“El Año del Diálogo y la Reconciliación

Nacional”

UNIVERSIDAD NACIONAL “JORGE

BASADRE GROHMANN - TACNA”
INSTITUTO DE INFORMATICA Y
TELECOMUNICACIONES

Técnicas de
digitación
 NOMBRE:
Yoselin Noelia Jalanoca Quispe

 PROFESORA:
Lic. Celia Soto Cutipa

 CURSO:
Técnicas de digitación

 HORARIO:
2:00PM – 6:00 PM

TACNA – PERÚ

2018

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 Práctica Nº1:

DETERMINACIÓN DE PROTEINAS EN GELATINA

MEDIANTE ESPECTROSCOPIA UV

1.- INTRODUCCIÓN:
La radiación de absorción ultravioleta o visibles proviene de la excitación de los electrones

enlazantes y como consecuencia , las longitudes de onda de los picos de absorción pueden

correlacionarse con los tipos de enlace que existen en las especies en estudio .la

espectroscopia de absorción molecular es por tanto valiosa para la identificación de los

grupos funcionales de una molécula .Sin embargo , son más importantes las aplicaciones de

la espectroscopia de absorción ultravioleta y visible para la determinación cuantitativa de

compuestos que contiene grupos absorbentes o también llamados cromoforos .

No obstante en algunos casos , la absorción depende notablemente del entorno molecular ,

así los cambios en el espectro con cambios de entorno pueden interpretarse en términos de

procesos tales como fusión de ácidos nucleicos , interacciones proteínas –ligando (ensayo

de actividad enzimática , enzima –cofactor, activados , inhidor )etc. El espectro UV/V de un

biopolímero es una huella dactilar y como tal puede usarse en ocasiones para

identificarlo . La gran utilidad de tales medidas radica en la alta sensibilidad, la sencillez de la

medida y el hecho de hacerse en disolución , aunque no es posible estas medidas en

sistemas biológicos intactos , es decir in vivo , tales como tejidos debido a que esta radiación

es fuertemente dispersada .

2.- OBJETIVOS:
 Determinar la cantidad de proteínas en una muestra de gelatina comercial, aplicando el

método espectrofotométrico en la región ultravioleta.

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 3.- FUNDAMENTO TEORICO:

ESPECTROSCOPIA UV

La espectrometría ultravioleta-visible o espectrofotometría UV-Vis implica la espectroscopia de

fotones en la región de radiación ultravioleta-visible. Utiliza la luz en los rangos visible y

adyacentes (el ultravioleta (UV) cercano y el infrarrojo (IR) cercano.

En esta región del espectro electromagnético, las moléculas se someten a transiciones

electrónicas.
Esta técnica es complementaria de la espectrometría de fluorescencia, que trata con

transiciones desde el estado excitado al estado basal, mientras que la espectrometría de

absorción mide transiciones desde el estado basal al estado excitado.

APLICACIONES 
La espectrometría UV/Vis se utiliza habitualmente en la determinación cuantitativa de

soluciones de iones metálicos de transición y compuestos orgánicos muy conjugados.

Soluciones de iones metálicos de transición
Las soluciones de iones metálicos de transición pueden ser coloreadas (es decir, absorben la

luz visible) debido a que los electrones los átomos de metal se pueden excitar desde un

estado electrónico a otro. El color de las soluciones de iones metálicos se ve muy afectado

por la presencia de otras especies, como algunos aniones o ligandos. Por ejemplo, el color

de una solución diluida de sulfato de cobre es muy azul; agregando amoníaco se intensifica

el color y cambia la longitud de onda de absorción máxima.

Compuestos orgánicos
Los compuestos orgánicos, especialmente aquellos con un alto grado de conjugación,

también absorben luz en las regiones del espectro electromagnético visible o ultravioleta. Los

disolventes para estas determinaciones son a menudo el agua para los compuestos solubles

en agua, o el etanol para compuestos orgánicos solubles. Los disolventes orgánicos pueden

tener una significativa absorción de UV, por lo que no todos los disolventes son adecuados

3
 para su uso en espectrometría UV. El etanol absorbe muy débilmente en la mayoría de

longitudes de onda. La polaridad y el pH del disolvente pueden afectar la absorción del

espectro de un compuesto orgánico. La tirosina, por ejemplo, aumenta su máximo de

absorción y su coeficiente de extinción molar cuando aumenta el pH de 6 a 13, o cuando

disminuye la polaridad de los disolventes.

Aunque los complejos de transferencia de carga también dan lugar a colores, éstos son a

menudo demasiado intensos para ser usados en mediciones cuantitativas.

La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia de una solución es directamente

proporcional a la concentración de la solución. Por tanto, la espectrometría UV/VIS puede

usarse para determinar la concentración de una solución. Es necesario saber con qué

rapidez cambia la absorbancia con la concentración. Esto puede ser obtenido a partir de

referencias (las tablas de coeficientes de extinción molar) o, con más exactitud,

determinándolo a partir de una curva de calibración.

El espectrofotómetro UV/Vis puede utilizarse como detector para la Cromatografía Líquida de

Alta Resolución (CLAR). La presencia de un analito da una respuesta que puede ser

proporcional a la concentración. Para resultados precisos, la respuesta del instrumento al

analito debe compararse con la respuesta a un estándar, lo que es muy similar al uso de

curvas de calibración. La respuesta (por ejemplo, el pico de altura) para un concentración

particular se conoce como factor de respuesta.

LEY DE BEER­LAMBERT
La espectrometría UV-Vis se utiliza con mayor frecuencia en forma cuantitativa para determinar

las concentraciones de especies absorbentes en solución, usando la Ley de Beer-Lambert:

-Fórmula Ley de Beer-Lambert.-

Donde:

A es la absorbancia medida

4
 I0: es la intensidad de la luz incidente a una determinada longitud de onda

I: es la intensidad de transmisión

L: la longitud de ruta a través de la muestra,

C: la concentración de las especies absorbentes.

ε : es una constante conocida como absortividad molar o coeficiente de extinción.

La ley de Beer-Lambert es útil para la caracterización de muchos compuestos, pero

no sirve como relación universal para la concentración y absorción de todas las
sustancias. En moléculas complejas de gran tamaño, como los tintes orgánicos
(Xylenol Naranja o Rojo Neutro, por ejemplo), a veces se encuentra una relación
polinómica de segundo orden entre la absorción y la concentración.

ESPECTROFOTÓMETRO ULTRAVIOLETA­VISIBLE
El instrumento utilizado en la espectrometría ultravioleta-visible se llama espectrofotómetro UV-

Vis. Mide la intensidad de luz que pasa a través de una muestra (I), y la compara con la

intensidad de luz antes de pasar a través de la muestra (Io). La relación I / Io se llama

transmitancia, y se expresa habitualmente como un porcentaje (%T). La absorbancia (A) se

basa en la transmisión:

A = - log (%T)

Las partes básicas de un espectrofotómetro son una fuente de luz (a menudo una bombilla

incandescente para las longitudes de onda visibles, o una lámpara de arco de deuterio en el

ultravioleta), un soporte para la muestra, una rejilla de difracción o monocromador para separar

las diferentes longitudes de onda de la luz, y un detector. El detector suele ser un fotodiodo o

un CCD. Los fotodiodos se usan con monochomadores, que filtran la luz de modo que una sola

longitud de onda alcanza el detector. Las rejillas de difracción se utilizan con CCDs, que

recogen la luz de diferentes longitudes de onda en píxeles.

Un espectrofotómetro puede ser único o de doble haz. En un instrumento de un solo haz (como

el Spectronic 20), toda la luz pasa a través de la célula muestra. La Io debe medirse retirando la

5
 muestra. Este fue el primer diseño, y todavía está en uso en la enseñanza y laboratorios

industriales.

En un instrumento de doble haz, la luz se divide en dos haces antes de llegar a la muestra. Un

haz se utiliza como referencia, y el otro haz de luz pasa a través de la muestra. Algunos

instrumentos de doble haz tienen dos detectores (fotodiodos), y el haz de referencia y el de la

muestra se miden al mismo tiempo. En otros instrumentos, los dos haces pasan a través de un

bloqueador que impide el paso de un haz. El detector alterna entre la medida del haz de

muestra y la del haz de referencia.

Las muestras para espectrofotometría UV-Vis suelen ser líquidas, aunque la absorbancia de los

gases e incluso de los sólidos también puede medirse. Las muestras suelen ser colocadas en

una célula transparente, conocida como cubeta. Las cubetas suelen ser rectangulares, con una

anchura interior de 1 cm. Esta anchura se convierte en la longitud de ruta, L, en la Ley de Beer-

Lambert. También se pueden usar tubos de ensayo como cubetas en algunos instrumentos.

Las mejores cubetas están hechas con cuarzo de alta calidad, aunque son comunes las de

vidrio o plástico. El cristal y la mayoría de los plásticos absorben en el UV, lo que limita su

utilidad para longitudes de onda visibles.

ESPECTRO ULTRAVIOLETA­VISIBLE
Un espectro ultravioleta-visible es esencialmente un gráfico de absorbancia de luz frente a una

longitud de onda en el rango del ultravioleta o la luz visible. Este espectro puede ser producido

directamente con los espectrofotómetros más sofisticados, o bien pueden registrarse los datos

de una sola longitud de onda con los instrumentos más simples. La longitud de onda se

representa con el símbolo λ. Del mismo modo, para una determinada sustancia, puede hacerse

un gráfico estándar del coeficiente de extinción (ε) frente a la longitud de onda (λ). Este gráfico

6
 estándar sería efectivamente "la concentración corregida" y, por tanto, independiente de la

concentración. Para una sustancia determinada, la longitud de onda en la cual se produce el

máximo de absorbancia en el espectro se llama λ max, y se pronuncia "lambda-max".

Las reglas de Woodward-Fieser son un conjunto de observaciones empíricas que pueden

utilizarse para predecir λ max, la longitud de onda de la absorción UV-Vis, para compuestos

orgánicos conjugados como dienos y cetonas.

Las longitudes de onda de los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de

enlace en una determinada molécula, y son valiosos para determinar los grupos funcionales

dentro de la molécula. La absorción UV-Vis no es, sin embargo, una prueba específica para

ningún compuesto determinado. La naturaleza del disolvente, el pH de la solución, la

temperatura, la concentración de electrolitos, y la presencia de sustancias interferentes pueden

influir en los espectros de absorción de los ompuestos, así como las variaciones en la anchura

de la hendidura (ancho de banda efectivo) en el espectrofotómetro.

Fundamento del método:

Las proteínas poseen una banda de absorción en el UV entre 190-290nm debido

fundamentalmente a la presencia de aminoácidos aromáticos (tirosina, triptófano y

fenilalanina) el método se basa en la medición de absorbancias a 280nm. Es un método

simple, rápido y no destructivo.

4.- MATERIALES Y METODOS:

MATERIALES, EQUIPOS E INSTALACIONES:

 Muestra de gelatina comercial

 Suero albumina bovina
 Tubos de ensayo
 Balanza analítica
 Espectrofotómetro

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  Pipetas
 Matraces aforados de 10ml
 Vaso de precipitación

5.- PROCEDIMIENTO:

a) Preparación de la muestra:

 Pesar aproximadamente 0.5 g de una gelatina comercial

 Disolverlos en un mínimo de volumen de agua caliente

 Dejar enfriar y llevar a 100 ml con agua destilada

 Medir la absorbancia de dicha solución a 280 nm

b) Calcular la concentración de proteína en la muestra expresada en ppm a partir de la

curva de calibración determinada .

c) Construcción de la curva de calibración

CURVA PADRÓN:
 Prepara una solución padrón de SAB 1300ppm (1300mg/L)
 Realizar la curva padrón conforme los datos.

NÚMERO PADRÓN H2O CONCENTRACIÓ ABSORBANCIA

DE SAB(ML) (ML N (280NM)
TUBO ) MG/ML
2 0.2 0.8
4 0.4 0.6
6 0.6 0.4
8 0.8 0.2
10 1.0 ­­­­
Blanco ­­­­­­­ 10.0 ­­­­­­­­

6.- RESULTADOS:

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 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA: gelatina  comercial (royal)
 Se pesó 0.5012g, se disuelve en 100ml con H 2O.
 Tomamos la muestra y medimos la absorbancia a 280 nm: 0.7668
Determinamos la concentración en cada tubo tomando como referencia la concentración del

SAB (1300mg/1000ml)
Entonces: 1000ml  1300mg
0.2ml  X
De la misma
manera se
0.2 x 1300
X= continuara para
1000
los demás tubos.

X = 0.26mg/ml …. Tubo “2”

Número Padrón H2O Concentració Absorbancia

de tubo SAB(ml) (ml) n (280nm
mg/ml )
2 0.2 0.8 0.26
4 0.4 0.6 5.2
6 0.6 0.4 7.8
8 0.8 0.2 10.4
10 1.0 ­­­­ 13.0
Blanc ­­­­­­­ 10.0 ­­­­­­­­

 Luego medimos la absorbancia: a 280nm

Número Padrón H2O Concentración Absorbancia

de tubo SAB(ml) (ml) mg/ml (490nm)
2 0.2 0.8 0.26 0.1721
4 0.4 0.6 5.2 0.3165
6 0.6 0.4 7.8 0.4790
8 0.8 0.2 10.4 0.6387
10 1.0 ­­­­ 13.0 0.7958
Blanc ­­­­­­­ 10.0 ­­­­­­­­

9
 

GRAFICO N°1: CONCENTRACIÓN vs ABSORBANCIA

0.9
0.8
0.7 f(x) = 0.05x + 0.11

0.6
absorbancia

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12 14
concentracion
Co

n los datos obtenido hallamos la curva de calibración :



10
11
 Curva de calibracion

f(x) = 0.05x + 0.11

R² = 0.97
absorbancia

Linear ()

concentracion

Curva de calibracion

f(x) = 0.05x + 0.11

R² = 0.97
absorbancia

Linear ()

concentracion

12
 Curva de calibracion

f(x) = 0.05x + 0.11

R² = 0.97
absorbancia

Linear ()

concentracion

Curva de calibracion

f(x) = 0.05x + 0.11

R² = 0.97
absorbancia

Linear ()

concentracion

 Obtenemos los valores de:

A = 0.1148
B = 0.0499

13
 R2 = 0.97
 Absorbancia de la muestra: 0.7668
Y = A +Bx
0.7668= 0.1148 + 0.0499x
x = 13.066mg
Entonces:
13.066mg  0.5021gr
X mg  100 gr
x = 2602.229 mg
X= 2.60g
X= aprox 2% de azucar

ENTONCES:   existe un 2% de proteína  en cada 100 g de
gelatina comercial

DISCUSIÓN de RESULTADOS:
 Se obtuvo un porcentaje de proteína muy bajo cerca la 2% a diferencia de las fuentes

bibliográficas que indican un porcentaje mayor.

 Dependiendo del origen de la proteína sea animal o vegetal el porcentaje varia por ejemplo:

La gelatina de origen vegetal se obtiene directamente de las plantas, por lo que su contenido

en proteínas es menor que la que proviene de los animales. Es un tipo de gelatina más

habitual, también se viene utilizando en la industria alimenticia

7.- CONCLUSION:

 Se determinó la cantidad de proteína presente en la muestra de gelatina comercial

(royal), aplicando el método espectrofotométrico en la región ultravioleta

8.- BIBLIOGRAFIA:

 Manual de Laboratorio para el Análisis de los Alimentos L. HART, J. FISHER, Análisis

moderno de los alimentos.

 Norman Potter, “Tecnología de los alimentos “

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