ya que elevando la
concentración produce efectos secundarios como irritación. Funciona
bien como despigmentante a dosis bajas y puede incluirse en peelings.
El uso del ácido cítrico para limpieza permite desinfectar superficies y
dejarlas limpias. Hay que tener cuidado cuando se utiliza ya que puede
dañar los materiales. Es corrosivo y utilizado en ciertos materiales
cambia el color y daña la capa superior protectora.
El ácido cítrico e330 es un aditivo con propiedades conservantes y
antioxidantes. Para permitir la conservación de los alimentos envasados
funciona muy bien por los beneficios de ser un ácido tricarboxílico.

Propuesta
En este proyecto se propone la bioproducción de ácido cítrico mediante
la fermentación de glicerol crudo por dos cepas de Y. lipolytica: la N15 y
la NRRL YB-423

Se emplearan concentraciones de 200-300 g/L el sustrato que funge

como fuente de carbono: el glicerol crudo.

Para la producción, el glicerol será sometido a una fermentación por las

cepas mencionadas anteriormente, dentro de un biorreactor,
controlando el ambiente para producir una atmósfera limitada de
Nitrógeno.

Se agregará un inhibidor de la enzima 2-metilcitrato hidratasa, para

frenar parcialmente la ruta metabólica donde se presenta la síntesis del
ácido cítrico.

La fermentación ocurrirá de 120-200 horas continuas, a una temperatura

mínima de 50 °C para optimizar la actividad enzimática.
Posteriormente, se separarán los sólidos del líquido producido, para
obtener una mezcla acuosa donde el ácido cítrico se encontrará en su
forma ionizada: citrato.

El citrato se separará, y simultáneamente se purificará mediante una

extracción líquido-líquido, empleando solventes que diluyan al citrato
aprovechando su condición de ácido carboxílico.

La solución dónde se encuentra el citrato purificado se someterá a la

evaporación del solvente2 para obtener un sólido blanco cristalino: el
ácido cítrico.

Bibliografía
● Angumeenal A, Kamalakannan P, Prabhu HJ, Venkappayya D.
Effect of transition metal cations on the production of citric acid
using mixed cultures of Aspergillus niger and Candida
gulliermondii. (2003).
● Bauweleers HMK, Groeseneken DR, Van Peij NNME. Genes
useful for the industrial production of citric acid. (2014).
● Blanco, G.; Herryman, M. Evaluación exploratoria de la producción
de ácido cítrico. Panorámica mundial y en Cuba. Departamento de
Evaluación Económica. ICIDCA. (2001).
● Da Silva GP, Mack M, Contiero J. Glycerol: a promising and
abundant carbon source for industrial microbiology. Biotechnol
Adv. (2009).
● Konstantinović SS, Danilović BR, Ćirić JT, Ilić SB, Savić DS,
Veljković VB. Valorization of crude glycerol from biodiesel
production. Chem Ind Chem Eng. (2016).
● López- García, R. Citric Acid. John Wiley & Sons, Inc. EEUU.
(2002).
● Mitrea, L. Trif, M. Cātoi, A.F. Vodnar, D.C. (2017) ​Microbial cell
factories 16​(190). pp: 87-105
● Mu Y, Xiu Z-L, Zhang D-J. A combined bioprocess of biodiesel
production by lipase with microbial production of 1,3-propanediol
by Klebsiella pneumoniae. Biochem Eng J. (2008).
● Papagianni M.. Advances in citric acid fermentation by Aspergillus
niger: biochemical aspects, membrane transport and modeling.
(2007).
● Rywińska A, Rymowicz W, Źarowska B, Skrzypiński A.
Comparison of citric acid production from glycerol and glucose by
different strains of Yarrowia lipolytica. World J Microbiol
Biotechnol. (2010).
● Soccol CR, Vandenberghe LPS, Rodrigues C, Pandey A. New
perspectives for citric acid production and application. Food
Technology & Biotechnology. (2006).
● Wilkins AE, Lowe DJ. Product removal process for use in a
biofermentation system; (2004).
● Xu DB, Madrid CP, Röhr M, Kubicek CP. The infuence of type and
concentration of the carbon source on production of citric acid by
Aspergillus niger. Appl Microbiol Biotechnol. (1989).