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Utilización de un extracto alcohólico de Neem

(Azadirachta indica A. Juss.) para el control de


Galleria mellonella (L.) (Lepidoptera: Pyralidae).

Memoria presentada como parte de los


requisitos para optar al título de
Ingeniero Agrónomo

Luisa Contreras Núñez


Valdivia – Chile
2009
PROFESOR PATROCINANTE:

____________________________________
Maritza Reyes C.
Ing. Agrónomo, M. Sc. Dr. Cs. Agr.
Instituto de Producción y Sanidad Vegetal.

PROFESORES INFORMANTES:

___________________________________
_
Miguel Neira C.
Ing. Agrónomo.
Instituto de Producción y Sanidad Vegetal.

___________________________________
Laura Böhm S.
Ing. Agrónomo.
Instituto de Producción y Sanidad Vegetal.
i

INDICE DE MATERIAS

Capítulo Página

RESUMEN

SUMARY

1 INTRODUCCIÓN 1

2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3

2.1 Galleria mellonella L. 3

2.1.1 Morfología 3

2.1.2 Ciclo biológico 4

2.1.3 Daño causado por Galleria mellonella 6

2.2 Formas de control 6

2.2.1 Control aplicado 7

2.2.2 Control natural 8

2.3 Azadirachta indica A. Juss. 9

2.3.1 Características morfológicas 10

2.3.2 Propiedades y utilización 11

2.4 Extracto alcohólico de Neem 12

2.4.1 Elaboración 12

2.4.2 Modo de acción 13

3 MATERIAL Y MÉTODO 15

3.1 Lugar del ensayo 15

3.2 Material biológico 15

3.3 Material de laboratorio 15


ii

3.4 Dieta 16

3.5 Metodología 16

3.5.1 Diseño experimental 18

3.5.2 Análisis de resultados 19


4 BIBLIOGRAFÍA 19
iii
1

1 INTRODUCCIÓN

La sanidad es uno de los factores más importantes para el logro de una buena
producción en cualquier actividad agropecuaria. La apicultura no escapa a esta regla,
ya que son numerosas las enfermedades que afectan a las abejas en sus diferentes
estados, debilitando las poblaciones en las colmenas. Es fundamental conocer la
enfermedad y al agente causal de ésta, con el fin de evitarla o controlarla utilizando
medidas de manejo que aseguren colmenas sanas y por lo tanto una buena
producción.

Se denominan enemigos o antagonistas de las abejas, a aquellos organismos que en


asociación con éstas ocasionan daños en los panales, como la polilla mayor de la cera
(Galleria mellonella L.), o alteran el comportamiento de las abejas, como el piojo de las
abejas (Braula coeca Nitzch).

La polilla mayor de la cera es considerada uno de los mayores antagonistas de las


abejas, ya que en su fase larvaria destruye de forma significativa los panales y se
encuentra distribuida en todas las regiones de mundo donde se practica la apicultura.
El control de la polilla mayor de la cera esta enfocado, básicamente en la prevención
del establecimiento en las colmenas, aunque existen numerosos productos químicos o
naturales que son efectivos en el control del insecto, como lo son las aplicaciones de
concentrados bacterianos y los extractos naturales de plantas o árboles, que poseen
cualidades insecticidas.

El árbol de Neem (Azadirachta indica A.Juss.) ha sido materia de numerosos estudios


científicos que conciernen su utilización en la medicina, la industria y la agricultura.
Hasta ahora distintas formulaciones de extractos de este árbol han sido evaluados
contra más de 500 especies de insectos y ha sido utilizado como pesticida en casi
todos los cultivos del mundo.
2

Debido a la buena eficacia mostrada por los derivados de este árbol, su aplicación en
el control de Galleria mellonella es una interesante manera de avalar su utilización
como bioinsecticida.

En esta investigación se plantea la hipótesis que el extracto alcohólico de Neem posee


cualidades insecticidas, inhibidoras del crecimiento, anti alimentarias y causa efectos
sub letales en la polilla mayor de la cera.

Como objetivo general se plantea evaluar la acción del extracto de Neem sobre la
alimentación, desarrollo y mortalidad de Galleria mellonella L.
Los objetivos específicos de éste estudio son, aplicar distintas concentraciones del
extracto sobre las larvas de la polilla mayor de la cera, criadas en dieta artificial.
Analizar los efectos producidos en los estados larvales de G. mellonella, observando
alimentación, desarrollo y mortalidad de éstas y por ultimo analizar los efectos sub
letales en el estado adulto de la polilla mayor de la cera, a través del análisis de
fecundidad de los adultos emergidos de los distintos tratamientos.
3

2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 Galleria mellonella L


Estas polillas pertenecen al orden Lepidoptera, familia de los Pyralidae y se distinguen
dos especies, Achroia grisella polilla menor o tiña verdadera y G. mellonella, polilla
mayor o falsa tiña. Las hembras son mariposas de hábitos nocturnos, de color gris,
longitud comprendida entre 8 y 17 mm y una envergadura alar que varía entre 14 y 38
mm. Las hembras de la polilla menor son más pequeñas que G. mellonella y su
envergadura alar no sobrepasa los 23 mm y su longitud es de aproximadamente 10
mm (LLORENTE, 2004).

Según WILLIAMS (1990), la polilla mayor de la cera es considerada un insecto útil, ya


que sus larvas son comercializadas en Estados Unidos y Europa para la alimentación
de peces, además de ser utilizadas en estudios de fisiología, toxicología, patología y
como huésped artificial para la propagación masiva de parásitos de dípteros e
himenópteros.

Sin embargo, la polilla mayor de la cera es por lejos la mayor peste de productos
apícolas, causando pérdidas mayores a los apicultores cada año. Infecta colonias de
Apis cerana F., A. dorsata F., y A. mellifera L. (Morse y Laigo ,1968; Shimanuki ,1981 y
Sigha ,1982 citado por WILLIAMS, 1990).

2.1.1 Morfología. WILLIAMS (1990), señala que los huevos por lo general son
blancos y lisos, algunos están cubiertos con fecas oscuras y excrementos, usualmente
miden de 12 a 20 mm de longitud y cerca de 5 a 7 mm de diámetro.
Una larva recién salida del huevo tiene un cuerpo de color blanco cremoso que se
vuelve gris a gris oscuro en la parte dorsal y lateral a medida que avanza en sus
estadíos, puede alcanzar hasta 28 mm de longitud y pesar sobre 240 mg (Hase ,1926
citado por WILLIAMS, 1990).
4

Según NEIRA (2006), las larvas de los estadíos siguientes presentan una coloración
amarillo grisáceo, con dos manchas en el primer anillo del tórax. La cabeza es de color
rojizo.

Durante el último estado larval, el insecto procede a inmovilizarse dentro de un capullo


de color blanco de unos 2,5 cm de longitud y se denomina estado de pupa, en el cual,
permanece por unos 20 días. La larva, previo a su ubicación definitiva, se ancla entre
los cuadros y el alza de la colmena, lo que produce un debilitamiento de los materiales
del marco (NEIRA y MANQUIAN, 2008).

Los adultos son de contextura pesada y bastante pequeños. Las hembras alcanzan
una longitud de 20 mm y pueden pesar como mucho 169 mg. Los machos son
consideradamente más pequeños, las polillas macho también pueden ser distinguidas
de las hembras por su color más ligero y su claro margen apical dentado de sus alas
delanteras. También, los palpos labiales de las hembras se extiende hacia adelante
dándole a la cabeza una apariencia puntiaguda. Las dos terceras partes de las alas
delanteras de los adultos de ambos sexos son más bien uniformemente oscuras, pero
las posteriores tienen aéreas claras y oscuras intercaladas irregularmente con
manchas desiguales. Dorsalmente, el tórax y cabeza son de color claro. Sin embargo,
el tamaño y color de ambos sexos disienten considerablemente a merced de la dieta
de las larvas. Los adultos de G. mellonella pueden ser más pequeños que algunas
polillas menores de la cera sí las larvas se han desarrollado lentamente como resultado
de una escasa alimentación y bajas temperaturas (WILLIAMS, 1990).

2.1.2 Ciclo biológico. El comportamiento reproductivo de G. mellonella no es el típico


de lepidópteros, sino que la hembra busca al macho. El macho libera una feromona de
dos componentes (nonanal:undecanal, 7:3) y cortos pulsos ultrasónicos para atraer a
las hembras (WILLIAMS,1990).

El insecto pasa por los estados de huevo, larva, pupa y adulto. Su ciclo biológico es
variable, en óptimas condiciones de temperatura (26-38ºC) puede durar entre 39 a 60
días y hasta cinco meses con temperaturas más bajas (NEIRA, 2006).
5

WILLIAMS (1990), señala que la hembra comienza a poner huevos aproximadamente


cuatro a diez días después de haber emergido. Puede poner hasta 1.500 huevos en su
corta vida de siete a quince días (NEIRA, 2006).
Los huevos se desarrollan rápidamente con una temperatura cálida y sostenida (29-
30ºC) y comienzan a incubar tres a cinco días después de la oviposición. La incubación
de los huevos puede extenderse hasta 30 días a 18ºC. Cortas exposiciones a
temperaturas extremas (46ºC por 70 minutos, o a bajo 0ºC por 270 minutos) causarán
100% de mortalidad de huevos (WILLIAMS, 1990). La etapa larval puede extenderse
desde un mes hasta un máximo de cinco meses, dependiendo de la temperatura
ambiente, concluido este periodo, la polilla inicia es estadio de pupa, en el que
permanece alrededor de una semana, inmóvil dentro de un capullo (el que ha
confeccionado en su estado larval), y que es de un definido color blanco (NEIRA,
2006).

Adulto pone entre 400


a 1800 huevos
Incubación 8 – 10 días
(29º - 30ºC)

30 días a 18ºC
Alimentación de
larvas y galerías en
los panales

Fecundación
7 – 28 días inmóvil en el capullo

FIGURA 1 Ciclo biológico de G. mellonella.


FUENTE: adaptado de NEIRA, 2006.
6

2.1.3 Daño causado por G. mellonella L. Estos Lepidópteros causan todos los años
grandes estragos, al dañar los panales de las colmenas. La hembra adulta entra a la
colmena y oviposita en lugares inaccesibles a las abejas. Las lavas emergen y hacen
túneles en los panales al alimentarse de polen, néctar, miel o cera (NEIRA, 2006). Las
dos especies de polillas de la cera (estado adulto) no participan en la destrucción de
los panales, pues se lo impiden sus mandíbulas que están atrofiadas (LLORENTE,
2004).

Según Nilsen y Brister (1977), citado por WILLIAMS (1990), durante los meses mas
cálidos del año, cuando las poblaciones de G.mellonella son más grandes,
comúnmente se observa una aparente normal emergencia de las obreras y zánganos
de los panales en el núcleo de fecundación. Después de que se han liberado de la
celda operculada, las abejas quedan atrapadas en ellas por hilos de seda y que han
sido fabricados por las larvas de las polillas y puestos en la base de las celdillas. Esta
condición es llamada galeriosis.
La mayor proporción de los daños causados por las polillas de la cera ocurre en aquel
material que hallándose fuera de uso, ha sido guardado sin tener en cuenta las
precauciones necesarias, tendientes a preservarlo del ataque de la polilla. Según el
grado de intensidad de la invasión, variarán los daños experimentados por la colonia,
pudiendo llegar, en circunstancias extremas, al abandono de la colmena por parte de
las abejas (NEIRA, 2006).

LLORENTE (2004), señala que existen signos evidentes que corroboran la presencia
de estos enemigos de las abejas como la presencia de polillas adultas, larvas en
distinto estado de desarrollo, ninfas, deyecciones y cuadros destruidos. El diagnóstico
relativo a distinguir una u otra polilla, se realiza por el tamaño de los adultos y por la
disposición, galerías rectas y cría tubular, de los daños ocasionados, siendo mucho
más frecuente y más peligrosa G. mellonella que A. grisella.

2.2 Formas de control


Según NEIRA y MANQUIAN (2008), estos insectos no causan daño económico cuando
la población de abejas es la normal, ya que éstas se encargan de removerlas del
7

colmenar, sacándolas del panal, tirándolas al piso y desde allí al exterior a través de la
piquera.

Estos insectos están bien adaptados para sobrevivir alrededor de las colonias, por lo
cual los apicultores no son capaces de combatirlas en un 100 %, es necesario estar
alerta para evitar que su ataque sea severo (MAAREC, 2000).
FAO (2006), señala que para prevenir o controlar la infestación de estos lepidópteros
en los panales almacenados o productos de la colmena que sean vulnerables, se
pueden tomar varias medidas. Existen métodos técnicos, físicos, biológicos y químicos
(Burges, 1978; Charriere y Imodorf, 1997; Feldlaufer et al, 1998 y Kochansky, 2002
citados por NEIRA, 2006).

2.2.1 Control aplicado. Según la Agencia de Protección del Medio Ambiente


estadounidense, para el control de productos de la colmena que son consumidos por
los humanos, están aprobadas las fumigaciones con dióxido de carbono, aplicaciones
de calor y congelación (WILLIAMS, 1990).
LLORENTE (2004) señala que para proteger los materiales a utilizar en la próxima
temporada pueden ser desinfectados con productos químicos tales como:
- El dibromuro de metilo, es uno de los compuestos más utilizados, aunque es
toxico para el hombre y no posee cualidades ovicidas.

- Sulfuro de carbono, que es un producto eficaz, pero no destruye los huevos de


la polilla. Su uso es restrictivo, ya que, en su estado líquido es inflamable y el
gas que produce es explosivo y sus emanaciones son toxicas para el hombre.

- Anhídrido sulfuroso, es un gas que se desprende de la combustión del azufre,


no es ovicida pero se destruyen larvas y adultos. Posee el inconveniente de ser
corrosivo para los materiales metálicos de la colmena.

Otro compuesto utilizado es el paradiclorobenzol, el cual libera vapores lentamente por


un largo período y es de sencilla aplicación. No es tóxico para las abejas y en el
hombre tiene una baja toxicidad, aunque si se pone en contacto con la cera ésta se
destruye (NEIRA, 2006).
8

Sin importar el producto a utilizar, es necesario airear los materiales por lo menos por
48 horas antes de ser introducidos en la colmena. Además ninguno de los estadíos de
estas polillas sobreviven a temperaturas superiores a 46 ºC por 80 minutos, por lo cual
se pueden utilizar tratamientos que no incluyen químicos (LLORENTE, 2004).

2.2.2 Control natural. Hasta ahora no se ha desarrollado una trampa efectiva contra
la polilla de la cera, ya que los machos no sólo se guían por las feromonas de las
hembras sino que, también usan el ultrasonido. Además se han encontrado
componentes de las hormonas femeninas en las ceras de abejas, lo que podría
explicar cómo encuentran la cera para oviponer (MAAREC, 2000).
Según FAO (2006), una vez que la infestación en las colonias se concreta, no existen
medidas quimioterapéuticas fáciles o económicas. Una solución es la utilización de una
solución acuosa de Bacillus thuringiensis L. la cual es asperjada en los panales y
permanece por varias semanas.

La utilización de un producto natural como el propóleo, que es una sustancia resinosa


colectada por las abejas y mezclada con cera y secreciones de las glándulas salivales,
los distintos componentes de los propóleos, son producidos por las plantas para evitar
infecciones en heridas en diferentes partes de las plantas y para ayudar a controlar
insectos o ácaros parásitos. Las abejas lo utilizan como un pegamento multiuso y para
proteger la colmena de infecciones. Concentraciones de un 4 % de propóleo son
letales para las etapas más tempranas y aborta el desarrollo pupal en las etapas más
tardías (GAREDEW et al., 2004).

SANKAR et al. (2009), señalan en su estudio una serie de controladores biológicos


testeados bajo laboratorio, contra la polilla mayor de la cera como el nemátodo
Heterorhabditis indica, tres patógenos fúngicos comerciales (Metarhizum anisopliae,
Beauveria bassiana y Trichoderma viride), una bacteria antagonista (Pseudomonas
fluorescence) y dos biopesticidas basados en el árbol Azadirachta indica (Neem y
Nimor). Los resultados se pueden apreciar en la figura 2, en la cual se indica que la
aplicación de el nemátodo sólo logro un 100 % de mortalidad y la combinación del
nemátodo con los otros biopesticidas varió, siendo las más altas las con los extractos
9

de A. indica (90 % con Neem, 92 % con Nimor), un 90 % de mortalidad con P.


fluorescence y los resultados más bajos se observaron con los hongos (T. viride 84 %,
M. anisopliae 76 % y un 60 % con B. bassiana).

FIGURA 2 porcentajes de mortalidad larval bajo la influencia individual de


biopesticidas tratados en combinación con H. indica sobre Galleria mellonella.
FUENTE: SANKAR et al. (2009).

La acción individual de los distintos biopesticidas fue de un 40 % con B. bassiana, 24


% con M. anisopliae, 16 % con T. viride, 10 % con P. fluorescence y Neem, y sólo un 8
% con Nimor. (SANKAR et al., 2009).

2.3 Azadirachta indica A. Juss


El origen de este árbol no es claro, según Gamble (1902) citado por KOUL y WAHAB
(2004), el árbol de Neem de la familia Meliaceae, puede haberse originado en los
bosques de Karnataka en el sur de la India o en los bosque Myanmar (Birmania).
Las plantas han sido largamente estudiadas a nivel científico, lo que ha permitido su
utilización en la industria, medicina y agricultura, el árbol de Neem no escapa a estos
estudios. Hasta ahora preparados de Neem han sido evaluados contra más de 500
10

especies de insectos y más de 400 centenares son susceptibles en concentraciones


diferentes. En el mundo están disponibles mucha formulaciones comerciales y este
árbol ha empezado a ser conocido como un modelo biopesticida botánico y que ha sido
utilizado como pesticida prácticamente en casi todos los cultivos, además de ser eficaz
en el control de ectoparásitos en la crianza animal (KOUL y WAHAB, 2004).

2.3.1 Características morfológicas. Es un árbol siempreverde de tamaño mediano a


grande, con un fuste corto y recto, corteza arrugada de color marrón oscuro a gris, de
copa densa y redondeada con hojas pinadas. Las flores se presentan en panículas
estrechas y ramificadas de 5 a 15 cm de largo, las flores individualmente están
compuestas de un cáliz de cinco lóbulos redondeados y de color verde pálido, cinco
pétalos redondeados, oblongos y blancos de 0,5 cm de largo y 10 estambres unidos en
un tubo y un pistilo con un ovario redondeado y un estilo delgado. En su área de
distribución natural florece entre marzo y mayo (PARROTTA y CHATURVEDI, 1994).

Las frutas son drupas en forma de aceitunas de 1,0 a 2,0 cm de largo, lisas de un color
amarillo verdoso a amarillo en la madurez (junio a agosto en Asia), por lo general,
poseen una sola semilla elíptica rodeada de una pulpa dulce con un fuerte olor
semejante al ajo. La producción de frutas comienza cuando los árboles tienen entre
tres a cinco años de edad y alcanzan su máxima producción a los 10 años. Lo usual
es encontrar entre 4,000 y 5,000 semillas por kilogramos de fruta y son diseminadas
principalmente por las aves (PARROTTA y CHATURVEDI, 1994).

La germinación es epigea y no requiere de escarificación, aunque limpiando la semilla


se pueden lograr porcentajes de germinación de entre un 60 a 85 % y su viabilidad no
supera los dos meses. Su propagación vegetativa se logra por medio de estacas de
ramas y se obtienen mejores resultados cuando las estacas son tratadas con ácido
indolbutírico (PERROTTA y CHATURVEDI, 1994).
11

FIGURA 3 Follaje y fruto de Azadirachta indica A. Juss.


FUENTE: PARROTTA y CHATURVEDI (1994).

2.3.2 Propiedades y utilización. El parecido que poseen los componentes del los
distintos extractos de Neem con las hormonas naturales de los insectos, hacen que
estos los absorban como si fueran las hormonas reales, afectando el normal
funcionamiento del insecto, bloqueando su sistema endocrino (RAMOS, s/f).
De las diferentes partes de Azadirachta indica se han asilado e identificado cerca de
100 compuestos, de los cuales 70 de ellos de origen triterpénico destacan por su
actividad insecticida y en especial la azadiractina (Koul et al., 1990. citado por
BURBALLA et al., 1995).

La azadiractina es el principal componente biológicamente activo del árbol de Neem y


es extraída de las semillas maduras del árbol, posee una potente acción anti
alimentaria y propiedades reguladoras del crecimiento (MORDUE, 1997).
Según RAMOS s/f, el efecto de los extractos de Neem sobre varios insectos es bien
conocido, actuando de diferentes maneras, así puede generar destrucción e inhibición
en el desarrollo de huevos, larvas o crisálidas; bloquear la metamorfosis de larvas o
ninfas; desarticular el apareamiento y comunicación sexual; repeler a larvas y adultos;
impide la postura de huevos; esteriliza a adultos; impide la alimentación; inhibe la
formación de quitina; impide que se realicen las mudas, necesarias para entrar en la
siguiente etapa de desarrollo, por lo que actúa como regulador de crecimiento de los
insectos.
12

2.4 Extracto alcohólico de Neem


Debido a la complejidad estructural de la azadiractina, las formulaciones naturales
están basadas en extractos alcohólicos, acuosos y en aceites extraídos de las semillas
del árbol, lo que hace variar considerablemente las formulaciones comerciales
existentes, por ejemplo, en Estados Unidos existen formulaciones enriquecidas con
azadiractina registradas por la Agencia de Protección del Medioambiente (Ascher,
1993. citado por BURBALLA et al., 1995).

2.4.1 Elaboración. Las hojas y en especial los granos de la semilla del árbol de Neem
y sus extractos, han sido utilizados para el control de varios insectos plaga en India, sin
embargo existe la necesidad de estandarizar los productos naturales. La comunidad
internacional ha denominado al ingrediente activo de los extractos de Neem como
azadiractina, existiendo varios tipos, la más común es la de tipo A y el contenido de
esta y de otros tipos varia según la calidad de la semilla y en especial con el tipo de
extracción realizada para obtener la formulación final (KLEEBERG, 2004).

Basándose en los tres procesos básicos de extracción, todo ellos generan la aparición
de ciertas materias activas que varían según el proceso de extracción que se realice
(RAMOS s/f). En el cuadro 1 se puede observar la cantidad de azadiractina obtenida
utilizando diferentes solventes
CUADRO 1 Cantidad de azadiractina obtenida utilizando distintos solventes.
Solvente usado Azadiractina encontrada Unidad
Etanol (95 %) 2,80 µg/10µl
Metanol / Agua (85:15) 2,60 µg/10µl
Metanol 2,19 µg/10µl
Acetona 0,74 µg/10µl
Etil - eter 1,28 µg/10µl
FUENTE: adaptado de RAMOS s/f.

Según KLEEBERG (2004), debido a que existen diversas formulaciones no registradas


comercialmente, la FAO ha documentado especificaciones para los productos del
Neem dividiéndolos en dos grupos, aquellos que están hechos a base de aceites y los
13

que son ricos en azadiractina libres de aceite. Estas especificaciones fueron creadas
para que las autoridades de cualquier país tomen las medidas necesarias en cuanto a
calidad y demanda de pesticidas.

2.4.2 Modo de acción. La azadiractina actúa interfiriendo en el sistema


neuroendocrino, afectando la producción de la hormona juvenil y de ecdisona. Además
tiene efectos en la conducta alimenticia, oviposición, fecundidad y desarrollo de los
insectos (Remblod, 1989 y Schmutterer, 1985, 1988, 1990. citados por BURBALLA et
al., 1995).

MORDUE (1997), señala que existen dos categorías de efectos anti alimentarios
producidos por la azadiractina, el primero se relaciona con los quimiorreceptores del
gusto en las patas y aparato bucal de los insectos, en donde estimula la disuasión de
células e inhibe la células fagoestimulantes en los receptores. La segunda categoría
(anorexia) dice relación con el efecto fisiológico tóxico producido por la ingestión de la
azadiractina. Las larvas de Lepidópteros son el orden de insectos más
conductualmente sensibles a la azadiractina, los Coleópteros, hemípteros e
himenópteros son moderadamente sensibles y los Ortópteros tienen un amplio rango
de sensibilidad dependiendo de la especie. En el cuadro 2 se representan los rangos
de azadiractina a los cuales los distintos ordenes de insectos son sensibles, expresado
en su DL50 correspondiente.

CUADRO 2 Sensibilidad conductual de los insectos a la azadiractina.


ORDEN DL50 (ppm)
Lepidoptera < 0.001 - 50
Coleoptera 100 – 500
Hemiptera 100 – 500
Hymenoptera 100 – 500
Orthoptera 0.001 -- > 1000
FUENTE: MORDUE (1997).

Los efectos fisiológicos producidos por la azadiractina de manera directa se basan en


su acción sobre tejidos en específico y de manera indirecta a través del sistema
endocrino. Estos efectos son más consistentes entre especies con un promedio de
14

DL50 de aproximadamente 2µg de azadiractina por g de peso corporal (MORDUE,


1997).

Los extractos de Neem, en general no muestran efectos tóxicos para los enemigos
naturales de las plagas u otros organismos benéficos, mamíferos o humanos
(Schmutterer, 1990 y Larson, 1987. citados por BURBALLA et al., 1995).

β -caseína
Albúmina 3 MATERIAL Y MÉTODO
α -caseína
15

3.1 Lugar del ensayo


El ensayo se realizó en las dependencias del Laboratorio de Entomología, el cual
depende del Instituto de Producción y Sanidad Vegetal de la Facultad de Ciencias
Agrarias de la Universidad Austral de Chile.

3.1 Material biológico


Las 180 larvas de Galleria mellonella que fueron utilizadas para este estudio se
obtubieron gracias a una muestra de huevos, entregadas por el INIA Quilamapu
ubicado en la localidad de Chillan, Chile. La muestra equivale en peso a unos 1,5 g.
El insecticida biológico, corresponde a un formulado comercial llamado Neem-X, que
contiene un 0,4 % de azadiractina como ingrediente activo.

3.2 Material de laboratorio


Para este estudio se utilizó una cámara con ambiente controlado (temperatura,
humedad y fotoperiodo), 180 frascos de 8 cc para cada larva y todos los materiales de
laboratorio básicos necesarios para el correcto funcionamiento del experimento.

3.3 Dieta
La formulación de la dieta es una adaptación de la dieta utilizada en el INIA Quilamapu
para la mantención de larvas de Galleria mellonella, que a su ves es una adaptación de
la formula descrita por SINGH y MOORE (1985). Los ingredientes para su elaboración
se describen en el cuadro 3.

CUADRO 3 Ingredientes para la elaboración de 1 Kg. De dieta para larvas.


COMPONENTES CANTIDAD UNIDAD
Nestum 3 cereales 187 g.
Nestum avena y miel 187 g.
Germen de trigo 120 g.
Azúcar granulada 148 g.
Glicerina líquida 219 mL.
Jarabe Pantiban 1,2 mL.
Agua destilada 138 mL.

FUENTE: Elaboración propia


16

La dieta fue elaborada de la siguiente manera: en un recipiente se disolvió azúcar con


agua destilada recién hervida, a la cual se la agregó glicerina y vitaminas en forma de
jarabe, agitando constantemente para lograr una mezcla homogénea. En un recipiente
independiente se mezclaron los dos tipos de Nestum y el germen de trigo; luego se
mezclaron ambos preparados, hasta obtener una mezcla ligada y medianamente dura.
El proceso de elaboración de la dieta se puede obserbar en la figura 4.

FIGURA 4 Elaboración de la dieta utilizada en el ensayo.

3.4 Metodología
Para evaluar los objetivos propuesto en este experimento se utilizó la siguiente
metodología

Según AFIPA (2006), la dosis recomendada para el producto comercial Neem.X está
en un rango de 2,5 a 5 cc/l de producto comercial, por lo que se considero un promedio
17

de 3,75 cc/l el cual se expresó en partes por millón para facilitar los procesos de
elaboración de las dosis, es decir la dosis recomendada a utilizar fue de 15 ppm de
azadiractina.

Los distintos tratamientos consistieron en dos dosis más bajas y dos dosis más altas a
partir de la dosis recomendada aumentando o disminuyendo a una razón de dos. Los
distintos tratamientos y dosis se describen en el cuadro 4.

CUADRO 4 Dosis y tratamientos a aplicar del extracto de Nemm sobre G.


mellonella.
TRATAMIENTO DOSIS UNIDAD ia.
T0 0 ppm
T1 3,75 ppm
T2 7,5 ppm
T3 15 ppm
T4 30 ppm
T5 60 ppm
FUENTE: Elaboración propia.

Luego de la elaboración de la dieta ésta fue introducida en los 180 frascos de 8 cc que
contendrán, cada uno de ellos 4 cc de la dieta y se procederá a inocular cada frasco
con las distintas dosis para así conformar los distintos tratamientos con sus respectivas
repeticiones.

La inoculación de las dosis se realizara asperjando la dieta con un roseador de 3 ml


procurando hacer un asperjado parejo y homogéneo en toda la dieta.
Luego de la eclosión de las larvas y en un periodo menor a cuatro horas, para evitar la
deshidratación de estas y procurar una homogeneidad de los posteriores estadios
larvarios, se procederá a introducirlas con una pinza en sus respectivos frascos, los
cuales se sellaran y se ubicarán en una cámara con una temperatura de 28 ºC +/- 2 ºC,
18

una humedad relativa cercana al 50 % y con un fotoperiodo de 0 horas luz y 24 horas


de oscuridad para simular el ambiente de una colmena natural.

Durante los primeros cinco días desde la puesta en marcha del experimento se
observará diariamente si las larvas se están alimentando, se considerara como
indicador de alimentación la introducción de las larvas en la dieta, posteriormente cada
siete días y por un periodo de 60 días se observarán los distintos objetivos planteados
en este experimento, es decir, mortalidad, efecto anti alimentario y regulador del
crecimiento, para lo cual se asilaran a 4 ºC las larvas que presenten mortalidad para su
posterior análisis.
Para determinar los efectos sub letales se procederá a analizar la postura de huevos
de los adultos que se generen en el periodo experimental, ubicándolos en frascos
medianos con cintas de papel mantequilla y así analizar las diferencias entre la postura
de los distintos tratamientos.

3.4.1 Diseño experimental. Se utilizará un diseño estadístico completamente al azar,


que incluirá cinco tratamientos con distintas dosis del extracto de Neem más un
tratamiento control que contendrá sólo agua destilada, cada tratamiento tendrá tres
repeticiones. La unida experimental consistirá en 10 larvas de G. mellonella por cada
repetición de cada tratamiento, en total 180 larvas.

3.4.2 Análisis de resultados. Los datos obtenidos de la mortalidad de larvas serán


sometidos al factor de corrección de Schneider y Orelli el cual es utilizado en distintos
ensayos con pesticidas (BAKR, 2002). La formula de corrección de mortalidad se
señala a continuación.
% de mortalidad corregida = (% mortalidad tratamiento - % mortalidad testigo)
X 100

100 - % mortalidad testigo

Luego de obtener los datos de mortalidad corregidos estos serán sometidos a un


análisis de probit (probabitity unit) que es utilizado para evaluar las toxicidades de los
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productos utilizados en patologías de insectos, lográndose conocer la dosis con la que


se obtiene el 50 % de los organismos muertos (FRUTOS, 1995).
Para todas las variables en estudio (mortalidad, desarrollo, alimentación y efectos sub
letales) se realizará una prueba de contraste de Bartlett para determinar si presentan
homogeneidad de varianza y su posterior análisis (ANDEVA) y con la finalidad de
detectar diferencias estadísticas significativas se realizará un test de Tukey (LEVIN y
LEVIN, 1999).

4 BIBLIOGRAFÍA

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