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Citación provisional:
García A, Martínez C, Juárez RI, Téllez R, Paredes MA, Herrera MR, et al.
2019;39(3).
Recibido: 10-01-18
Aceptado: 31-10-18
1
Resistencia a meticilina y producción de biopelícula en aislados clínicos de
Ayerim García 1, Carlos Martínez 1,2, Rosa Isela Juárez 3, René Téllez 3, Marco Antonio
México
2 Servicio de Bioquímica, Instituto Nacional de Rehabilitación “Luis Guillermo Ibarra
Correspondencia:
sgiono@yahoo.com
Carlos Martínez y Marco Antonio Paredes: análisis de los resultados y redacción del
artículo.
cepas bacterianas.
María del Rocío Herrera: recopilación y tabulación de los datos, y análisis de los
resultados.
artículo.
3
Introducción. Las infecciones asociadas a cuidados en salud causadas por S. aureus y
impacto epidemiológico alto por su alta morbi-mortalidad; y puede estar en relación con
antimicrobianos.
aureus y SCN.
los genes mecA e icaADBC. Se realizó un análisis bivariado con las pruebas
Resultados. Nueve cepas de S.aureus fueron meticilino resistentes (MR), dos cepas
fueron meticilino sensibles (MS). Ocho cepas SCN fueron MR y cuatro fueron MS. El
genotipo mecA+ se encontró en ocho de las nueve cepas S. aureus MR y en seis de las
5
Introduction. Infections associated with health care caused by S. aureus and
epidemiological impact due to their high morbidity and mortality; and it may be related to
Material and methods. 11 strains of S. aureus and 12 SCN were studied. Methicillin
resistance was determined with cefoxitin discs and reference values as CLSI, 2018.
Biofilm production was quantified with crystal violet method. The mecA and icaADBC
genes were identified by PCR. A bivariate analysis was performed with the Chi-square
(X2) and V de Cramer statistical tests, using the SPSS V 20.0 program.
Results. Nine strains of S.aureus were methicillin-resistant (MR), two strains were
methicillin-sensitive (MS). Eight SCN strains were MR and four were MS. The mecA +
genotype was found in eight of the nine S. aureus MR strains and six of eight MR SCN.
the mecA + genotype. All strains formed biofilm and were related to the presence of the
icaADCB operon. Biofilm formation and methicillin resistance were independent features
6
Las infecciones asociadas a la atención y cuidados de salud (IAAS), representan un
intrahospitalarias son:
Los factores que incrementan la probabilidad de adquirir infecciones por este género
unidades de cuidados intensivos, entre otras, pero el principal factor de riesgo, se debe
antibióticos (5).
1997-2003 (5).
meticilina, cloxacilina), poseen una estructura molecular, que las protege frente a la
debe a la síntesis de una nueva PBP (PBP2a o PBP2´) (Penicillin binding proteins), que
exhibe baja afinidad por la meticilina y otros β-lactámicos; bloquea la llegada del
expresión depende de dos genes, mecR1 que regula la transcripción y mecI que
8
Otras modalidades de resistencia en las que no se demuestra la presencia del gen
PBPs 1,3 y 4 por lo que exhiben niveles de resistencia bajos a meticilina. Otros genes
de resistencia son el gen blaZ y el gen fem (factor esencial de resistencia a meticilina)
(7).
tridimensionales (11).
operón ica; que forman parte del grupo de adhesinas intercelulares Ica (Intercellular
Cluster Adhesin) que se codifican por los genes icaA, icaD, icaB, e icaC (13).
biopelícula (13,14).
9
La proteína Bap (biofilm associated protein) se localiza en la superficie bacteriana
permanentes (11).
requiere para alcanzar actividad bactericida frente a las biopelículas, suele ser superior
virulento y difícil de eliminar (10). El objetivo de este estudio fue investigar la asociación
México.
Material y métodos
Cepas bacterianas
febrero a julio del año 2010. Se estudiaron 23 cepas de Staphylococcus spp: 11 cepas
10
de S. aureus y 12 cepas de SCN. Se aislaron por resiembra en placas de gelosa sangre
de carnero y medio agar de sal y manitol. Todas las cepas aisladas fueron catalasa
positiva para S. aureus, se agruparon como SCN a las cepas coagulasa negativa. La
identificación del género y especie se llevó a cabo con un panel bioquímico usando un
procesamiento.
Se usaron las cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923 como control negativo
como control positivo de la presencia del gen mecA, Staphylococcus aureus ATCC
Antimicrobial) como método de referencia de acuerdo con las guías y normas de los
para Laboratorios Clínicos 2018 (CLSI 2018) (17). Para preparar el inóculo se
Hinton (MH), se ajustó la turbidez al 0.5 Nefelómetro McFarland (1,5 x 108 UFC/mL). Se
sembró con hisopo en tres direcciones en placas de agar Mueller Hinton (MH) y se
colocaron los sensidiscos. Las placas se incubaron 24h a 37ºC, se midieron los
Producción de biopelícula
preparó una suspensión en caldo de cultivo MH, se ajustó a la turbidez del tubo número
agregaron solo el medio MH, se incubaron 24h a 37 °C. Se aspiró el contenido con
micropipetas, empleando puntas de 200 µl estériles y se lavaron con 100 µl los pozos
con Amortiguador Fosfato Salino (PBS) estéril. Las bacterias adheridas fueron fijadas
exceso aspirando nuevamente y cada uno de los pozos se lavó con 100 μL de PBS. Se
con PBS. El CV adherido en cada pozo fue solubilizado con 100 μL de alcohol:acetona
los valores de las cuatro lecturas de Abs, se calculó la media y la Desviación estándar
(DS) para cada una de las cepas y el control negativo. El punto de corte (AbsC) se
definió como el valor de tres DS mayor del promedio de las Abs del control negativo
(AbsC = Abs media de los controles + (3X DS de los controles). La Abs final de cada
12
una de las cepas se calculó sustrayendo el valor de AbsC (Abs = Abs de una cepa –
AbsC). Cuando el valor obtenido de Abs final resultó negativo, se consideró como valor
0,001), baja (Abs= 0,001-0,500), moderada (Abs= 0,051-0,900) y alta adherencia (Abs ≥
0,901) (19,20).
Se empleó el método de tiocianato de guanidina, cada cepa fue sembrada por estría
recuperó por centrifugación por 10min a 10,000 x g, la pastilla obtenida se lavó con 200
µL de etanol al 70% (v/v) frío, se centrifugó a 10,000 x g y se dejó secar al aire por 2h,
13
Identificación de los genes mecA, icaADBC por la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR)
El volumen final de la mezcla de reacción para la amplificación por PCR fue de 25 µL,
las concentraciones finales de cada uno de los iniciadores fue de 0,1 µM, 1,5 mM de
MgCl2, 2,5 mM de dNTP´s y agua grado biología molecular, se realizaron 30 ciclos de:
amortiguador TBE teñido con bromuro de etidio, el tamaño de los amplicones se calculó
positivo para la presencia del gen mecA fue el DNA de la cepa S.aureus ATCC43300
Análisis estadístico
(Statistical Package for the Social Sciences, versión 20.0). Se realizó un análisis
bivariado con las pruebas chi-cuadrada (X2) y V de Cramer, para examinar la asociación
Resultados
14
El fenotipo resistente a meticilina fue de 9 cepas (81,8%) de S.aureus y 2 cepas
(18,2%) fueron sensibles. Las cepas del grupo SCN presentaron 8 cepas resistentes
De las 9 cepas MRSA 8 presentaron el gen mecA y solo una no lo presentó. En SCN 10
cepas presentaron el gen mecA, es decir que se encontró en las 8 cepas resistentes
meticilina y además 2 cepas con fenotipo sensibles a meticilina con la presencia del gen
de mecA (19).
infecciones estafilocócicas.
Con las categorías marcadas: nula o no adherente (Abs ≤ 0,001), baja (Abs= 0,001-
0,500), moderada (Abs= 0,051-0,900) y alta adherencia (Abs ≥ 0,901); se encontró que
ATCC 27543 como control positivo para la producción de biopelícula (cuadro 3).
con 1 (5%) de S.aureus; ambos grupos presentaron el mismo número de cepas 7 (30%)
1,5% mostraron en cada cepa los amplicones de cada uno de los genes del tamaño
esperado.
biopelícula con respecto a los dos grupos de cepas S. aureus y SCN, se encontró
V=0,245, p=0,111, y estas dos variables son independientes entre sí. La producción de
biopelícula se asoció con las cepas MRSA y MRSCN. El análisis estadístico también
Discusión
Las infecciones asociadas a atención de la salud (IAAS) han surgido como un problema
antibióticos para las infecciones causadas por este tipo de Staphylococcus spp., a su
vez genera una presión selectiva que favorece la diseminación de estas cepas.
16
La acumulación y la diseminación de la resistencia en S. aureus es producto del
el fenotipo meticilino resistente (MR) con la utilización de discos con cefoxitina. Las
cepas MRSA presentaron el mismo rango de sensibilidad y especificidad con los dos
con los valores de corte de los halos de inhibición. Nuestros resultados son similares a
Los métodos de tipificación molecular basados en la detección del gen mecA por PCR
de tiempo final están cada vez más alcance de los laboratorios clínicos y representan
una alternativa rápida y eficaz para la detección de cepas MRSA. Tiene la gran ventaja
mecA.
vitro en cepas clínicas ha evolucionado, desde los métodos poco reproducibles como el
se encontró que los dos grupos exhibieron tres niveles de formación de biopelícula,
S.aureus como SCN de origen clínico tienen la misma capacidad de formar biopelícula
S.aureus aisladas de la piel de pacientes son las que presentaron una mayor capacidad
(PIA) de las bacterias. En este trabajo se encontró que el 91% de las cepas del grupo
S. aureus y el 92% de las del grupo SCN presentaron los genes icaADBC. La
del gen de icaR, que están implicados en la producción del polisacárido adhesina
donde se obtuvo una alta frecuencia de genes icaADBC, en todos los aislados clínicos
(14).
identificaron cepas que no codificaron para los genes icaADBC, por lo tanto, no
formar biopelícula, sino que es posible que exista la participación de otros genes que no
se investigaron como SigB, SarA y LuxS que también participan durante la producción
de biopelícula (14).
en las cepas de origen clínico. Prácticamente todas las cepas fueron capaces de formar
biopelícula, ya sea por la participación del operón ica o por otros genes que no fueron
Se pudo determinar por PCR que 18 de 23 cepas presentaron mecA, una cepa con
resistencia alterno.
Los autores manifiestan no haber tenido ningún conflicto de intereses en ninguna de las
Financiación
El trabajo fue realizado con recursos de cada una de las instituciones participantes.
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23
Cuadro 1. Secuencias de los iniciadores específicos y condiciones para la amplificación
24
Cuadro 2. Fenotipos de sensibilidad y resistencia a la meticilina por difusión en disco
25
Cuadro 3. Capacidad de producción de biopelícula en cepas de los grupos de S. aureus
y SCN
26
Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5% con los amplicones de 310pb del gen
mecA. 1: Marcador de talla molecular 100pb; 2: control positivo S. aureus ATCC 43300;
3-6: ADN cepas clínicas S. aureus; 7: control negativo S. aureus ATCC 25923; 8:
control de reactivos
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Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa 1,5% con los amplicones de los genes
icaADBC. 1: Marcados de talla molecular 100 pb; 2: Control positivo ATCC 12228; 3-10:
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