AC. VANILMANDÉLICO (A. VM.

EQUIPAMENTOS E MATERIAIS NECESSÁRIOS NÃO

BIOQUÍMICA CLÍNICA
FINALIDADE
Sistema colorimétrico para determinação de Ácido FORNECIDOS
Vanilmandélico na urina. • Espectrofotômetro que meça absorvâncias em 460nm,
Somente para uso in vitro. 510nm e 560nm.
• Centrífuga
• Agulha longa com aspirador ou seringa.
PRINCÍPIO
• Tubos de ensaio.
Em pH ácido, o Ácido Vanilmandélico (A.VM.) é extraído da
• Pipetas graduadas.
urina por Acetato de Etila, sendo posteriormente recuperado • Pipeta semi-automática de 50µL.
em solução alcalina (Carbonato de Potássio 1M). Após • Ponteiras descartáveis.
tratamento com sal diazôneo de p-Nitroanilina forma-se um • Clorofórmio grau U.S.P. ou p.a.
azoderivado cujo complexo é purificado com Clorofórmio. • Cronômetro.
O produto final é extraído em solução alcalina (Hidróxido
de Sódio 1M) e quantificado ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES
Solução extratora: armazenar à temperatura de 2 a
PARTICULARIDADES DO SISTEMA 30ºC, ao abrigo da luz. Estável até a data de vencimento
O método selecionado por Doles Reagentes é uma indicada no rótulo, se obedecidas as condições de
modificação das metodologias baseadas na reação de armazenamento.
Carbonato de Potássio: armazenar à de 2 a30ºC, ao
copulação entre A.VM. e sal diazóneo da p-Nitroanilina. A
abrigo da luz. Estável até a data de vencimento indicada no
reação processa-se em um único tubo, em tempo inferior a
rótulo, se obedecidas as condições de armazenamento.
20 minutos. O processo de separação seletiva dos
p-Nitroanilina: armazenar à temperatura de 2 a 30ºC,
cromógenos através da extração em clorofórmio e sua ao abrigo da luz. Estável até a data de vencimento indicada
posterior quantificação e correção pela fórmula de ALLEN, no rótulo, se obedecidas as condições de armazenamento.
permite a obtenção de resultados específicos, Nitrito de Sódio: armazenar à temperatura 2 a 8ºC, ao
correlacionados com o método de Pisano (0,99). abrigo da luz. Estável até a data de vencimento indicada no
rótulo, obedecidas as condições de armazenamento.
METODOLOGIA Hidróxido de Sódio concentrado: armazenar à
Richards modificado. temperatura de 2 a 30ºC, ao abrigo da luz. Estável até a
data de vencimento indicada no rótulo, se obedecidas as
REAGENTES E APRESENTAÇÃO condições de armazenamento. Após diluição, armazenar à
Reagentes temperatura de 20 a 30ºC. Estável por 2 anos, se obedecidas
as condições de armazenamento.
Solução extratora: Acetato de Etila p.a, redestilado.
Ácido Clorídrico 5M: armazenar à temperatura de 2 a
Carbonato de Potássio: solução de Carbonato de Potássio
30ºC, ao abrigo da luz. Estável até a data de vencimento
1M, pH 10,3.
indicada no rótulo, se obedecidas as condições de
p-Nitroanilina: solução p-Nitroanilina 3,62mmolar em armazenamento.
Ácido Clorídrico 0,1M. Ácido Cítrico 1,2mMol: armazenar à temperatura de 2 a
Nitrito de Sódio: solução 0,82M de Nitrito de Sódio. 30ºC, ao abrigo da luz. Estável até a data de vencimento
Hidróxido de Sódio concentrado: solução 5M de indicada no rótulo, se obedecidas as condições de
Hidróxido de Sódio. armazenamento.
Ácido Clorídrico 5M: solução de Ácido Clorídrico 5M. A.VM. Solução padrão 10mg/L: armazenar à
Ácido Cítrico 1,2mMol: solução 1,2mMol de Ácido Cítrico. temperatura de 2 a 8oC. Estável até a data de vencimento
indicada no rótulo do frasco, se obedecidas as condições
A.VM. Solução padrão 10mg/L : cada frasco contém
de armazenamento.
0,2mg de Ácido Vanilmandélico, sob forma liofilizada.
Após recostituição, tem-se solução de Ácido Vanilmandélico CUIDADOS E PRECAUÇÕES COM O USO DOS
10mg/L REAGENTES
Todos os reagentes são somente para uso diagnóstico
Apresentação in vitro. Seu manuseio deve ser cuidadoso, evitando-se
contato com pele e mucosas. Deve-se ter extremo cuidado
Solução Extratora 1x 65mL no manuseio do Ácido Clorídrico 5M. A exposição ou contato
da pele e mucosas ao Ácido Clorídrico pode levar a
Carbonato de Potássio 1 x 103mL queimaduras.
O descarte do material utilizado deverá ser feito
p-Nitroanilina 1x 50mL obedecendo-se aos critérios de biossegurança estabelecidos
pelo laboratório, de acordo com as normas locais, estaduais
ou federais.
Nitrito de Sódio 1x 6mL
Observar ainda a simbologia
constante nos rótulos do produto:
Hidróxido de Sódio concentrado 1x 4mL
Corrosivo Irritante
Ácido Clorídrico 5M 1x 5mL AMOSTRA
Urina de 24 hs. A urina deve ser colhida em frasco contendo
Ácido Cítrico 1,2mMol 1x 4mL 10mL de Ácido Clorídrico p.a (A.VM é instável em pH neutro
ou alcalino).
O paciente deve ser orientado para se abster de ingerir
A.VM. Solução padrão 10mg/L 1x 2mL
chocolate, café, chá, bananas e alimentos contendo vanilina
(em geral doces) nos três dias anteriores à coleta.
NÚMERO DE TESTES Todas as amostras biológicas devem ser
16 testes consideradas como potencialmente infectantes.

SAC: (62) 3269 0000 (Grande Goiânia) / 0800 644 6433 (Demais localidades) / FAX: (62) 3269 0001 1/4
 PROCEDIMENTO TÉCNICO • A curva de calibração é a representação gráfica da relação
Preparo da solução de Hidróxido de Sódio 0,1M: entre os valores das absorvâncias com os valores das
Adicionar a solução concentrada de Hidróxido de Sódio a concentrações de um conjunto de soluções padrão. São
uma proveta e acertar o volume a 200mL com água destilada necessários três passos para confeccioná-la: (1) preparo
ou deionizada. Rotular com a etiqueta anexa. Após a diluição das soluções padrão; (2) medição dos valores de
armazenar a temperatura de 20 a 30ºC. Estável por 2 absorvância das soluções padrão, de acordo com o
anos se obedecidas as condições de armazenamento. especificado no procedimento técnico da presente
instrução de uso, e (3) montagem de um gráfico, em
Preparo da A.VM. solução padrão 10mg/L: papel especial, linear, onde são relacionados os valores
Acrescentar 2,0mL de Ácido Cítrico 1,2mMol ao liofilizado. de absorvância com os de concentração, conforme
Tampar e inverter várias vezes o frasco até que haja solução demonstrado na figura acima.
total. Após a reconstituição armazenar entre 2-8ºC. Estável As dosagens para montagem desta curva foram feitas
por 60 dias se obedecidas as condições de armazenamento. em um espectrofotômetro “Ultrospec III”, Pharmacia
A presença de precipitado na solução não invalida o Biotec, comprimento de onda de 510nm e cubetas com
Reagente. passagem de luz de 10mm.
Essa curva é apenas demonstrativa e as leituras foram
Extração: feitas em apenas um comprimento de onda (510nm).
1.Acrescentar a um tubo de ensaio: 0,5 mL de urina; 2 A curva de calibração demonstra a linearidade da reação
gotas de Ácido Clorídrico 5M e 4 mL de solução extratora. até uma determinada concentração, na qual pode ser
•

Tampar o tubo e agitar vigorosamente por 60 segundos. determinado um fator de calibração (F) de acordo com a
2.Centrifugar por 2 min., a 1.000 rpm para acelerar a Lei de Beer.
separação em duas camadas. A reação é linear até a concentração de 40mg/L
3.Usando agulha longa, aspirar toda a camada inferior (Ác. (ver curva acima). Obtendo-se valores mais
•

Clorídrico + urina). elevados, diluir a amostra e proceder-se à nova

4.Acrescentar ao tubo 3mL de Carbonato de Potássio 1 M. dosagem. Multiplicar o valor encontrado pelo fator
Agitar e centrifugar como na etapa anterior. Com a mesma de diluição.
agulha, aspirar toda a camada superior (solução O kit de A.VM. Doles possui padrão no intervalo
extratora). de linearidade da metodologia adotada. O
•

5.Paralelamente, preparar um tubo padrão representado laboratório deve realizar o ensaio com o padrão
por 3 mL de Carbonato de Potássio 1 M e 50µL de solução que acompanha o kit e calcular seu fator de
padrão de A .VM. calibração (F) de acordo com o exemplo
estabelecido nos cálculos abaixo.
Diazotação: O fator deverá ser refeito periodicamente e a cada
Preparo do sal diazônio de p-Nitroanilina: em um tubo de lote do produto.
•

ensaio, acrescentar 3mL de p-Nitroanilina e 3 gotas de Os padrões utilizados na curva de calibração foram
Nitrito de Sódio e agitar. A solução fica incolor. Usar preparados a partir do produto dl-4-Hidroxy-3-Methoxy-
•

imediatamente após o trabalho. Mandelic Acid (VMA), cod. H-0131 ( Sigma Chemical
Aos tubos representados pelo padrão (P) e teste (T), Company).
acrescentar 1 mL de p-Nitroanilina diazotada e
homogeneizar. CÁLCULOS

Purificação:
1.Acrescentar 3 mL de Clorofórmio grau U.S.P. ou p.a. a Absorvância corrigida (Ac) seg.Allen:
ambos os tubos. Agitar vigorosamente. Centrifugar.
Proceder rapidamente, pois a fase é sensível à luz.
absorvância 460nm + absorvância 560nm
2.Aspirar toda fase sobrenadante.
Ac = absorvância 510nm -
3.Adicionar à solução clorofórmica 3,5 mL de Hidróxido de
2
Ac T
Sódio 0,1M e agitar fortemente. Centrifugar e aspirar a mg/litro de A.VM.= x 10
fase inferior (clorofórmio). Ac P
vol.urin.24 hs (mL)
Colorimetria:
Excreção de A.VM./vol .urinário de 24 hs = mg/litro A .V.M. x
Determinar as absorvâncias do teste (T) e padrão (P) nos
1000

seguintes comprimentos de onda: 460nm, 510nm e 560nm.

Exemplo:
Volume urinário 24hs: 1.500 mL
Em cada comprimento de onda, zerar o aparelho com o
branco, representado por água destilada ou deionizada.
Leitura Teste Padrão
510nm 0,180 0,170
CURVA DE CALIBRAÇÃO
460nm 0,192 0,116
560nm 0,102 0,100

0 .8 0 0 Padrão Absorvância Conc. 0,192 + 0,102

(mg/L) Ac (teste) = 0,180 - = 0,033
0 .6 0 0 1 0.000 0 2
a b s o r v â n c ia

2 0.075 5
0 .4 0 0
3 0.150 10 0,116 + 0,100
Ac (padrão) = 0,170 - = 0,062
4 0.300 20
0 .2 0 0 2
5 0.450 30
6 0.600 40 0,033
0 10 20 30 40 50
c o n c e n tr a ç ã o
7 0.669 50 mg/litro de A.VM. = x 10 = 5,32
(m g /L )
0,062

Obs.: Não utilizar esta curva para determinar o

1500
Excreção de A.VM./vol. Urinário de 24 hs = 5,32 x = 7,98
resultado de seu ensaio. 1000

2/4
LINEARIDADE:
A reação é linear até a concentração de 40mg/litro.
EXPRESSÃO DOS RESULTADOS EM UNIDADE S.I.
Ácido Vanilmandélico ( µmoL/24 h) = Ácido Vanilmandélico
(mg/24 h) x 5,05
LIMITAÇÕES DO SISTEMA
• Para se obter ótimo desempenho do sistema, é necessário
que o procedimento técnico seja seguido conforme
instruções de uso. Qualquer alteração poderá levar a
resultados errôneos.
Quando da leitura colorimétrica, estar atento para a
perfeita separação da mistura Clorofórmio/Hidróxido de
•
Sódio. Ao decantar o produto final de leitura (solução de
Hidróxido de Sódio corada) para o tubo de leitura, observar
se na parede do tubo não se formam micelas de emulsão
Clorofórmio/água. Tais formações interferem nos
resultados da leitura. Nestas condições, centrifugar
rapidamente o próprio tubo de leitura a 1.000 rpm,
forçando as gotículas de Clorofórmio, para o fundo do
tubo.
Quando da dosagem de AVM em bateladas, em processo
de triagem, as leitura colorimétricas podem se restringir
•
a uma leitura de 510nm. Tanto para o padrão como para
os desconhecidos. Procede-se diretamente aos cálculos.
Nestas condições, a presença de cromógenos artificializa
os resultados em aproximadamente 15% a mais que os
valores teóricos. Aqueles achados dentro dos limites
superiores de normalidades ou acima deverão ser
submetidos à correção da fórmula de Allen para se ter
então os valores reais.
Em substituição ao Clorofórmio, pode-se usar Tetracloreto
de Carbono, com resultados idênticos. Atentar para a
•
maior toxidez do mesmo.
CONTROLE DE QUALIDADE DO SISTEMA
1.A limpeza e a secagem adequada do material a ser utilizado
são de fundamental importância para a estabilidade dos
reagentes e a obtenção de resultados corretos.
2.A água utilizada na limpeza do material, no preparo dos
reagentes e na dosagem, deve ser de boa qualidade.
3.Colunas deionizadoras saturadas liberam íons diversos,
aminas e agentes oxidantes, que deterioram os reagentes.
4.As pipetagens devem ser precisas.
5.Deve-se sempre correr um padrão (P) paralelo ao teste
(T).
VALORES DE REFERÊNCIA
É recomendado que cada laboratório estabeleça sua própria
faixa de valores de referência na população atendida.
A excreção de A.VM. na urina varia em função da idade,
decaindo progressivamente a partir da primeira infância até
a idade adulta. Como referência, aceitam-se como “valores
normais”:
Crianças : excreção de até 12 mg/vol. urinário de 24 horas.
Adultos : excreção de até 8 mg/vol. urinário de 24 horas.
SIGNIFICADO CLÍNICO
A quantidade de A.VM. excretado é uma medida indireta da
secreção endógena das catecolaminas. Seu aumento é
observado, principalmente, no feocromocitoma, uma
neoplasia das células cromafins da medula adrenal.
Normalmente, esses tumores são diagnosticados em
pacientes com 30 a 60 anos de idade, nos quais o aspecto
clínico dominante é a hipertensão. Cerca de 1/3 dos
pacientes tem hipertensão caracterizada por ataques
paroxísticos.
Índices elevados de ácido vanilmandélico são observados
também nos neuroblastomas e ganglioneuromas.O
neuroblastoma é um tumor sólido, próprio da infância.
Aproximadamente 80% dessas neoplasias são encontradas
em crianças de 2 a 5 anos de idade, 35% em crianças com
menos de 2 anos e raramente naquelas com mais de 15
anos de idade. Cerca de 90% dos neuroblastomas elaboram
catecolaminas, principalmente noradrenalina.
O diagnóstico do feocromocitoma ou neuroblastoma pode
ser demonstrado através de aumentos dos metabólitos das
catecolaminas em urina de 24 horas.
Para dosagem de A.VM., nos três dias que antecedem o
exame, o paciente não deverá ingerir nenhuma droga que
possa afetar o metabolismo das catecolaminas ou interferir
na sua determinação. É importante o cumprimento de uma
dieta isenta de café, chá, chocolate, frutas, alimentos
aromatizados com vanilina, sorvetes, refrescos e
refrigerantes em geral.
Diversas condições podem influenciar os níveis urinários
de metabólitos das catecolaminas, tais como:
hipotireoidismo, ingestão maciça de álcool, hipoglicemia,
síndrome de Cushing.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
Foram realizados 40 testes em amostras cujo teor de A.VM.
se situava no intervalo de 2,85 a 14,15mg/vol. urinário 24
horas com a presente metodologia e outra de referência
(Pisano). A comparação do kit de Ácido Vanilmandélico Doles
(Y) com a metodologia mencionada (X) deu origem à
seguinte equação de regressão linear: Y= 0,072 + 1,009X,
sendo o coeficiente de correlação 0,99.
Testes mostraram uma recuperação de 98 +/- 4%.
Repetitividade:
foram realizadas 20 dosagens sucessivas, com uma amostra,
obtendo-se o seguinte resultado:
Concentração mg/vol. urinário 24 horas 6,29
Desvio padrão 0,15
Coeficiente de variação (%) 2,38
Reprodutibilidade:
foram realizadas 20 dosagens durante 20 dias consecutivos,
obtendo-se os seguintes resultados:
Concentração mg/vol. urinário 24 horas 4,85
Desvio padrão 0,23
Coeficiente de variação (%) 4,74
Especificidade: a presente metodologia é específica para
determinação de A.VM. na urina, estando contudo sujeita a
substâncias interferentes. A separação seletiva dos
cromógenos através da extração em Acetato de Etila, o uso
de p-Nitroanilina como diazo reagente e posterior
quantificação e a correção pela fórmula de ALLEN, permite
a obtenção de resultados específicos, que se correlacionam
com o método de Pisano (0,99). O uso da fórmula de Allen
(absorvância corrigida) compreende leituras em 510nm,
460nm e 560nm. Em 510nm é determinada a absorção
máxima. As leituras realizadas em 460nm e 560nm, são
utilizadas na determinação da concentração proveniente de
cromógenos inespecíficos.
3/4
 Sensibilidade: a absorvância encontrada, de 0,017,
corresponde a 1mg/L de concentração de ácido
vanilmandélico, quando realizados em espectrofotômetro a
510nm. A sensibilidade do sistema está estritamente
relacionada com a sensibilidade do aparelho utilizado no
laboratório.

Diluição da matriz: estudos sucessivos de diluição da

matriz mostraram que não há interferência na sensibilidade
diagnóstica da presente metodologia.

Substâncias interferentes: inibidores da MAO e uso de

morfina podem produzir resultados falsamente diminuídos.
Resultados falsamente elevados podem ser encontrados
após o consumo de chá, café, frutas cítricas, baunilha,
banana, manga, chocolate, sorvetes, refrigerantes e
determinados medicamentos como adrenalina,
noradrenalina, L-dopa, ácido acetilssalicílico, amoxicilina e
reserpina dentre outros.

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
• Sunderman Jr. F. W.; Cleveland P. D.; Law N. C.; Sunderman
F. W.: Am. J. Clin. Path. 34: 293-312, 1960.
Pisano et al: Clin. Chim. Acta, 7:285-291, 1962.
Ferreira, V.L.M.: Rev. Bras. Pat. Clin.6: 13, 1969.
•

Gerhard Gumboldt; Clin. Chem.23:1949 - 1950, 1977.

•

Motta, Valter T.: Bioquímica Clínica Edit. Médica Missau 2ª

•

edição, 1989.
•

Wilian Nicolau e cols.: Rev. Assoc. med. Bras., vol. 15 nº

7 p.295-300.
•

D. A . Richards: Medical Laboratory Science (1976) 33,

155-160.
•

Tibúrcio, H.M.: Controle interno da qualidade analítica,

1aed. março/1995.
•

• Doles: dados de arquivo.

TERMOS E CONDIÇÕES DE GARANTIA DA QUALIDADE

DO PRODUTO
As garantias do fabricante ao consumidor seguem
estritamente as relacionadas na Lei n o 8.078, de 11 de
setembro de 1.990 - Código de Defesa do Consumidor.
Todos os reagentes que compõem este sistema par a
diagnóstico são garantidos na sua performance,
reprodutibilidade e qualidade até a data de vencimento dos
mesmos, se obedecidas as condições abaixo:
1. O usuário do sistema seguir, rigorosamente, o
procedimento técnico.
2. As condições de armazenamento deverão estar de acordo
com o estabelecido nas instruções de uso.
3. Os materiais necessários e não fornecidos deverão estar
em boas condições técnicas.
Todos os produtos que apresentarem problemas
técnicos comprovados serão substituídos, sem ônus
para o consumidor.

Doles Reagentes e Equipamentos para Laboratórios Ltda.

CNPJ: 01.085.513/0001-05
Rodovia BR 153, Km 1273, Lt.07, Chácara Retiro
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www.doles.com.br

ANVISA nº: 10231810052

Revisão: 16 (03/2007)

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