Universidad Central de Venezuela

Facultad de Ciencias
Escuela de Biología
Laboratorio de Biología Celular
Prof.: Carlos Torrealba

INTEGRACIÓN Y CONTROL DE LA FUNCIÓN CELULAR

Ejercicio IIlA

Bersovine Deyarling CI 21 724 317

Vivas Ilad CI 18 245 508

Caracas, 01 de Noviembre de 2016

 INTRODUCCIÓN

El término metabolismo designa la totalidad de las reacciones químicas que se

producen en un organismo. Dado que las reacciones químicas liberan o consumen energía,
el metabolismo se puede concebir como una función de equilibrio energético. El metabolismo
se puede dividir en dos clases de reacciones químicas: las que liberan energía y las que
consumen energía (1). En las células las reacciones químicas reguladas por enzimas que
liberan energía por lo general son las reacciones implicadas en el catabolismo, es decir la
degradación de compuestos orgánicos complejos para su conversión en compuestos más
simples. Las reacciones reguladas por enzimas que requieren energía se relacionan
principalmente con el anabolismo, es decir la formación de moléculas orgánicas complejas a
partir de moléculas más simples. Las reacciones catabólicas aportan las “materias primas”
para las reacciones anabólicas y la energía necesaria para impulsar las reacciones anabólicas.
Este acoplamiento de reacciones que requieren energía y reacciones que liberan energía es
posible debido a la presencia de adenosintrifosfato (ATP). Las moléculas de ATP almacenan
la energía proveniente de las reacciones catabólicas y la liberan en una fase siguiente para
impulsar las reacciones anabólicas y el cumplimiento de otras tareas celulares.
La mayoría de los microorganismos oxidan carbohidratos como fuente principal de
energía celular. En consecuencia, el catabolismo de los hidratos de carbono, o la degradación
de éstas moléculas para producir energía, es sumamente importante en el metabolismo
celular. El carbohidrato que las células utilizan con mayor frecuencia como fuente de energía
es la glucosa. Los microorganismos también poseen la capacidad de catabolizar diversos
lípidos y proteínas para producir energía. Para generar energía a partir de la glucosa los
microorganismos recurren a dos procesos generales: la respiración celular y la fermentación.
El paso inicial de estos dos procesos por lo general es el mismo (la glucólisis) pero a partir
de la glucólisis las vías metabólicas siguen caminos diferentes. La glucólisis es la oxidación
de la glucosa para formar piruvato, con la producción de cierta cantidad de ATP y NADH
que contiene energía. El ciclo de Krebs es la oxidación de la acetil CoA (un derivado del
piruvato) para formar dióxido de carbono, con la producción de cierta cantidad de ATP,
NADH que contiene energía y otro transportador de electrones reducido denominado FADH
(la forma reducida de la flavina adenina dinucleótido). La cadena transportadora de
electrones es responsable de la oxidación de NADH y FADH, que transfieren los electrones
que transportan desde los sustratos a una “cascada” de reacciones de oxidación y reducción
en las que participan otros transportadores de electrones. La energía derivada de estas
reacciones se utiliza para generar una cantidad importante de ATP.
Los procesos de crecimiento y diferenciación celular están estrechamente
relacionados al metabolismo de cada organismo. (2) Las poblaciones microbianas raramente
mantienen un crecimiento exponencial prolongado. El crecimiento está normalmente
limitado por el agotamiento de nutrientes o por la acumulación de subproductos del mismo
metabolismo microbiano, que son tóxicos para la población. La consecuencia es que el
crecimiento al cabo de un cierto tiempo llega a disminuir hasta detenerse. Es posible
distinguir cuatro fases: 1) fase de latencia 2) fase exponencial 3) fase estacionaria 4) fase de
muerte. En la fase de latencia existe un aparente reposo en el que las células sintetizan las
enzimas necesarias para la actividad metabólica que deben llevar adelante. Las bacterias se
preparan para hacer uso de los nutrientes que este medio le aporta, por lo tanto es la fase de
adaptación al medio, con aumento de la masa celular pero no del número de células. La edad
del inóculo va a influir en el tiempo de latencia en el medio fresco debido a la acumulación
de materiales tóxicos y a la falta de nutrientes esenciales dentro de las células. Pasado este
período, el cultivo entra en la denominada fase de crecimiento exponencial, donde la
velocidad de crecimiento es máxima. La velocidad de crecimiento que alcanza un cultivo,
depende del tipo de microorganismo que se trate y diversos factores ambientales como son
la temperatura, el pH, oxigenación, etc. La velocidad de crecimiento comenzará a disminuir
hasta hacerse nula cuando alcance la fase estacionaria. Esta fase se presenta por agotamiento
del suministro de algún nutriente esencial o por acumulación de productos metabólicos que
sean tóxicos. También puede ser por la disminución de la oxigenación o cambios en las
condiciones de pH del medio de cultivo (acidificación o alcalinización): En esta fase se
equilibran el número de células nuevas con el número de células que mueren. Por último, el
cultivo entra en la fase de muerte (2).

Existen diversas formas de evaluar una población bacteriana ya sea por métodos de
medición del crecimiento directos e indirectos. (2) En el conteo directo el crecimiento se
evalúa haciendo mediciones sucesivas en tiempos determinados de la población en estudio,
en cada momento se evalúa cual es la población en ese instante. El conteo de células viables
se basa en la consideración que el crecimiento implica el aumento de los microorganismos
capaces de formar colonias. El método más frecuentemente empleado es el conteo en placas,
por lo tanto se determinan por este método sólo las células microbianas viables en las
condiciones de trabajo. En un medio sólido cada bacteria se multiplicará formando una
colonia visible a simple vista que puede ser contada. Como las colonias pueden originarse
tanto de una célula como de un grupo de células, se utiliza el término: Unidades formadoras
de colonias (U.F.C). El método de medición de la densidad bacteriana es una técnica de
medición indirecta en la que se mide la cantidad de microorganismos en una suspensión. Para
ello se utiliza un espectrofotómetro y se mide la cantidad de luz que atraviesa en una
suspensión de microorganismos, en comparación con un blanco que es el medio esterilizado
y sin sembrar. Cuanto mayor es el número de células en suspensión, tanto menor es el
porcentaje de luz que atraviesa el medio. Estas metodologías fueron empleadas en este
ejercicio de práctica y de esta forma se evaluó el crecimiento bacteriano utilizando distintas
fuentes de carbono, distintas temperaturas y oxigenación.
 OBJETIVOS DE LA PRÁCTCA

- Usar diferentes métodos de contaje de células, conocer su relación con distintas

propiedades de las mismas y basándose en ellos desarrollar criterios para el análisis
cuantitativo de la cinética de crecimiento de una población celular.

- Analizar el efecto de variables ambientales tales como temperatura tipo de fuente de

carbono presente en el medo de cultivo aerobiosis o anaerobiosis y diauxismo sobre
la cinética de crecimiento de una población de un organismo procariotico de vida
libre: Escherichia coli.

METODOLOGÍA
En la práctica realizada se emplearon dos tipos de metodologías para el contaje de
células procariotas utilizando como modelo biológico: Escherichia coli.

Método I:
Contaje indirecto de células procariotas Medio de cultivo: 10 mL totales en una
ertula que contenga medio mineral completo vitamina B1 5m/L + Fuente de carbono 10mM,
se le proporcionó al equipo Galactosa y Acetato. El medio es inoculado con una
dilución 1/10 de un cultivo de bacterias. Se incubó la ertula inoculada en un baño de agitación
a la temperatura de 37 grados centígrados. Después de inocular el medio y con intervalos
sucesivos de 20 minutos durante 3 horas se determinó la población bacteriana presente
realizando las siguientes operaciones:

1) Se midió la densidad óptica del cultivo ajustando la lectura del espectrofotómetro con
un blanco que contenga solo el medio nutritivo sin el cultivo bacteriano.

2) Se extrajo una muestra de 01 mL exactos del cultivo y se realizó una dilución global
de este en 1x10-6, debido a que se obtuvo con la primera medición de D.O a T0 una
extrapolación de una medida mayor a 40 unidades KLETT (UK)
 3) Se tomaron 0,1 mL exactos de la dilución anterior obtenida en el paso 2 y se
distribuyó uniformemente sobre una placa de agar nutritivo estéril utilizando el
sembrado por arrastre como metodóloga de siembra.

Figura 1: Metodología de siembra en placas de agar nutritivo.

4) Se incubaron estas placas invertidas a 37 °C por 24 horas y determinó el número de

colonias.

Método II:
Contaje directo de células eucariotas Se suministró por el personal docente un
cultivo no patógeno de Leptomonas sp y se determinó el total de células por mililitro en el
cultivo original por vía de contaje directo de las células en una cámara de Neubauer.

MATERIALES Y EQUIPOS.

- 2 ertulas de 125 estériles.

- 1 pipetero con: 45 pipetas de 0,1 mL, 3 pipetas de 0,2 mL ESTERILES, 2 pipetas de
1 mL y 2 pipetas de 10 mL.
- 40 tubos de ensayo con 10 mL de solución salina estéril.
- 10 placas con agar nutritivo estéril.
- 2 tubos de ensayo.
- 2 pipetas Pasteur + perita de goma.
- 1 asa de vidrio.
- 1 mechero.
- 1 fotocolorímetro Klett-Sumerson.
- 1 cámara de contaje celular Neubauer.
 Al equipo 4 se le asignó la siguiente condición:

Tabla l: Condiciones de trabajo asignadas al equipo.

Fuente de carbono Temperatura (°C) Agitación

Galactosa 37 SI
Acetato 37 SI

RESULTADOS Y DISCUSIONES.

Método l: Contaje indirecto de células procariotas.

Tabla 2: Resultados obtenidos en cuanto a la densidad óptica en la metodología l (intervalo de

3 horas)

D.O Plaqueo
Tiempo
Galactosa Acetato
T0 11:10 0,099 0,101 √
T1 11:30 0,126 0,132
T2 11:50 0,153 0,147 √
T3 12:10 0,155 0,149
T4 12:30 0,169 0,159 √
T5 12:50 0,219 0,196
T6 01:10 0,272 0,219 √
T7 01:30 0,299 0,24
T8 01:50 0,331 0,253 √
T9 02:10 0,356 0,26

En la tabla 2 se observan los resultados obtenidos en el primer experimento. A partir de las

11:10 am se empezó a medir las densidades ópticas del cultivo (se tomó este tiempo como
T0), desde este momento se tomaron sucesivas mediciones en el espectrofotómetro cada 20
minutos. El plaqueo se realizó cada 40 minutos en los tiempos pares utilizando como muestra
el cultivo que contiene como única fuente de carbono galactosa, debido a que asumimos que
se obtendrá un mayor rendimiento energético en comparación al acetato ( figura 2). Las
densidades ópticas medidas reflejan un aumento considerable desde la primera medición en
T0 hasta la última medican en T9 pasadas las 3 horas esto debido que existe una relación
entre el aumento de la D.O y la cantidad de células encontradas en el cultivo, mientras mayor
sea el número de células en suspensión, menor es la cantidad de luz que atraviesa el medio y
por lo tanto los valores de D.O obtenidos serán mayores. El blanco que se utilizó para calibrar
el espectrofotómetro fue una solución que contiene el medio nutritivo sin el cultivo
bacteriano. Este blanco se utilizó para eliminar la absorbancia producto del medio nutritivo
y determinar únicamente la densidad óptica debida a la presencia del cultivo bacteriano. Para
conocer la dilución global de trabajo se debe realizar la primera medición de la densidad
óptica antes de inocular, de esta manera se obtiene un valor inicial de D.O con el cual se
realizó el siguiente cálculo:

1DO  500UK
cel
1UK  2  10 6
mL

Para el cultivo con Galactosa

1 DO  500UK

0,099DO  49,5 UK  Medida mayor a 40

UK por lo tanto se trabaja con una dilución de 1x10 6

Para el cultivo con Acetato

1 DO  500UK

0,101 DO  50,5UK  Medida mayor a 40

UK por lo tanto se trabaja con una dilución de 1x10 6

De manera general se observa que utilizando galactosa se obtienen mayores valores de

D.O desde T2 hasta T9 en comparación a los valores obtenidos con acetato. Esta tendencia
no se cumple entre T0 y T2 porque el cultivo entra en una fase de latencia (gráfico 1 ), en
esta fase la galactosa se degrada por un proceso metabólico en el cual contribuyen enzimas
que degradan la molécula a glucosa (figura 3).
Figura 2: Rendimiento energético de las fuentes de carbono utilizadas en la práctica.
Modificado de (4).

0,4

0,35

0,3
D.O (Galactosa)

0,25

0,2

0,15

0,1

0,05

0
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
Tiempo (min)

Grafico 1: Relación DO Vs Tiempo (intervalo de 3 horas) utilizando Galactosa como fuente

de carbono.

En el gráfico 1 se observa la tendencia de crecimiento bacteriano utilizando galactosa

como única fuente de carbono. Desde T0 hasta T2 se observa una fase de latencia o de
preparación en donde la tasa metabólica es alta, luego a partir de T4 se observa que el
crecimiento se vuelve exponencial. Esto implica que la molécula de galactosa se degrada
en glucosa durante la etapa de latencia en los primeros minutos de incubación, y luego la
molécula de glucosa es incorporada al metabolismo vía glucólisis.
Figura 3: Metabolismo de Galactosa y sus respectivas enzimas. La galactosa es fosforilada a
Galactosa 1- fosfato. Una molécula de glucosa, es canalizada a la glucólisis al ser fosforilada por
la enzima glucokinasa. Modificado de (5).

Cuando se utiliza como única fuente de carbono el acetato E. coli obtiene la mayoría de su
energía metabólica por medio del ciclo de Krebs (3, 6) de este modo las rutas metabólicas
que utilizan glucosa como única fuente de carbono proporcionan mayor rendimiento
energético debido a que se degrada la molécula a glucosa vía glucólisis, mientras que con
acetato se obtiene menor rendimiento energético cuando la molécula va de manera directa al
ciclo de Krebs. Una molécula de acetato forma una molécula de Acetil-CoA (figura 4) que
se une al oxalacetato por medio de una reacción catalizada por una enzima de tipo transferasa
formado citrato en el paso 1 del ciclo de Krebs (figura 5).
Figura 4: Ruta de conversón de la molécula de Acetato a Acetil- Coa para su posterior entrada
al ciclo de Krebs.

Figura 5: Visión general del ciclo de Krebs. En la paso 1 una molécula de Acetil- coa se une al
oxalacetato para formar citrato.
 0,3

0,25

0,2
D.O ( Acetato)
0,15

0,1

0,05

0
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
Tiempo (min)

Grafico 2: Relación DO Vs Tiempo (intervalo de 3 horas) utilizando Acetato como fuente de

carbono.

En el gráfico 2 se observa el crecimiento bacteriano utilizando acetato como fuente de

carbono. La tendencia de crecimiento es similar a la obtenida con galactosa. Sin embargo, la
densidad óptica observada en la curva desde T4 a T9 es menor a la obtenida para la galactosa,
por lo que se infiere que la velocidad de crecimiento en los cultivos que usan acetato como
fuente de energía es menor. Además T8 y T9 parecen representar el momento en el cual se
alcanza la fase estacionaria en el crecimiento bacteriano para los cultivos que usan acetato
como fuente de energía.

DETERMINACIÓN DE CÉLULAS VIABLES EN EL CULTIVO.

Tabla 2: Resultados obtenidos en cuanto al número de colonias y título bacteriano luego de 24

horas de incubación.

Tiempo Número de colonias Titulo bacteriano

T0 620 6200000000
T2 164 1640000000
T4 No determinado No determinado
T6 3992 39920000000
T8 1652 16520000000
El conteo directo del número de colonias se realizó pasadas las 24 horas de incubación. Se
observa que el número de células viables por mililitro, es decir el título bacteriano supera el
orden de 10 6 células por mL, este resultado esta fuera del rango esperado ya que se esperara
que los valores fueran menores ya que se hizo una dilución del cultivo global en cada uno de
los instantes. Podemos inferir que en las placas no solo crecieron colonias de Escherichia
coli, y que dadas las condiciones de poca esterilidad y la propensión a contaminación que
presentó el cultivo, el valor total del número de colonias fue sobreestimado al contar
directamente otras cepas bacterianas posiblemente presentes en la siembra. En la placa
sembrada en T4 resultó difícil contar el número de colonias presentes, debido a que el césped
bacteriano era abundante, lo cual es consistente con la hipótesis de contaminación del cultivo.

0,35
T8
0,3
T6
0,25
D.O. (Galactosa)

0,2
T4
0,15 T2

0,1 T0

0,05

0
0 1E+10 2E+10 3E+10 4E+10 5E+10
Cél/mL

Gráfico 3: Relación DO Vs células/mL por tiempo.

Los resultados obtenidos en este experimento no son consistentes con lo esperado. En el

gráfico 3 se relaciona la densidad óptica con el número de células viables por mililitro.
Teóricamente se esperaría una relación proporcional entre ambas variables, sin embargo, esta
relación no es apreciable en los resultados obtenidos. Esto concuerda con la hipótesis de
contaminación del cultivo y no se pueden utilizar estos datos para calcular el tiempo
generacional, debido a que no es posible observar la fase de crecimiento exponencial.
 MATEMÁTICAS DEL CRECIMIENTO EXPONENCIAL

Cuando se inocula una bacteria en un medio y ha transcurrido el tiempo de generación

de este microorganismo, se forman dos células, (7) después de otra generación cuatro células
después de la tercera generación ocho células. Es decir en cada generación sucesiva se
duplica la población por fisión binaria. La relación que existe entre el número de células y
las generaciones de un cultivo creciendo en forma exponencial, puede deducirse
matemáticamente de la manera siguiente:
Se designa como:
x = Nº de bacterias al tiempo 0
y =Nº de bacterias al tiempo t
t = tiempo en crecimiento exponencial
Al tiempo 0, y = x
Después de: 1 generación, y = 2x
2 generaciones, y = 2(2x) = 22x
3 generaciones y = 2(22x) = 23x
n generaciones y = 2nx (a)
Para calcular n (número de generaciones)
Resolviendo la ecuación (1) para n se tiene:
log y = log x + n log 2
𝐥𝐨𝐠 𝒚 − 𝐥𝐨𝐠 𝒙
𝒏=
𝐥𝐨𝐠 𝟐

Si se sustituye en la ecuación anterior log 2 por su valor 0.3010, se tiene que 1/0.3010 = 3.3
𝒚
𝒏 = 𝟑, 𝟑 𝐥𝐨𝐠
𝒙
Por consiguiente, aplicando la ecuación anterior puede calcularse el número de
generaciones que han tenido lugar, siempre que se conozca la población inicial x, y la
población y después del tiempo t.
El tiempo de generación G es igual a t (tiempo transcurrido en fase exponencial para llegar
de x a y) dividido por el número de generaciones n, o sea:
G= t/n
 La fase exponencial es el período de la curva de crecimiento en el cual el
microorganismo crece exponencialmente (figura 6), es decir que cada vez que pasa un
tiempo de generación la población se duplica bajo condiciones apropiadas de temperatura,
composición del medio de cultivo, etc.

Figura 6: Curva de crecimiento bacteriano. Modificado de (7)

CONDICIONES DE CRECIMIENTO ÓPTIMO EN: E.coli

Estas bacterias se multiplican a temperaturas entre 6 y 50º C, con una temperatura

óptima alrededor de 37º C, condición utilizada en el ensayo del ejercicio IIA, simulando la
temperatura fisiológica del cuerpo humano(8). E. coli es capaz de crecer en condiciones
aerobias (respirando O2) pero también puede desarrollarse facultativamente en condiciones
anaeróbicas mediante la fermentación (9), siendo el metabolismo aerobio más eficiente que
el anaerobio, en el ensayo se trabajaron las incubaciones con agitación, es decir se le
proporcionó al medio de cultivo condiciones aerobias de crecimiento. E coli es una bacteria
heterótrofa (10) , su fuente de carbono es orgánica (si bien otros elementos distintos del C
pueden ser captados en forma inorgánica), entre los microorganismos heterótrofos, una de
las fuentes más típicas de carbono consiste en glucosa, en el ensayo se utilizaron dos fuentes
de carbono organicas como la galactosa y el acetato. En el intestino humano se degradan y
absorben los carbohidratos provenientes de la dieta, es por eso que este medio es favorable
para la proliferación de las poblaciones bacterianas específicamente de E. coli.

CONCLUSIONES

 El método de conteo indirecto (densitométrico) resultó más efectivo que el conteo

directo de las colonias en las placas, debido a que este último método estuvo sujeto a
sobreestimaciones del título bacteriano.

 Tanto la temperatura como las condiciones de oxigeno empleados en el ensayo fueron

las ideales para el crecimiento de E. coli debido a que se asemejan a las condiciones
ambientales óptimas en las que se desarrolla este microorganismo.

 La fuente de carbono empleada en el ensayo que resultó más eficiente para el

crecimiento de E. coli fue la galactosa, debido a que se obtiene un mayor rendimiento
energético metabolizando este carbohidrato en comparación al rendimiento
metabólico obtenido utilizando acetato como única fuente de carbono.

BIBLIOGRAFIA

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edición. Editorial Pearson. Nueva York, E.E.U.U.

2) Benintende, S. y C. Sánchez. Unidad temática 3: Crecimiento bacteriano. Cátedra de

Microbiología agrícola. Universidad Nacional de Entre Ríos. Disponible en:
http://www.fca.uner.edu.ar/files/academica/deptos/catedras/microbiologia/unidad_3_cre
cimiento_bacteriano.pdf [Consulta: 9 de noviembre de 2016]
3) MacFaddin, J.F. 2003 Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica: Prueba de citrato. Tercera edición. Editorial Médica Panamericana,
Buenos Aires, Argentina.

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Biología Molecular y Bioquímica. Universidad Nacional Autónoma de México.
Editorial Pearson. Ciudad de México, México.

5) Esteban, Carlos. 2004. Caracterización molecular de la represión por catabolito e

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Disponible en: http://www.probioticosysalud.com/tesis-doctoral/introduccion/iv-
metabolismo-de-la-lactosa-y-regulacion-del-operon-lac-de-lactobacillus-casei/iv-1-
transporte-y-metabolismo-de-la-lactosa-en-bacterias-lacticas/ y
https://www.educacion.gob.es/teseo/imprimirFichaConsulta.do;jsessionid=A63DC4AE
DFE75F9BC37FC3A19A719500?idFicha=103429. [Consultado: 9 de noviembre de
2016]

6) Voet, D. y J.G. Voet. 2004. Bioquímica. Sección 17-14: Regulación y control metabólico.
Tercera edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.

7) Pedrique de Aulacio, M. y N. de Castro. 2008. Cátedra de Microbiología, Tema 6:

Reproducción y Crecimiento Microbiano. Facultad de Farmacia, UCV. Disponible en:
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/
08_Tema_6_crecimiento.pdf [Consulta: 12 de noviembre de 2016]

8) Elika, Fundación Vasca para la Seguridad Agroalimentaria. 2013. Escherichia Coli.

Disponible en: http://www.elika.eus/datos/pdfs_agrupados/Documento84/3.Ecoli.pdf
[Consulta: 9 de noviembre de 2016]
9) Unden, G., Becker S., Bongaerts J., Schirawski J. y S. Six. 1994. Oxygen regulated
gene expression in facultatively anaerobic bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek 66(1-
3):3-22.

10) Sitio web de Consulta de Microbiología general, Universidad de Granada. Nutrición

microbiana. Disponible en: https://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/11nutrientes.htm
[Consultado: 9 de noviembre de 2016]
11) Pica Granados, Y., Ronco, A. y M.C., Díaz Báez. 2004. Capítulo 4: Protocolos de
ensayo.En: Castillo Morales, G (ed). Ensayos Toxicológicos Y Métodos de Evaluación
de Calidad de Aguas: Estandarización, Intercalibración, Resultados y Aplicaciones.
Primera edición. Instituto Mexicano de Tecnología del Agua. México.

ANEXO

Conteo microscópico directo

Es una técnica común y rápida que utiliza un equipamiento fácilmente

disponible en un laboratorio, ya que consiste en contar con un microscopio la cantidad
de células presentes en un volumen determinado. Para estos recuentos se utilizan
generalmente cámaras de recuentos (cámara de Neubauer – Figura Anexo 1). (11)
La cámara de Neubauer consta de un cubreobjetos de cuarzo y un portaobjetos de un
grosor mayor a los de uso común. En la parte superior del portaobjetos se encuentran
cuatro canales longitudinales y uno transversal central. En la parte superior e inferior
del canal transversal están grabadas dos rejillas de 9 mm2 de superficie, las cuales
están a su vez subdivididas en una cuadricula más pequeña. Usando el objetivo de
10X de un microscopio óptico se enfoca de forma que en el campo se cubra un
cuadrado cuya área corresponda a 1 mm2, generalmente se trabaja con el cuadro
central. El área del cuadro central es de 1mm2 y se encuentra subdividida en 25
cuadrados. Cada uno de estos cuadrados mide 0,2 mm de lado por lo que el área de
cada uno será de 0,04 mm2.
 Al colocar el cubreobjetos sobre el portaobjetos se tiene una profundidad de 0,1 mm
de forma que el volumen contenido en cada uno de los cuadrados grandes será 0,1
mm3.

El conteo con la cámara de Neubauer se lleva a cabo de la siguiente manera (Figura

Anexo 2) :

 Limpiar con papel de arroz la cámara.

 Colocar el cubreobjetos sobre los canales
 Con ayuda de una pipeta de 1mL, o con una micropipeta de 100 µL , se toman 0,1ml
de la suspensión a analizar, se coloca la punta de la pipeta en el borde del
cubreobjetos, se deja que la solución ingrese a la cámara por capilaridad, sin que pase
a los canales laterales.
 Se localiza el cuadro central de la rejilla , y se hace un cambio de lente al objetivo de
40X y se procede a contar el número de células presentes sobre el mismo.

Figura Anexo 1: Cámara de Neubauer

Figura Anexo 2: Metodología cámara de Neubauer
Tabla Anexo 1: Ventajas y Desventajas del método de conteo directo por cámara de
Neubauer
VENTAJAS DESVENTAJAS
Las exigencias de equipo son Sólo sirve para muestras con cargas
mínimas superiores a 10.000 por ml.

Se pueden observar las Es difícil distinguir los microorganismos de

diferentes morfologías de los las partículas de muestra
Microorganismos.

Es rápido La cantidad de muestra analizada es poca

Brinda información adicional sobre el Es difícil diferenciar los microorganismos

tamaño real de los microorganismos viables de los no viables.
observados.

Tabla Anexo 2: Resultados obtenidos en el conteo directo de Leptomonas sp, utilizando

la cámara de Neubauer.

Cuadrantes Número de organismos

1 32
2 19
3 20
4 23
Promedio X= 23,5
Titulo 2350000