Salares versus ecotipos costeros de quinua: respuestas de salinidad en variedades locales de

hábitats contrastantes

La quinua (Chenopodium quinoa Willd.) Es una especie altamente tolerante a la sal subdividida en
cinco ecotipos y que exhibe amplias diferencias intraespecíficas en los niveles de tolerancia. En un
estudio de invernadero, las razas locales chilenas pertenecientes al ecotipo de salares (R49) o
tierras bajas costeras (VI-1, Villarrica) con orígenes agroecológicos contrastantes se investigaron
por sus respuestas a la alta salinidad. Se midieron los efectos de dos niveles de salinidad, 100 (T1)
y 300 (T2) mCl NaCl, sobre el crecimiento de la planta y sobre algunos parámetros fisiológicos. La
acumulación de Naþ en hojas y raíces difirió entre las variedades locales. T2 redujo el crecimiento
y el rendimiento de las semillas en todas las variedades locales con una inhibición máxima en
relación con los controles en R49. La salinidad afectó negativamente a la clorofila y al contenido
total de polifenoles (TPC) en VI-1 y Villarrica, pero no en R49. La germinación en solución salina o
el medio de control de semillas cosechadas de plantas tratadas o no con NaCl fue a veces
diferente; la raza local de mejor rendimiento fue R49 en la medida en que el 45,65% de las
semillas germinaron en un medio que contenía NaCl 500 mM. En todas las razas locales, la
longitud promedio de las raíces de las plántulas disminuyó fuertemente al aumentar la
concentración de NaCl, pero las raíces de R49 fueron significativamente más largas que las de VI-1
y Villarrica hasta 300 mM de NaCl. La sal causó aumentos en el TPC de la semilla en relación con
los controles, pero la capacidad de eliminación de radicales fue mayor solo en las semillas de las
plantas T2 de R49. Las proteínas de semilla totales extraíbles con SDS se resolvieron en bandas
distintas (10 e70 kDa) con algunas diferencias evidentes entre las variedades locales. Los cambios
inducidos por la sal en los patrones de proteínas fueron específicos de la raza. Las respuestas a la
salinidad de la raza de salares se discuten en relación con su mejor adaptación a un ambiente
extremo.

1. Introducción

La adaptación de la agricultura a las condiciones climáticas cambiantes, que se espera que

implique un aumento de la salinización del suelo, se basa en el uso de cultivos adecuados que
muestren resistencia al estrés abiótico y biótico. Las investigaciones sobre las respuestas y la
tolerancia a la sal, así como la definición de parámetros para la detección y selección, se han
centrado principalmente en los cultivos convencionales, la mayoría de los cuales son glicofitos.
Algunas investigaciones sobre el cribado de especies halófitas y sus respuestas a las condiciones
salinas están empezando a llamar la atención de los investigadores con vistas a promover la
“agricultura halófita” (Rozema y Schat, 2013).

La investigación básica sobre las reacciones inducidas por el estrés salino morfológico y fisiológico
y los mecanismos de adaptación tanto de los glicofitos como de los halófitos es de suma
importancia para el fitomejoramiento y la selección de los genotipos más adecuados (Shabala et
al. 2013). Los estudios sobre la tolerancia a la sal de las plantas durante diferentes fases
ontogenéticas también son importantes para determinar los límites de solución salina y para
estabilizar el rendimiento del cultivo en condiciones salinas, ya que la tolerancia puede variar en
cada fase (Munns y Tester, 2008).

La quinua (Chenopodium quinoa Willd.), Un antiguo cultivo andino que produce semillas,
pertenece a la Amaranthaceae, una familia que comprende muchas especies halófitas. En las
últimas décadas, la quinua ha atraído la atención de investigadores y consumidores en todo el
mundo debido a su tolerancia a condiciones ambientales desfavorables como la salinidad, la
sequía y las heladas (Bosque-S? Anchez et al. 2003; Jacobsen et al. 2012; Razzaghi et al. 2011;
Adolf et al. 2013; Ruiz et al. 2015) y sus semillas altamente nutritivas (Vega-G? alvez et al. 2010).
Su adaptabilidad se deriva del hecho de que la especie se cultiva desde hace aproximadamente
7000 años alrededor del lago Titicaca en el altiplano andino (altiplano) desde donde se extendió
hasta el norte de Ecuador y el sur de Chile, y de 3800 m sobre el nivel del mar hasta las tierras
bajas costeras. áreas Esta amplia diversificación en términos de hábitats nativos acompañados por
una gran diversidad genética ha llevado a la identificación de cinco ecotipos (o variedades locales
adaptadas a diferentes ambientes): salares (altiplanicies), tierras altas, valles interandinos, yungas
y tierras bajas costeras ( Tapia, 2015). Los salares de los Andes se encuentran principalmente en el
sur de Bolivia, norte de Chile y Argentina. Estos desiertos de tierras altas son extremadamente
áridos (<200 mm de precipitación / año) y las temperaturas a menudo caen por debajo de 20 ° C.
La quinua es el único cultivo que puede crecer en estas condiciones edapohimoclimáticas (Fuentes
et al. 2009). En el centro y sur de Chile, la quinua puede crecer al nivel del mar; aquí, la
precipitación anual, distribuida durante todo el año, varía de 400 a 1500e2000 mm y los suelos
tienen una alta capacidad de retención de agua. En consecuencia, la quinua exhibe un amplio
rango intraespecífico de tolerancia a las condiciones salinas, como lo demuestran los estudios
comparativos en muchas accesiones, variedades locales y variedades diferentes (G? Omez-Pando
et al. 2010; Adolf et al. 2012; Ruiz et al. . 2015; Peterson y Murphy, 2015). Por lo tanto, incluso en
un cultivo halófito como la quinua, la alta salinidad puede influir negativamente en el crecimiento
y en el rendimiento de la semilla (Koyro y Eisa, 2008; Hariadi et al. 2011; Orsini et al. 2011). Sin
embargo, estudios comparativos han demostrado que la medida en que estos parámetros se ven
afectados por la salinidad es fuertemente genotipendente (Adolf et al. 2012; Gómez-Pando et al.
2010). Los genotipos originados en las áreas afectadas por la salinidad generalmente se adaptan
mejor al estrés salino que los de las áreas no salinas (o menos áridas). Esta variabilidad representa
un recurso importante para la selección y la reproducción que abre el camino para una mayor
tolerancia en cultivares adaptados a diferentes altitudes, latitudes, suelos y condiciones climáticas.
En términos de investigación básica, la comparación de respuestas en diferentes genotipos con
sensibilidades variables al estrés salino es un enfoque útil para obtener conocimientos sobre los
mecanismos morfológicos, fisiológicos y moleculares responsables de la tolerancia a la sal en la
quinua y en otros halófitos (Ruiz et al. 2015).

En Chile, todas las variedades y accesiones pertenecen a los salares o al ecotipo costero de tierras
bajas; forman grupos genéticamente distintos con diferencias evidentes en términos de origen
geográfico, condiciones del suelo / clima y prácticas culturales tradicionales con diferentes niveles
de adaptación a la altitud, la sequía, la salinidad y la duración del día (Bazile et al. 2015). Delatorre-
Herrera y Pinto (2009) llegan incluso a sugerir que las variedades locales de quinua del altiplano
norte están más cerca de los halófitos o halófitos facultativos, mientras que las selecciones del sur
podrían estar más cerca de los glicofitos. En un estudio comparativo de Adolf et al. (2012), las
variedades locales de las tierras bajas costeras de Chile se encontraban entre las que tenían menor
tolerancia a la salinidad en términos de biomasa y altura. Las variedades locales chilenas que
pertenecen a estos dos ecotipos no se han caracterizado completamente desde un punto de vista
ecofisiológico, excepto en algunos casos. En un estudio comparativo entre dos accesiones de la
región montañosa del norte y dos de la región sur menos propensa a la salinidad, Delatorre-
Herrera y Pinto (2009) informaron una mayor tasa de germinación bajo 400 mM de NaCl de
semillas de las tierras altas y mostraron que el osmótico y los componentes iónicos del estrés
salino variaron entre las variedades locales. Ruiz-Carrasco et al. También compararon cuatro
variedades chilenas originadas a lo largo de un gradiente norte-sur. (2011). La tasa de germinación
y el crecimiento de las plántulas en medios suplementados con NaCl, así como varios parámetros
fisiológicos y moleculares, como los contenidos de prolina y poliamina, y los niveles de
transcripción de los genes relacionados con la homeostasis iónica (CqSOS1 y CqNHX) medidos en
la etapa de plántula, distinguen al extremo sur Landrace de los demás.

En el presente trabajo, evaluamos cómo una raza chilena de quinua del altiplano hiperárido norte
perteneciente al ecotipo de salares (R49) y dos pertenecientes al ecotipo de las tierras bajas
costeras pero con orígenes en diferentes hábitats: la zona central con un semiárido / El clima
mediterráneo (secano costero) y la zona húmeda del sur (Pizarro et al. 2012) respondieron a la
salinidad al final de su ciclo de crecimiento. Intentamos responder las siguientes preguntas: a) ¿el
nivel de tolerancia está determinado por el hábitat original, b) qué parámetros son indicadores de
tolerancia al estrés, c) la salinidad afecta la calidad de la semilla? Las plantas se cultivaron en
macetas en condiciones de invernadero y se irrigaron con soluciones salinas (NaCl 100 y 300 mM)
desde el establecimiento de las plántulas hasta la cosecha. Para evaluar su adaptación a largo
plazo, se determinaron el crecimiento de las plantas y los parámetros fisiológicos durante y al final
del ciclo de crecimiento. La productividad en términos de producción de semilla fue evaluada en la
cosecha. La germinabilidad y el crecimiento de las plántulas en medio salino (ensayo in vitro) de
semillas de plantas cultivadas con sal y de control se compararon en las diferentes variedades
locales. Finalmente, se evaluó la calidad de la semilla en términos de concentración y perfil de
proteína total, contenido total de polifenoles y actividad antioxidante.

2. Materiales y métodos

2.1. Material vegetal y condiciones de crecimiento.

Semillas de tres variedades locales de C. quinoa (Willd.), Una perteneciente al ecotipo de salares
(R49) y dos, VI-1 y Villarrica (VR), al ecotipo de las tierras bajas costeras se recolectaron a lo largo
de un gradiente altitudinal del árido norte tierras altas con suelos salinos (3800 msnm) hasta el
nivel del mar, ya lo largo de un gradiente latitudinal de ca. 2500 km hasta la región más lluviosa del
centro / sur (ca. 34 ° a 39 ° S) con mayor precipitación y suelos no salinos (Tabla 1). Todas las
semillas se obtuvieron del Banco Nacional de Semillas de Chile administrado por INIA-Intihuasi
(Vicuña, Chile).

Los experimentos en invernadero se llevaron a cabo con semillas vernalizadas sembradas en

macetas de plástico de 20 l que contenían una mezcla de suelo de jardín: arena (1: 1). Cuando las
plantas tenían de cuatro a seis hojas bien expandidas (ca. 34 días después de la siembra), se inició
el tratamiento con sal irrigando macetas semanalmente con soluciones de NaCl 0, 100 o 300 mM
(control, T1 y T2, respectivamente); todas las macetas (control y tratamiento con sal) también se
regaron semanalmente con 100 a 200 ml de agua suplementada con fostrógeno (N: P: K 10:10:27;
0,4 g L? 1; Bayer Garden, Cambridge, Reino Unido). Las plantas se cultivaron (de octubre a abril) en
condiciones de luz natural y la temperatura se mantuvo a ca. 23 ± 3? C.

La fenología se controló semanalmente comenzando 36 días después de la siembra hasta el final

del experimento (es decir, en el momento de la cosecha). La medición de la altura de la planta y el
muestreo de las hojas se llevaron a cabo 84 días después de la siembra cuando todas las plantas
de control habían alcanzado la etapa de grano lechoso. Se recogieron muestras (n ¼ 6) de hojas
maduras totalmente expandidas, se congelaron inmediatamente en N2 líquido y se almacenaron a
80ºC hasta su uso para determinaciones de pigmentos, polifenoles y flavonoides. Las plantas
enteras (hojas, tallos, raíces y semillas) se cosecharon a partir de 110 días después del primer
tratamiento con sal, dependiendo de la raza nativa. El peso seco de toda la planta, la raíz y la hoja
(DW) se evaluó secando en un horno a 40 ° C durante cinco días hasta alcanzar un peso constante.
Las muestras secas se utilizaron para medir la concentración de Naþ en los órganos de las plantas.
Las semillas se recolectaron, pesaron y almacenaron en un recipiente hermético a 4 ° C hasta su
uso; Las alícuotas de las semillas se liofilizaron.

2.2. Conductividad eléctrica del suelo y determinaciones del contenido de sodio de la planta.

La conductividad eléctrica (EC) en el suelo se midió, al final del experimento, tomando tres réplicas
de 150 g de suelo de cada maceta. Las muestras se saturaron con agua y, después de 24 h, las
muestras saturadas se filtraron al vacío. La EC se determinó utilizando un medidor de
conductividad OakTon de banco (modelo serie CON510, Vernon Hills, Illinois, EE. UU.). En la
cosecha, se cuantificó [Naþ] en hojas, tallos y raíces (aprox. 500 mg DW) como lo describen Tapia
et al. (2013). Cada réplica se digirió con 10 ml de Milli-Q H2O, 3 ml de HNO3 y 2 ml de H2O2 en un
autoclave. El [Naþ] en los extractos digeridos se determinó mediante espectrometría de absorción
atómica (AAS).

2.3. Pigmentos fotosintéticos

La extracción de pigmentos (clorofilas y carotenoides totales) se llevó a cabo con luz tenue para
minimizar la transformación de la clorofila. Las muestras de hojas (equivalentes a 2 cm2; aprox. 50
mg FW) se molieron en un mortero frío con 10 volúmenes de metanol frío al 100% (v / v). El
extracto se centrifugó a 5000 rpm durante 10 minutos a 4ºC, y el sobrenadante se mantuvo a 4ºC.
El sedimento se resuspendió en la misma solución y se centrifugó tres veces a 5000 rpm durante
10 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes se agruparon y la absorbancia se determinó
espectrofotométricamente en un espectrofotómetro de microplacas (Epoch, BioTek Instruments;
Vermont, EE. UU.). Las lecturas se realizaron a 665 para Chla, 652 para Chlb y 470 nm para
carotenoides totales (la suma de carotenoides y xantofilas, c þ x). Las concentraciones de
pigmento se estimaron con base en los coeficientes de absorbancia específicos en extractos
metanólicos como se describió anteriormente por Lichtenthaler (1987). Los resultados se expresan
en mg g? 1 FW.

2.4. Preparación de extractos de metanol.

2.4.1. Hojas

Se molieron aproximadamente 50 mg de tejido fresco de la hoja en 10 volúmenes de metanol al

100% (v / v). El homogeneizado se sonicó durante 30 minutos y se centrifugó durante 20 minutos a
4000 rpm. El sobrenadante se separó y el sedimento se lavó dos veces con metanol al 100% y se
centrifugó durante 5 minutos a 3000 rpm. Los sobrenadantes se agruparon y almacenaron a 20ºC
hasta su uso.

2.4.2. Semillas

Para la determinación de polifenoles y los ensayos de actividad antioxidante, 20 semillas

liofilizadas (aprox. 50 mg DW) se trituraron hasta obtener un polvo en un mortero. Después de
agregar 2 ml de metanol al 100%, la suspensión se sonicó durante 30 minutos y luego se
centrifugó durante 20 minutos a 10.000 rpm. Después de recoger el sobrenadante, el sedimento
se resuspendió con 1 ml de metanol y se dejó durante 40 minutos a 30ºC; después de centrifugar y
separar el sobrenadante, el sedimento se volvió a extraer mediante la adición de 1 ml de metanol
y se dejó durante la noche en agitación (200 rpm) a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se
agruparon y se llevaron a sequedad a presión reducida. El extracto seco se resuspendió en 500 ml
de metanol y se almacenó a aproximadamente 20ºC hasta su uso. Se realizaron extractos de
metanol de semilla en tres réplicas biológicas.

2.5. Determinación del contenido total de fenólicos.

El contenido de fenoles totales (TPC) en hojas y semillas se determinó utilizando el reactivo de

Folin-Ciocalteu (FC) de acuerdo con Singleton y Rossi (1965) con algunas modificaciones; Se
mezclaron 50 ml del extracto metanólico con 0,25 ml de reactivo FC (previamente diluido 10 veces
con agua destilada) y se agregaron 0,5 ml de agua destilada. El homogeneizado se incubó durante
1 minuto a temperatura ambiente y luego se agregaron 0,8 ml de Na2CO3 al 20% (p / v). Después
de la incubación a 40ºC durante 30 min, la absorbancia se midió espectrofotométricamente a 760
nm. El TPC se evaluó a partir de una curva estándar de ácido gálico y se expresa como mg de
equivalentes de ácido gálico (GAE) g? 1 FW (hojas) o DW (semillas). El contenido total de
flavonoides se determinó con AlCl3 de acuerdo con Zhishen et al. (1999) utilizando la rutina como
estándar. El extracto metanólico de la hoja (50 ml) se añadió a 0,45 ml de metanol al 100% (v / v)
seguido de 0,5 ml de AlCl3 al 2% (p / v) en metanol. Esta mezcla de reacción se incubó durante 15
minutos a temperatura ambiente. Finalmente, la absorbancia de 0,25 ml de la mezcla de reacción
se midió espectrofotométricamente a 430 nm. Los datos se expresan como mg equivalentes de
rutina (RE) g? 1 FW.

2.6. Producción de semillas y germinación.

La producción de semillas en las tres variedades locales se evaluó pesando las semillas producidas
por cada planta al final del experimento (es decir, en la cosecha); También se determinó el FW y
DW de 20 semillas. Para evaluar la capacidad de germinación de las semillas cosechadas de plantas
cultivadas en condiciones salinas o no salinas, se realizó una prueba in vitro. Las semillas se
esterilizaron con etanol al 70% (v / v) seguido de lejía comercial al 10% y luego se enjuagaron
varias veces en agua estéril. Después de 48 h de vernalización a 4ºC, las semillas se sembraron en
placas de agar que contenían medio Murashige y Skoog (1962) de media concentración, añadido
con NaCl 0, 100, 300 o 500 mM. Las placas se colocaron verticalmente en una cámara de
crecimiento a 24 ° C con un fotoperíodo de luz / oscuridad de 8/16 h y una intensidad de luz de
120 mE m? 2 s? 1. La germinación (%) se evaluó 10 días después de la siembra, cuando el software
ImageJ evaluó la longitud de la raíz y el hipocotilo (Abramoff et al. 2004).

2.7. Ensayos antioxidantes

Las pruebas de 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) y FRAP-Ferrozina (FZ), realizadas por este último
para evaluar el potencial reductor de los extractos hacia el par redox Fe3þ / Fe2þ, se realizaron de
acuerdo con Venditti et al. (2013). En los ensayos, el extracto metanólico se probó a varias
concentraciones (diluyéndolo 1: 1, 1: 2, 1: 4, 1: 8) y Trolox se usó como estándar en un rango de
concentración de 0e33 mM. La capacidad antioxidante se expresó como Capacidad Antioxidante
Total (TAC) expresada como equivalente de Trolox mM mg? 1 DW.

2.8. Análisis de proteína de semilla.

2.8.1. Contenido total de proteínas extraíbles

Las semillas liofilizadas (50 mg DW) se trituraron hasta obtener un polvo. La harina se desengrasó
durante la noche con hexano bajo agitación continua y luego se secó al aire a temperatura
ambiente. Las proteínas totales se extrajeron en condiciones reductoras en la siguiente solución
tampón: dodecilsulfato sódico (SDS) al 4%, glicerol al 20%, 2-mercaptoetanol 200 mM en TriseHCl
100 mM, pH 6,8 Se añadió tampón