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JEQUIÉ – BA
SETEMBRO DE 2018
1
THATIANA CARNEIRO DOS SANTOS
JEQUIÉ – BA
SETEMBRO DE 2018
2
Ao meu Deus por seu infinito amor e benevolência.
Ao meu Pai Edson e minha Mãe Rita de Cacia.
A minha família por todo amor e apoio.
Ao meu filho Diogo Carneiro, por toda compreensão
e carinho. DEDICO
3
O Senhor é a minha força e o meu escudo;
nele o meu coração confia, e dele recebo
ajuda. Meu coração exalta de alegria, e
com o meu cântico lhe darei graças.
Salmos 28:7
4
AGRADECIMENTOS
6
RESUMO
7
ABSTRACT
The application of pectinolytic enzymes produced by filamentous fungi has been increasingly
extended in several industrial processes such as textiles, vegetable fiber processing, oil
extraction, industrial waste water treatment, etc. Based on this assumption, the main
objective of this research was the production, characterization and application of
polygalacturonase (PG) produced by Aspergillus niger ATCC 1004, by submerged phase
fermentation, using the Orange residue as medium for growth of the microorganism. To
determine the optimal conditions of PG production, the experimental design used was
Doehlert, with application of surface response methodology (MSR). The PG activity in the
optimum conditions of 30 ° C, 96h and inducer concentration of 0.6 mg was 8.77 AU. PG was
thermostable to 70 ° C for a time of 30 min. PG showed activity and maximum stability at pH
4.0. The Ca 2+ ion had a stimulatory effect on the PG activity in comparison to the other metal
ions studied. The kinetic parameters were determined to be Km of 0.088398 mg / ml and Vmax
55,248 μmol / ml / min. After purification the molecular weight of the PG was approximately
45 kDa. The PG produced was applied to reduce the viscosity of the umbu pulp, achieving an
approximate reduction of 28.17% relative to the control viscosity
8
SUMÁRIO
1 - Introdução........................................................................................................ 14
2 – Objetivos......................................................................................................... 17
3 - Revisão Bibliográfica....................................................................................... 18
Resumo.................................................................................................................... 35
9
4.2.6 - Determinação de Poligalacturonase .......................................................... 40
4.2.10 - Eletroforese............................................................................................... 44
64
Resumo...................................................................................................................
10
5.1- Introduçâo...................................................................................................... 65
5.2.1 – Enzimas..................................................................................................... 67
5.4 - Conclusão........................................................................................................ 76
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 02: Modo de ação das enzimas poligalacturonases; hidrólise das ligações
glicosídicas α-(1→4) dos resíduos de ácidos
25
poligalacturônicos.........................................................................................................
Figura 04: etapas do preparo do Indutor: a) Resíduo de laranja; b) cortes para serem
acondicionados na estufa com circulação de ar, c) Resíduo seco; d) após o processo 38
de moagem....................................................................................................
Figura 05: Processo de fermentativo (Incubação) ...................................................... 39
Tabela 02: Matriz de Doehlert com valores reais (entre parênteses) finais
codificados para os fatores: concentração do indutor (X1) e Tempo (h) e a
resposta: atividade do PG (UA, μmol/min) .............................................................. 47
13
atm – Atmosfera
°C – Graus Celsius
DNS: Ácido 3,5 – dinitrosalicílico
Endo-PGs: Endo- Poligalacturonases
Exo-PGs: Exo-Poligalacturonases
FDA – Fibra em Detergente Ácido
FDN – Fibra em Detergente Neutro
GalA – Ácido Galacturônico
PGs: Poligalacturonases
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
LABRA - Laboratório de Aproveitamento de Resíduos Agroindustriais
MM – Matéria Mineral
MS – Matéria Seca
Rpm – Rotação por minuto
R2 – Coeficiente de Determinação
SDS - (Docecil Sulfato de Sódio)
1 INTRODUÇÃO
14
Os setores agroindustriais e de alimentos produzem grandes quantidades de
resíduos. A observação ao longo dos anos demonstrou que esse material pode
apresentar elevado problema de disposição final, tornando-se, um potencial poluente
para o meio ambiente, além de representar, maiores perdas de biomassa e de
nutrientes de alto valor agregado. Em contrapartida, na atualmente estes detritos
estão cada vez mais sendo reaproveitados, uma vez que estas matérias-primas
apresentam características bioquímicas que podem ser utilizadas como fontes para
biossínteses de produtos úteis (Ahmed, 2016). O Brasil detém o título de maior
produtor e exportador do suco frutas tropicais e durante o processamento destas
frutas, as cascas e sementes correspondem de 65 a 70% da massa, o que faz com
que este tipo de indústria gere toneladas de resíduos de processo (Dias, 2017; Ferrari
e col., 2004).
Dentre estas frutas podem-se destacar os citrinos (laranjas, tangerinas, lima,
toranja e limões) sendo que, essas espécies estão entre as culturas de rendimento
mais importantes nas zonas tropicais e subtropicais. Desta forma, o consumo de
laranjas frescas tem aumentando exponencialmente em muitos países em
desenvolvimento, como México, Índia, Argentina, Brasil e China (Sharma, 2017).
Segundo dados do IBGE, a perspectiva de plantio de laranja no ano de 2017 é de 15
983 273 hectares plantados, produção de 14 653 571 toneladas em 2017 (IBGE,
2017).
Cerca de 40% de toda a produção de laranja mundial são convertidas em suco
concentrado, sendo que os Estados Unidos e o Brasil produzem 90% do suco de
laranja processado, no entanto, apenas 50% do peso bruto da fruta é convertido em
suco; o resto é considerado o subproduto (Okino-Delgado, 2014). O Brasil é o maior
produtor de suco de laranja no mundo, seguido por EUA (Lerma-García, 2016).
O desenvolvimento de processos eficientes, com potencial para agregar valor
aos resíduos agroindustriais, torna-se um dos maiores desafios da biotecnologia.
Atualmente o uso de resíduos como fonte de matérias primas de autovalor agregado,
veem’ sendo utilizado cada vez mais para a produção de produtos como etanol,
proteína monocelular, enzimas, ácidos orgânicos, aminoácidos, metabolitos
secundários biologicamente ativos, etc. (Diaz, 2016).
15
No entanto os resíduos de cítricos na maioria das vezes não possuem valor
econômico, apesar de sua composição ser rica em açúcares solúveis, celulose,
hemicelulóse, pectina e óleos essenciais que poderiam formar a base de vários
processos industriais. Em virtude desses fatores, esses subprodutos industriais
podem ser utilizados como matéria prima para produção de ração animal, Óleos
Essenciais, Pectinas, Bioetanol e produção de Enzimas; desta forma agregando valor
econômico ao mesmo. Uma forma de agregar valor aos resíduos da agroindústria é a
produção de enzimas. Estas são proteínas especializadas que funcionam na
aceleração de reações químicas e utilizadas como catalisadores biológicos
extremamente eficientes (Mamma, 2014).
Enzimas são compostos bioativos que regulam muitas mudanças químicas em
tecidos vivos. As pectinases são um grupo heterogêneo de enzimas relacionadas com
a hidrólise das substâncias de pectina, presentes principalmente em plantas. A
aplicação de enzima pectinolítica varia de acordo com a disponibilidade de condições
físicas. Com o passar do tempo, as pectinases têm sido utilizadas em vários processos
industriais convencionais, tais como têxtil, processamento de fibras vegetais, chá,
café, extração de óleo, tratamento de águas residuais industriais, contendo material
pectinoso, etc. (Sharma, 2012; Mamma, 2014).
O processo desenvolvido no cultivo para a produção de enzimas dá-se a partir
de processos fermentativos, estes podem variar dependendo da espécie de
microrganismo utilizado, do substrato que está sendo fornecido e dos tipos de
enzimas. Várias espécies de fungos filamentosos têm sido utilizadas em processos
industriais para a produção de metabólitos e enzimas, como ácido cítrico e
glucoamilase. As vantagens do uso de fungos filamentosos incluem suas habilidades
naturais para secretar uma variedade de proteínas em grandes quantidades e seu uso
intensivo no bioprocessamento (Li, 2008).
A pectina é responsável pela turbidez e consistência do suco; por esta razão, a
degradação das substâncias específicas requer a adição de enzimas pectinolíticas
apropriadas para aumentar o rendimento da clarificação do suco, reduzir a
viscosidade e diminuir o tempo de filtração (Sassi, 2016). As pectinases
desempenham um papel crucial para reduzir a viscosidade, aumentar o rendimento e
clarificação do suco por liquefação de polpas (Garg, 2016). Sendo produzidas tanto
por microrganismos procarióticos, que sintetizam principalmente pectinases alcalinas,
16
como por microrganismos eucarióticos, tais como fungos, que sintetizam pectinases
ácidas. A produção máxima de pectinase de Aspergillus níger foi obtida usando como
substrato casca banana, de laranja e abacaxi, farelo de trigo e amido de batata como
substrato (Pedrolli, 2014).
Desta forma percebesse que, o uso de enzimas no mercado de suco é de suma
importância. Uma vez que, as polpas de frutas sem o tratamento enzimático podem
ter baixa aceitação no mercado por conta de seu aspecto e são difíceis de pasteurizar
e concentrar. Deste modo, as enzimas são aplicadas para a degradação de todos os
carboidratos poliméricos permitindo assim, um melhor processamento da polpa e
máximo de rendimento das substâncias contidas no fruto, obtendo um melhor
rendimento de extração, e garantindo um aspecto conforme os padrões de qualidades
exigidos do mercado consumidor (Rosmine, 2017).
O uso de fungos filamentosos para a produção de poligalacturonase por
fermentação submersa é de suma importância, pois a utilização de resíduos da
agroindústria como meio de crescimento para microrganismos, tem como objetivo
retirar esses resíduos do meio ambiente, uma vez que estes, na maioria das vezes
são descartados em lixões e aterros. Partindo deste pressuposto, este trabalho busca
propor um caminho alternativo para utilização de resíduos agroindustriais, buscando
diminuição de possíveis problemas ambientais que estes venham a gerar, bem como,
agregar valores para essa matéria-prima, por meio da produção de substâncias de
interesse econômico. Partindo deste pressuposto, este trabalho tem como principal
objetivo a produção de poligalacturonase a partir do resíduo de laranja Pera,
produzida por Aspergillus niger ATCC 1004, buscando a diminuição de possíveis
problemas ambientais que estes resíduos venham a gerar, bem como, agregar valores
para essa matéria-prima por meio da produção de substâncias de interesse
econômico.
2 OBJETIVO GERAL
17
Produção e caracterização da poligalacturonase produzida pelo fungo Aspergillus
niger ATCC 1004 por fermentação em fase submersa utilizando com fonte de carbono
o resíduo da Laranja Pera (Citrus sinensis L. Osbeck).
18
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
19
Originária da Ásia, especialmente da China e do arquipélago malaio, as mudas
de laranja chegaram pela primeira vez no Brasil no século XVI com os portugueses,
que as plantaram ao longo da costa. Entre as variedades, a laranja Pera ou doce
(Citrus sinensis L.Osbeck) se destaca, por ser uma fruta de casca fina, sabor doce,
aroma característico, agradável e baixa acidez (Silva e col., 2016).
A laranja pode ser ingerida frescas ou processadas, o seu suco ou casca
perfumada, têm sido valorizadas por suas propriedades nutritivas saudáveis e, em
virtude de sua abundância em vitaminas, antioxidantes e minerais, tendo benefícios
para a saúde comprovada (Lerma-García, 2016). Considerada como uma das culturas
mais importantes e com alto rendimento nas zonas tropicais e subtropicais e países
em desenvolvimento, como México, Índia, Argentina, Brasil e China. Tendo o Brasil
como maior produtor mundial de laranja doce. O mesmo processa 47% dos citrinos
do mundo (o principal país processador de citrinos do mundo), seguido dos Estados
Unidos da América (29%) (Sharma e col., 2017).
O plantio de citros (laranja) está presente em vários estados brasileiros, sendo
que a Bahia, se destaca como segundo maior produtor de laranja, com 63.199
hectares, produzindo 994.817 toneladas de laranja (Embrapa, 2013). Segundo o
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2018), o clima favoreceu o
rendimento por hectare de laranja, que cresceu 4,9% de 2015 para 2016, chegando a
26.180 kg/ha, o que levou a produção nacional a 17,3 milhões de toneladas, 1,8% a
mais do que no ano anterior, a Bahia ficou na segunda posição entre os maiores
estados produtores, ultrapassando Minas Gerais, com uma produção de 1,2 milhão
de toneladas. No quadro 1, temos a previsão da produção de laranja no estado da
Bahia, na região Nordeste e a produção nacional em janeiro de 2017 segundo (IBGE,
2017).
20
IBGE/CEPAGRO -LEVANTAMENTO SISTEMÁTICO DA PRODUÇÃO AGRÍCOLA
janeiro/2017
Região Produção 2016 Perspectivas para 2017
ÁREA Plantada ÁREA Plantada
70 950 61 500
(Hec) (Hec)
ÁREA Colhida ÁREA Colhida
60 950 61 500
BAHIA (Hec) (Hec)
PRODUÇÃO PRODUÇÃO
985 650 930 000
(Ton) (Ton)
REND.MÉDIO 16 171 REND.MÉDIO 15 122
ÁREA Plantada ÁREA Plantada
32 245 116 610
(Hec) (Hec)
ÁREA Colhida ÁREA Colhida
115 406 113 301
Nordeste (Hec) (Hec)
PRODUÇÃO PRODUÇÃO
1 601 857 1 501 901
(Ton) (Ton)
REND.MÉDIO 13 880 REND.MÉDIO 13 256
PRODUÇÃO NACIONAL DE LARANJA – 667.529 hectares plantados em 2016. 663.274
perspectivas para hectares plantados em 2017. 15 983 273 toneladas em 2016 – perspectivas
para 2017 de 14 653 571 toneladas.
21
óleos essenciais. Desta forma, pesquisas que visem à valorização desses resíduos
cítricos que são produzidos em larga escala no Brasil são necessárias. Dentre os
produtos que podem ser produzidos a partir deste material que é descartado pode-se
citar a extração de óleo essencial, pectina, produção de enzimas a partir do bagaço,
bioetanol, metano, ácidos orgânicos, proteína de célula única, antioxidantes naturais,
pré-bióticos, fibras dietéticas (Mamma e col., 2014).
3.3 ENZIMAS
22
3.4 PECTINA
23
Figura 1: Estrutura simplificada da pectina. (Adaptado de BARRETO, 2016).
3.5 PECTINASE
24
As pectinases são um grupo heterogêneo de enzimas que hidrolisam as
substâncias de pectina, presentes principalmente em plantas, e estão amplamente
distribuídas em plantas superiores e microrganismos, sendo de primordial
importância, pois ajudam na extensão da parede celular e no amolecimento de alguns
tecidos vegetais durante a maturação e armazenamento. As enzimas pectinolíticas
são amplamente utilizadas em processos industriais, representando cerca de 75% das
vendas globais de enzimas que são comercializadas na indústria alimentar (Anuradha,
2014). As pectinases, são as enzimas mais importantes da indústria de suco de frutas,
formando um consórcio de enzimas essenciais para a hidrólise da pectina de tecidos
vegetais (Dey, 2014).
Esta classe de enzimas eliminam a turbidez imediata. Qualquer ação de
despectinização tem dois efeitos: degradar as pectinas solúveis viscosas e induzir a
agregação de partículas de nuvem. A pectina forma um revestimento protetor em torno
de proteínas em suspensão e carrega uma carga negativa em ambientes ácidos que
os fazem repelir uns aos outros. As pectinases degradam a cadeia das pectinas,
expondo assim proteínas positivamente carregadas. A repulsão eletrostática entre as
partículas da nuvem é assim reduzida para que elas se agreguem. (Cerreti, 2016)
A primeira aplicação comercial de pectinases foi relatada em 1930 por Kertesz
para a clarificação de suco de maçã (Garg, 2016). As pectinases produzidas por
diferentes microrganismos são classificadas em enzimas despolimerizantes e
enzimas saponificastes. As enzimas de polimerização são aquelas que catalisam a
clivagem hidrolítica das ligações α (1-4) -glicósidas nas porções de ácido D-
galacturónico das substâncias pécticas (Anarudha, 2014).
Com base no mecanismo de degradação da pectina, são classificados
principalmente a pectina esterase (PE), pectina liase (PL) e poligalacturonase (PG).
Entre eles, a PG hidrolisa α-1, 4 ligações glicosídicas da cadeia de ácido
poligalacturônico e libera resíduos de ácido galacturônico (Kant et al, 2013). As
poligalacturonases hidrolisam a cadeia do ácido poligalacturônico por adição de água
e são as mais abundantes entre todas as enzimas pectinolíticas (Sharma 2013).
3.6 POLIGALACTURONASES
25
As poligalacturonases (PGs) são as enzimas pectinolíticas mais estudadas e
utilizadas em produtos comerciais, sendo presentes em plantas, bactérias, leveduras,
fungos filamentosos e podem ser encontradas em nematoides e insetos (Sassi,2016).
Esta enzima hidrolisa as ligações glicosídicas de poligalacturonatos (pectatos)
por ambos os mecanismos de divisão exo e endo. A atividade da PG pode ser
quantificada pela medição dos açúcares redutores formados devido à hidrólise ou pelo
método de redução da viscosidade (Sharma, 2013). É classificada como glicosil
hidrolases, com base no modo de ação classificado como Endo-PGs EC (3.2.1.15) e
Exo-PGs EC (3.2.1.67) (Anand, 2017). As endo-PGs atuam na síntese de
oligossacarídeos de curto tempo de polimerização, como os ácidos tetra e tri-
galacturônico, obtidos como produtos da hidrólise final quando atuam sobre ácido
poligalacturônico (PGA), as exo-PGs atua sintetizando principalmente ácidos mono e
di-galacturônicos (Tounsi 2016).
As exo-PGs catalisam a clivagem de α-1,4-ligações de ácido poligalacturônico
e regiões homogêneas de proteínas, como mostra a figura 2. Sendo que as Ex-PGs
catalisam a libertação hidrolítica do resíduo de ácido galacturónico saturado a partir
de sua extremidade não redutora de homogalacturonan, sendo produzidas por
bactérias e fungos. As exo-PGs fúngicas produzem o ácido monogalacturônico como
o principal produto final e possuem pH ótimo de 4.0 - 6.0 (Anand, 2017; Sassi, 2016).
Figura 2: Modo de ação das enzimas poligalacturonases; hidrólise das ligações glicosídicas α-(1→4)
dos resíduos de ácidos poligalacturônicos. (Adaptado de BARRETO, 2016).
27
possui um custo de recuperação do produto satisfatório em relação à concentração
em um caldo de fermentação (Viniegra, 2003).
Na fermentação submersa, é utilizado o meio liquido que contem fontes de
nutrientes para o desenvolvimento do microrganismo, que se dá em presença de água
livre, sendo o conteúdo de água superior a 95% (Orlandelli, 2012). Esta agrega
vantagens no controle do processo e possui fácil recuperação de enzimas
extracelulares, micélios ou esporos.
A fermentação submersa apresenta algumas vantagens em relação a
fermentação em estado sólido que apresentam algumas dificuldades, como por
exemplo: os microrganismos que crescem em baixos níveis de umidade, a dificuldade
para a remoção do calor gerado pelo processo de respiração do microrganismo,
dificuldade no controle de umidade, pH, oxigênio, gás carbônico e produtos formados,
etc. (Phandey,1991).
A produção de enzimas por fermentação submersa é preferida pela indústria
devido ao melhor controle de parâmetros de todo o processo de produção. O ponto
importante para este tipo de processo é que parâmetros como temperatura, agitação,
aeração, espuma, pH entre outros fatores podem ser facilmente controlados,
dependendo do tipo de reagente específico. A mesma apresenta vantagens em seu
processo e a base tecnológica bem estabelecida para escalar em produção industrial,
este fato se dá principalmente devido ao controle de pH, temperatura, oxigênio e
disponibilidade de nutrientes, dentre outra vantagem em relação à fermentação em
estado solido (Hansen, 2015).
No quadro 2 abaixo, temos a comparação entre as fermentações no estado
sólido e a submersa, de acordo com Paris (2008):
Meio de cultura não flui livremente Meio de cultura sempre flui livremente
28
Aeração requer elevado fluxo Fácil aeração e grande área de contato
ar/substrato
Substrato tampão Fácil controle de pH
29
Sendo de fácil cultivo, e por secretarem suas enzimas de forma extracelulares
diretamente no meio de produção, evitando assim, a ruptura celular para sua
liberação. (Martins, e col., 2014). Outro ponto que merece destaque é o fato destes
fungos crescerem em substratos relativamente baratos sendo capazes de produzir e
secretar quantidades notáveis de proteínas recombinantes (Madhavan, 2017).
O fungo filamentoso Aspergillus niger tem-se tornado uma cepa amplamente
utilizada para uma gama de diversos processos industriais no ramo alimentício e
farmacêutico (Wucherpfennig e col., 2012). Partindo deste aspecto, o Aspergillus níger
veem sendo objeto de pesquisa e uso industrial há várias décadas. Se desenvolve na
forma de coagulo ou agregação, conforme a figura 3, onde seu cultivo se dá por
agregados de esporos e hifas que crescem em pellets, esse processo de formação
ocorre no estágio inicial do cultivo, formando agregados que consistem em esporos e
hifas (Kelly 2004).
30
tendo um uso estável na produção de enzimas e ácidos orgânicos (Florencio e col.,
2016).
31
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36
4 - PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA POLIGALACTURONASE
TERMOESTÁVEL DE ASPERGILLUS NIGER ATCC 1004 OBTIDA DO
RESÍDUO DA LARANJA PERA (CITRUS SINENSIS L. OSBECK)
Resumo
Neste trabalho, foi investigado o uso do resíduo da laranja Pera (Citrus sinensis L.
Osbeck) como principal fonte de carbono, para a produção de poligalacturonase por
fermentação submersa utilizando o Aspergillus níger ATCC 1004. O delineamento
experimental utilizado para otimizar o processo de produção foi o Doehlert, com
aplicação da metodologia de superfície de resposta (MSR). A atividade enzimática
encontrada nas condições ótimas, em 30 ° C com 120 Rpm em 96h, tendo a
concentração de indutor de 0.6 mg, obteve um valor predito de 8,47 UA sendo o valor
real de 8.77 UA, possuindo um erro experimental de 3,5 % entre o valor predito e o
valor real. A PG de peso molecular de 45 KDa, mostrou-se termoestável até 70°C por
um tempo de 30 min. O valor de Km de 0.088398 mg/ml e Vmax de 55.248 μmol /ml
/min respectivamente.
37
4.1 INTRODUÇÃO
O Aspergillus niger ATCC 1004 utilizado neste trabalho foi doado pela Coleção
de Microorganismos de Referência em Vigilância Sanitária (CMRVS, Fundação
Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brasil). O cultivo dos microorganismos
foram feitos em placas de Petri utilizando meio PDA (Potato dextrose Agar) (Himedia,
Mumbai, Índia) a 30 °C. A solução estoque foi armazenada a 4 oC até o início dos
experimentos.
Figura 4: etapas do preparo do Indutor: A) Resíduos de laranja; B) cortes para serem acondicionados
na estufa com circulação de ar, C) Resíduos secos; D) após o processo de moagem. Fonte: autora
39
A B
C D
40
4.2.4 Obtenção do Extrato Enzimático Bruto
Um Projeto Doehlert de dois fatores foi desenvolvido, tendo três e cinco níveis
, num total de 9 conjuntos de experimentos (ensaios), como mostrado na figura 6,
sendo o ponto central realizado em triplicata, este planejamento foi utilizado para
determinar a concentração do indutor e o tempo de fermentação ideal para a produção
da PG por A. niger ATCC 1004. A análise da superfície de resposta baseou-se em
regressões lineares múltiplas, levando em consideração os principais efeitos
quadráticos e de interação, de acordo com a seguinte equação 1.
Figura 6: Meio de cultura para utilização otimização da produção de enzimas. Fonte: Autor
42
de reação. Os resultados foram expressos em unidades de atividade por grama de
meio úmido fermentado (U/A), conforme equação 2.
Equação 2. Sendo:
Equação 3 sendo:
Um Projeto Doehlert de dois fatores foi desenvolvido, tendo três e cinco níveis
, num total de 9 conjuntos de experimentos (ensaios), sendo o ponto central realizado
em triplicata, para determinar o pH e a temperatura ideal. A análise da superfície de
resposta baseou-se em regressões lineares múltiplas, levando em consideração os
principais efeitos quadráticos e de interação, de acordo com a seguinte equação 4.
(4)
43
em que Y é a resposta prevista; βo, a constante; β1 e β2, os efeitos lineares;
β11 e β22, os efeitos de segunda ordem; e β12, o efeito de interação entre as variáveis
1 e 2. O pH ótimo da atividade da Poligalacturonase foi ensaiado em pH 3,0, 4,0, 5,0,
6,0 e 7,0. A atividade da PG foi testada sob condições padrão de ensaio sob a faixa
de temperatura de 30, 50 e 70 ° C para determinar a temperatura ótima. As
temperaturas foram controladas usando banho de água Maria (Cientec CT-266, Belo
Horizonte, Mg, Brasil), em seguida a atividade da PG foi determinada conforme o item
4.2.6.
4.2.9 PURIFICAÇÃO
O extrato enzimático bruto foi aplicado a uma coluna Sephadex G-100 (20x 1,0
cm) (Sigma), previamente equilibrado com tampão fosfato de sódio (0,05mol L-1, pH
45
7,0), que também foi usado como eluente. Foram coletadas frações de 1,5 ml e
verificado a quantidade de proteína pelo método de Bradford.
Seguidamente foi realizada uma nova leitura no espectrofotômetro (BEL
Photonics SP 2000 UV) de proteínas totais, as frações que apresentaram proteínas,
foram lidas novamente com DNS para determinação de poligalacturonase (Byrne,
2017; Yu, 2017). O fator de purificação (X) foi usado como a medida da purificação
proporcionada pelo fracionamento, sendo definido conforme a Equação 5.
4.2.10 Eletroforese
47
utilizando os fungos em especial do gênero Aspergillus em processos fermentativos.
(RIVAS e Col., 2008).
Hemiceluloses são utilizadas na produção de enzimas, e produtos de
fermentação, no entanto uma alta concentração de hemicelulose não favorecerá a
hidrolise enzimática (GUERRIERO e Col., 2016). Desta maneira, nota-se que o valor
de 5,91%, será favorável para a produção de enzimas a partir da utilização de farelo
da casca de laranja.
O resíduo de laranja apresentou um teor de proteína bruta de 15.77%. O
resultado para FDN chegou próximo do encontrado por Cavichiolo (2015) que foi de
21.76% sendo este resultado para o resíduo úmido em comparação com obtido neste
estudo que foi analisado a partir do resíduo seco utilizado nesta pesquisa que foi de
20.90%. Este resultado demonstra que o nível de FDN para o extrato seco não obteve
perda relevante.
A partir dos dados apresentados na tabela 1, o resíduo da laranja possui uma
boa quantidade de nutrientes, que são essenciais para sua utilização como
suplemento para a produção de enzimas extracelulares.
UA
Ensaios Indutor (mg) Tempo (min) Real Predito
49
Analisando os gráficos de superfície de resposta figura 7- A, pode-se observar
que o mesmo se apresenta como uma função quadrática de concavidade voltada para
baixo apresentando, um ponto de máximo.
A avaliação do modelo foi feita também através da ANOVA (Análise de
Variância), que estima a significância dos efeitos principais e das interações entre as
variáveis com nível de confiança de 95%. O teste F apresenta a razão entre o F
calculado e o F tabelado. Sempre que esta relação for maior que 1, a regressão é
estatisticamente significativa, havendo relação entre as variáveis independentes e
dependentes, estes dados são avaliados na Tabela 3. Pois para que uma regressão
seja não apenas estatisticamente significativa, mas também útil para fins preditivos, o
valor da razão deve ser no mínimo maior que 4. (SANTOS, 2008).
Conforme a Tabela 3, a partir do teste F de Fisher verifica-se que o F calculado
(9,4) foi superior ao F tabelado (9.01), para um nível de confiança de 95% o que
corresponde a um valor de p < 0,10. Esta sugere que o modelo é estatisticamente
significativo. O modelo não apresentou falta de ajuste significativo, tendo o valor de F
calculado (14.13) inferior ao valor de F tabelado (18.51), desta maneira a regressão é
significativa. O coeficiente de correlação (R2) 0,94 indica um ajuste adequado dos
resultados dos experimentos na resposta para a produção de PG por Aspergillus níger
ATCC 1004. O modelo não apresentar falta de ajuste, os resultados obtidos podem
indicar as tendências que levam a otimização do método (Novaes, 2017).
Tabela 3: Análise de variância (ANOVA) para atividade PG.
Fonte variação SQ GL MQ F F
Calculado Tabelado
Regressão 21.13476 5 4.226952 9.400 9.01
50
Resíduos 1.349 3 0.449667
R2 0.94
2
SQ=Somados Quadrados; GL=Graus de Liberdade; QM=Quadrado Médio;F=Teste de Fisher; R =
Coeficiente de Determinação.
51
De acordo com o planejamento experimental adotado, as condições ótimas para
produção da PG foram com 96 h de fermentação e concentração de indutor de 0.6
mg, obtendo assim um valor predito de 8,47 UA. O valor predito foi validado através
de um experimento em triplicata encontrado um valor real de 8.77 UA, com um erro
experimental de apenas 3,54 %.
4 . 3 . 3 Caracterização Enzimática
4.3.3.1 pH x Temperatura
Tabela 04: Matriz Doehlert usada para a otimização do pH e temperatura da PG de Aspergillus niger
ATCC 1004
UA
Ensaios Temperatura (°C) pH
52
Real Predito
Valores codificados e reais das variáveis independentes em função da variável temperatura e pH.
Esta equação ilustra a relação entre essas duas variáveis independentes (pH e
temperatura) em relação a vareiavel dependente para atividade enzimática da PG em
(UA). Os dados obtidos geraram a superfície de resposta e o gráfico de curva de níveis
apresentados abaixo figura 9.
53
A) B)
54
temperatura de 70 °C. Estes dados demonstram que a PG de Aspergillus niger tem
caráter ácido. Resultados similares de PG ácidas foram encontrados por Ahmed
(2016), em seu trabalho obteve um pH de 5,5 para pectinase suplementada com casca
de laranja, sob processo de fermentação submersa por Aspergillus niger. Outros
autores também produziram PG ácidas, tais como: Byrne, (2017) onde o mesmo
obteve um pH ótimo de 4 para PG de Aspergillus kawachii, cultivada em bagaço de
limão.
Sandri (2015), relata em seu estudo que valores de pH iniciais mais baixos (3,0
e 4,0) em 60°C resultaram em maiores atividades de poligalacturonase de Aspergillus
fumigatus. Mahesh (2016), obteve condições ideais para a produção de pectinase em
pH, 4,0 a temperatura 40 ° C para o Aspergillus ibericus. Desta forma, nota-se que o
fungo do gênero Aspergillus consegue produzir PG ácidas em variadas temperaturas.
Segundo Anand (2017), poligalacturonases microbianas tem seu pH ótimo na faixa
ácida, sendo utilizadas para extração e clarificação de sucos de frutas. Partindo deste
pressuposto, é notório que, fungos do gênero Aspergillus possuem a características
de produzir PGs ácidas.
55
A partir da análise da figura 10, percebe-se que, ocorreu um aumento superior
a 100% na atividade da PG com a adição de íons de Ca2+, conforme ocorre o
aumento da concentração deste íon. Barreto (2016), em sua pesquisa, conseguiu um
aumento de 94% da atividade da PG utilizando íons de Ca²+. Este fato se deve porque
os íons metálicos são considerados um cofator enzimático, atuando favoravelmente
com a enzima, estabilizando suas estruturas, evitando sua desnaturação, em outros
casos esses íons podem estimular ou mesmo inibir a atividade enzimática
(Lehninger, 2011; Silva, 2016; Rehman, 2015; Coutinho, 2017). Os íons metálicos
divalentes como o Ca2+, Zn2+ e Mg2+ estimulam a atividade do PG, provavelmente
estabilizando os grupos carboxilo negativamente carregados nas pectinas
(Prasanna, 2006).
Para os demais íons estudados, o gráfico demonstra que os íons Na+, em
qualquer concentração, não favoreceu significativamente a atividade enzimática nas
condições estudadas, apenas os íons de k+ na concentração de 0,05 mol/L e Fe2+
nas concentrações de 0,15, 0,20 mol/L possui uma influência na atividade da PG.
Desta maneira, o tipo de interação entre cátions e as enzimas é dependente de
cátions envolvidos (Rashad, 2010; Celus, 2017).
4.3.3.3 Termoestabilidade da PG
56
(10, 20 e 30 min.), retirando-se alíquotas durante o tempo de incubação determinado.
As alíquotas retiradas foram submetidas a ensaios conforme descrito no item 4.2.6. A
partir da análise da figura11, é evidente que, até a temperatura de 70°C, a atividade
residual da PG manteve-se superior a 50%. Sendo que em temperaturas superiores
a 70°C a atividade da PG começa a declinar, conforme demostrado na figura 11. Desta
forma, a partir da análise destas temperaturas, esta enzima mostra-se termoestável
em uma temperatura em torno 70°C em um tempo de aquecimento de 30 min.
Outros pesquisadores obtiveram a produção de PG em temperatura próximas
a deste estudo, dentre os quais pode-se destacar: Ma, e col.(2017), em seus estudos
relata a produção de exo-poligalacturonase de Aspergillus niger SW06 com
estabilidade abaixo de 60º C. já Tounsi (2016), trabalhando com Penicillium occitanis
e Li (2017) realizando estudos com Talaromyces leycettanus, ambos obtiveram PG
termoestável com temperaturas em torno de 70° C. Desta maneira, a produção de
poligalacturonase com características termoestáveis é de grande interesse para a
indústria, por possuirem uma vasta aplicação nos processos de extração de sucos de
frutas e pasteurização de sucos, na indústria de processamento de material vegetal,
no processamento e desengomagem de fibras têxteis (Gomes 2007).
57
A afinidade da PG pelo substrato utilizado foi avaliada através dos resultados
de Km e Vmax. A Figura 12, apresenta um gráfico de Lineweaver-Burk para a
determinação dos parâmetros cinéticos.
0.25
0.2
0.15
1/UA
0.1
0.05
0
-50 0 50 100 150
-0.05
1/concentração
58
4.4 Purificação da PG
4.5 Eletroforese
4.6 CONCLUSÃO
60
aproximadamente 45KDa e uma afinidade considerável ao substrato, com valor de
Km = 0.088 (mg.mL-1) e Vmax = 55.248 (μmol / mL / min). Após a caracterização da
PG, foi realizada a purificação encontrando uma atividade específica no valor de 9,23
U/mg. Desta maneira, mostrando-se uma enzima com características satisfatórias
para uma aplicação no mercado, possuindo uma produção utilizando resíduos de
baixo custo e alto valor agregado.
61
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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65
CAPITULO 5 - APLICAÇÃO DE POLIGALACTURONASE DE
ASPERGILLUS NIGER ATCC 1004 OBTIDA DO RESÍDUO DA
LARANJA (CITRUS SINENSIS L. OSBECK) PARA DIMINUIÇÃO DE
VISCOSIDADE DE POLPA DE UMBU (SPONDIAS TUBEROSA
ARRUDA CÂM)
Resumo
Este trabalhou avaliou a aplicação de enzimas para a redução da viscosidade da polpa
de umbu (Spondias tuberosa Arruda Câm), a enzima Poligalacturonase produzida por
Aspergillus níger ATCC1004, através da fermentação submersa, utilizando como fonte
de carbono os resíduos da laranja Pera (Citrus sinensis L. Osbeck), e a enzima
comercial Pectinase (Sigma-Aldrich,São Paulo, Brasil). Para avaliação dos resultados
da viscosidade foi utilizado um planejamento experimental Doehlert contendo duas
variáveis e três repetições no ponto central, levando a um total de 9 experimentos. A
polpa de umbu utilizada como controle apresentou uma viscosidade de 2.190 cP, após
a aplicação da poligalacturonase purificada por sulfato de amônio, produzida por
AspergillusNiger ATCC 1004, ocorreu uma diminuição de aproximadamente 28,17%
na viscosidade (1.573 cP) em relação a polpa controle.
66
5.1 INTRODUÇÂO
67
mais complexo da natureza (Paniagua, 2017). É responsável pela turbidez e
consistência do suco; provocando deste modo um aumento na viscosidade
prejudicando a clarificação e a filtração; desta forma, a degradação da pectina requer
a adição de enzimas pectinolíticas apropriadas para aumentar o rendimento da
clarificação do suco, reduzir a viscosidade e diminuir o tempo de filtração (Sassi,
2016).
As pectinases, em especial a poligalacturonase (E.C.3.2.1.15) são um grupo
enzimático envolvido na catálise e degradação da pectina durante as reações de
despolimerização e desesterificação, com a quebra das ligações α-1,4-glicosídicas do
ácido galacturônico, tendo uma aplicação comercial na produção de sucos de frutas
e vinhos, principalmente para clarear suco e melhorar a prensagem e extração de
suco de frutas e vegetais (Rajdeo, 2016; De Oliveira, 2018). Desempenham um papel
crucial para reduzir a viscosidade, aumentar o rendimento e estabilização do suco por
liquefação de polpas, remover as cascas (Garg, 2016).
Os produtos derivados de frutas (néctar, polpas concentradas, sorvete), são
constituídos por um sistema bifásico, compostos por partículas sólidas dispersas no
meio. Para controle e desenvolvimento de produtos beneficiados pela a indústria, a
obtenção das características reológicas é um fator relevante no controle de qualidade,
processo e concepção das linhas de processamento e desenvolvimento de novos
produtos nas indústrias de alimento (Bezerra, 2013; Rodrigues, 2016). O
comportamento reológico de produtos alimentares envolvendo diferentes
hidrocolóides, dentre este a pectina, tem sido estudado usando medidas reológicas
fundamentais, considerando o seu papel no ajuste da viscosidade e textura das
formulações de alimentos de um modo em geral (Cevoli, 2013).
Deste modo, o objetivo deste trabalho foi investigar a aplicação da enzima PG
produzida por Aspergillus níger ATCC ATCC 1004, através da fermetação submersa
utilizando o residuo da laranja pera (Citrus sinensis L. Osbeck) para reduzir a
viscosidade da polpa de umbu (Spondias tuberosa Arruda Câm), comparando a
atuação da mesma em relação a enzima comercial (Sigma-Aldrich,São Paulo, Brasil).
5.2.1 Enzimas
68
Foi adquirida a enzima comercial Pectinase (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil)
para efeito de comparação com a poligalacturonase (PG) produzida por Aspergillus
Níger ATCC 1004 a partir do resíduo da laranja (Citrus sinensis L. Osbeck) a partir da
fermentação em fase submersa; ambas utilizadas para a aplicação em polpa de umbu,
utilizando a adaptação da metodologia para suco de uva aplicada por Rizzon, (2007)
para propor as concentrações enzimáticas.
Figura 14: Etapas do processo de produção de polpa de fruta congelada. (Adaptado de Da Matta,
2015)
O extrato enzimático bruto obtido foi levado a 70% de saturação por adição de
amônia sólido e deixado em overnight. Após o processo de overnight, o extrato foi
submetido levado a centrifugação em centrífuga (TECNAL) em 6000rpm por 15
minutos, em seguida o precipitado obtido foi resuspenso com tampão fosfato-citrato
pH 7. Em seguida foi feito a medida de açúcares redutores e proteínas totais.
70
A redução da viscosidade foi expressa em % de redução, calculada com base
na medida da viscosidade (Visc) do suco controle (sem adição de enzima) e do suco
tratado (com adição de enzima), de acordo com a equação 6.
(6)
71
Tabela 7: Planejamento experimental para aplicação da pectinase comercial Sigma
Viscosidade (cP)
Ensaios Concentração (µl) Tempo (min)
Real Predito
Um modelo polinomial de segunda ordem (com p < 0.05) foi obtido através da
análise de regressão de acordo com a equação 1.
Figura 16: Superfície de resposta enzima Sigma, em função concentração enzimática e do tempo.
72
Analise do gráfico de Pareto para a Enzima Comercial na figura 17, admitindo
em um nível de confiança de 95%. Demonstra que a concentração de enzima
comercial (Sigma), foi quadraticamente significativo. Já o efeito do tempo, tanto linear
como quadrático foi insignificante. Deste modo, o modelo quadrático explica de forma
melhor do que o modelo linear para estes resultados.
73
Para avaliação de ajuste do modelo empregado, os resultados foram tratados
seguindo a análise de variância (ANOVA). Conforme a Tabela 08, a partir do teste F
de Fisher verifica-se que o F calculado (11.027) foi superior ao F tabelado (9.013),
para um nível de confiança de 95% o que corresponde a um valor de p < 0,05. Sugere
que o modelo é estatisticamente significativo. O modelo não apresentou falta de ajuste
significativo, tendo o valor de F calculado (1.129) inferior ao valor de F tabelado
(18.51), desta maneira a regressão é significativa. O coeficiente de correlação (R²)
0,99 indica um ajuste adequado dos resultados do experimento em resposta a
aplicação da enzima industrializada Sigma na aplicação para a diminuição da
viscosidade da polpa de umbu.
Tabela 08: Análise de variância (ANOVA) para a atividade pectinase Sigma em função da
concentração x tempo.
Fonte variação F F
SQ GL MQ
Calculado Tabelado
Regressão
164478.000 5 32895.6 11.027 9.013
Resíduos
8949.000 3 2983
Falta de Ajuste
418.00 1 4818.000 1.129 18.512
Erro Puro
8531.00 2 4265.000
Total 173427.000 8
R² 0.99
SQ=Somados Quadrados; GL=Graus de Liberdade; QM=Quadrado Médio;
2
F=Teste de Fisher; R = Coeficiente de Determinação.
Tabela 09: Planejamento experimental para aplicação da PG, produzida por Aspergillus níger ATCC
1004. Valores para a determinação da viscosidade, codificados e reais das variáveis independentes em
função da variável concentração (µl) e tempo (min).
75
Um modelo polinomial de segunda ordem (com p < 0.05) foi obtido através da
Figura 18: Superfície de resposta da poligalacturonase produzida por Aspergillus Níger ATCC 1004,
em função concentração enzimática e do tempo.
76
Analise do gráfico de Pareto na figura 19, admitindo em um nível de confiança
de 95%, demonstra as variáveis tempo e concentração de enzima PG produzida em
laboratório, foram quadraticamente significativos, ressaltando que a variável
concentração nos termos linear e quadrático foi significante. Desta forma as duas
variáveis investigadas influenciam no modelo proposto. Sendo assim o modelo
quadrático explica de forma melhor do que o modelo linear para estes resultados.
Figura 19: Gráfico de Pareto Enzima Laboratório
Tabela 10: Análise de variância (ANOVA) para a atividade poligalacturonase produzida por Aspergillus
niger ATCC 1004 em função da concentração x tempo.
Fonte variação SQ GL MQ F F
Calculado Tabelado
Regressão
0.251 5 0.050 17.812 9.013
Resíduos
0.0084 3 0.00281
Falta De Ajuste
0.0066 1 0.0066 7.349 18.512
Erro Puro
0.00 2 0.00090
Total 0.259 8
R² 0.96
SQ=Somados Quadrados; GL=Graus de Liberdade; QM=Quadrado Médio;
2
F=Teste de Fisher; R = Coeficiente de Determinação.
.
5.4 CONCLUSÃO
79
5.5 - AGRADECIMENTOS
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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