AGROBIOTECNOLOGIA

CURSO 2016
-

TRANSFORMACION DE CLOROPLASTOS

FERNANDO BRAVO ALMONACID

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Sumario

Estructura y genética del cloroplasto

Ingeniería genética en cloroplastos

- Métodos de transformación
- Vectores
- Sistemas de selección

Ejemplos de genes expresados en cloroplastos

Otras aplicaciones de la transformación de

cloroplastos
Referencias
Transformación
de cloroplastos
 Estructura y genética del cloroplasto

Transformación
de cloroplastos
La teoría de la endosimbiosis explica el origen de los plástidos

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.

Elysia chlorotica
Endosimbiosis secundaria

Ciertos protistas, como Placida

dendritica y Elysia chlorotica,
capturan plástidos de las algas
y los mantienen fotosintéticamente
activos durante meses.
Placida dendritica
A partir de los proplástidos se diferencian
plástidos con funciones específicas

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Estructura del cloroplasto

Espacio
núcleo apoplástico

pared
vacuola

cloroplasto
citosol

Microscopía de una célula vegetal

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.

Microscopía de un cloroplasto
Los genomas
plastídico
y nuclear de
Arabidopsis Las líneas en verde
muestran las
thaliana proteínas de origen

contienen
procariota.

genes
Las líneas rojas
muestran el destino
de origen de las proteínas
codificada en el
bacteriano núcleo. Los números
entre paréntesis en
negro indican el
número total de
proteínas con un
determinado destino
y en verde las de
origen procariota.

Transformación
de cloroplastos

Tomado de: Leister, Trends in Genetics, 2003.

Las proteínas
plastídicas se
sintetizan en
el propio
plástido
o son
importadas
desde
el citoplasma

Transformación
de cloroplastos

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Mecanismos de importación de proteínas al cloroplasto

Una vez en el interior

del cloroplasto,
las proteínas pueden
tener tres destinos
diferentes:

- Estroma
- Membrana tilacoidea
- Lumen

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Estructura del genoma plastídico

• Es un genoma circular
de ~120 a 160 Kb.
• Tiene alrededor de 150
genes codificados
en ambas cadenas.
• Los genes pueden
clasificarse en dos grupos:
- Genes involucrados
en la fotosíntesis
- Genes involucrados
en los procesos
de replicación, transcripción
y traducción
• Posee genes organizados
en operones.

Organización de los
genomas plastídicos de
distintas especies
vegetales
Tomados de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Flujo de la información genética en el cloroplasto

El genoma plastídico codifica mensajeros monocistrónicos o policistrónicos.

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.

Los genes platídicos son transcriptos por dos tipos de polimerasas: una monomérica
codificada por el genoma nuclear, y una multimérica codificada por el genoma plastídico.

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Flujo de la información genética en el cloroplasto

Los ARNm generados

en el cloroplasto
presentan estructura
con forma de horquila
en el extremo 3’.

En los ARNm del

cloroplasto existen
secuencias
reconocidas por
los ribosomas que
favorecen la iniciación
de la traducción;
este reconocimiento
depende de las
secuencias que
flanquean al sitio
de reconocimiento

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
El flujo de la
información
genética
es regulado
a distintos
niveles

Transformación
de cloroplastos

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
El flujo de la
información
genética
es regulado
a distintos
niveles
Regulación
de la síntesis
proteica en el
cloroplasto

Transformación
de cloroplastos

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
Regulación de la síntesis proteica en el cloroplasto

Ambiente reductor [ADP] baja

Ambiente oxidante [ADP] alta

Tomado de: Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2001.
 Ingeniería genética en cloroplastos

Transformación
de cloroplastos
El genoma
plastídico
se puede
transformar por
ADN pt

recombinación Gen A Gen B Gen C Gen D

homóloga

Gen B aadA Gen C

Vector de transformación

ADN pt transformado

Transformación Gen A Gen B aadA Gen C Gen D

de cloroplastos
Métodos de Cañón génico

transformación:
comercial
(izquierda) y

biobalística
detalles del
dispositivo de
impulsión de los
microproyectiles
(abajo)

Transformación
de cloroplastos
Métodos de
transformación:
transformación
de protoplastos

Transformación
de cloroplastos
Se obtiene
homoplastía
por sucesivas
rondas de
regeneración
en medio de
selección

Transformación
de cloroplastos

Tomado de: Bock, JMB, 2001.

Heteroplastía
a homoplastía

Transformación
de cloroplastos
La homoplastía se obtiene por sucesivas rondas
de regeneración en medio de selección
Primera ronda de regeneración

Control de regeneración Control de selección Transformación

Segunda ronda de regeneración

Planta
transplastómica
 Especies vegetales en que se logró
la transformación de plástidos

Especie Explanto utilizado y Método Agente de selección

de transformación
Plantas regeneradas mediante organogénesis a partir de hojas
Lechuga Biobalística Espectinomicina
Tabaco Biobalística Espectinomicina
Tomate Biobalística Espectinomicina
Papa Biobalística Espectinomicina
Petunia Biobalística Espectinomicina
Álamo Biobalística Espectinomicina

Plantas regeneradas mediante embriogénesis

Zanahoria Suspensión celular Biobalística Espectinomicina
Algodón Callos friables Biobalística Kanamicina
Soja Callos embriogénicos Biobalística Espectinomicina
Arroz Callos obtenidos a partir de Estreptomicina
semillas maduras Biobalística
Especies vegetales en que se logró
la transformación de plástidos

Especies Método Resultado

Arabidopsis Biobalística Homoplasmía

Zanahoria Biobalística Transitorio

Nicotiana plumbaginifolia Protoplastos Transitorio y homoplasmía

Tabaco (suspensión celular) Biobalística Transitorio

Caléndula Biobalística Transitorio

Papa Biobalística Transitorio y homoplasmía

Pimiento Biobalística Transitorio

Arroz Biobalística Heteroplasmía

Tomate Biobalística Homoplasmía

Tabaco (Petit Havana, Xanthi) Biobalística y protoplastos Homoplasmía

Nabo Biobalística Heteroplasmía

Adaptado de: Maliga, Ann.Rev.Plant Biol., 2004.

Diseño de vectores para la transformación de cloroplastos

Vector de clonado procariota

Diseños opcionales:
Genes selectores usados en la transformación de plástidos
Genes selectores: betaína aldehido deshidrogenasa
BADH
betaína aldehido glicinabetaína
a b c d e f

Control 1o selección 2o selección Control 1o selección 2o selección

espectinomicina betaína aldehido

- La actividad enzimática de BADH

es dosada por formación de NADH.

- Y, D, M y O representan las hojas

jóvenes, en desarrollo, maduras
y viejas, respectivamente.

Tomados de: :Daniell et al., Curr. Genet., 2001.

Genes Selección y análisis de plantas
transplastómicas resistentes a kanamicina
selectores:
aminoglicósido-
fosfotransferasa 0 10 25

(aphA-6)
50 75 100
Colonias derivadas de protoplastos Selección no estricta Selección estricta
en distintas concentraciones de (5 semanas de cultivo (5 semanas de cultivo
kanamicina (mg/L) . en kanamicina 25 mg/L). en kanamicina 50 mg/L).

Tomado de: Huang et al., Mol. Genet. Genomics, 2002.

0 25 200 - Kan 200

Control no Control no
transgénico transgénico

plCF637 plCF637

Transformación plCF599
de cloroplastos plCF6061

Explantos luego de 4 semanas de cultivo en Progenie T1 creciendo en ausencia

distintas concentraciones de kanamicina (mg/L). o presencia de kanamicina (mg/L).
Selección
fenotípica por
restauración
de la
pigmentación y
la fotosíntesis
Brote reconstituído
(verde) obtenido de hoja
de DrpoA bombardeada.

Planta mutante DrpoA

empleada para
transformación.

Estrategia:
Reconstituir el fenotipo fotosintético
en plantas mutantes deficientes en
Transformación
de cloroplastos
fotosíntesis (DpetA, Dycf3 y DrpoA)
por transformación de cloroplastos
(selección fenotípica). Planta DrpoA reconstituída
Tomado de: Klaus et al., The Plant Journal, 2003. fenotípicamente normal.
Eliminación
de genes
Deleciones observadas

selectores por
recombinación
P1

P1 y T1:
secuencias
cortas repetidas
directas

s1: selección con

espectinomicina

s2: selección con

glufosinato

Transformación
de cloroplastos

Tomado de: Maliga, Current Opinion in Plant Biology, 2002.

Eliminación de genes selectores mediante el sistema cre/loxP

replicación
+

recombinación

recombinación
asistida por Cre

Tomado de: Maliga, Current Opinion in Plant Biology, 2002.

Características comparadas de los sistemas
de transformación nuclear y plastídica
Genomas

Plastídico Nuclear

Número de copias ~10.000/célula Pocas copias

Altos Por lo general bajos

Niveles de expresión
Entre el 2-7% (hasta 47%) Entre 0,001-0,1%

Genes y expresión Operones Monocistrónicos

Inserción en sitio conocido Inserción al azar

Efectos de posición
elimina este problema (expresión variable)
TGS y PTGS afectan
Silenciamiento génico No se ha reportado
la expresión

Transferencia horizontal Herencia materna Sí

Correcto
Plegamiento y formación
Correcto (pasando por retículo
de puentes disulfuro
endoplasmático)

Glicosilación NO SI
 Aplicaciones / Genes expresados

Transformación
de cloroplastos
Aplicaciones biotecnológicas
de la transformación de cloroplastos
La transformación Albúmina sérica humana (HSA)
de cloroplastos - Constituye el 60% de la proteína total en el suero.
permite
- Es la proteína intravenosa más usada para reemplazar volúmen
sobrexpresar sanguíneo en situaciones de trauma.
y simplificar - Actualmente es obtenida de la sangre.
la purificación - Se expresó en sistemas microbianos y en plantas transgénicas
de albúmina (transformación nuclear) y se obtuvieron muy bajos niveles proteicos.
sérica humana - La HSA es muy susceptible a la degradación proteolítica en los sistemas
recombinantes y su purificación es muy costosa.

16S trnI trnA 23S

Prrn

aadA HSA
Construcciones empleadas
Prrn SD 3´psbA
para transformar cloroplastos
de Nicotiana tabacum.
ó
Transformación
de cloroplastos aadA HSA

Prrn P5´UTR psbA 3´psbA

Análisis de la expresión de HSA en plantas transgénicas
Medición de HSA por ELISA en hojas de distintos estadíos

Medición de HSA por ELISA en hojas de distintos estadíos

luego de exposición diferencial a la luz (pLDApsbAHSA)

Tomado de: Fernandez-San Millán et al., Plant Biotechnology Journal, 2003.

Análisis de la acumulación de HSA en cuerpos de inclusión

Micrografías electrónicas de tejidos A pesar de los altos niveles de

(hojas maduras) marcados con anticuerpos expresión las plantas
anti-HSA conjugados con oro. transgénicas mostraron un
A: control no transformado fenotipo normal.
B-D: hojas de plantas transformadas 1 y 2: plantas no transformadas.
con pLDApsbAHSA. 3: pLDAsdHSA
4: pLDApsbAHSA.
A B

Extracción de HSA de cuerpos de inclusión

Durante el proceso
de solubilización
Fracción Precipitado
soluble solubilizado

pLDApsbAHSA

pLDApsbAHSA

pLDApsbAHSA
pLDApsbAHSA

pLDApsbAHSA
500 ng HSA

parcialmente
pzrcialmente
al comienzo
40 ng HSA

purificado
purificado
control

control

control
C D

MM
97 KDa

97 KDa 66 KDa
66 KDa HSA
Inmunodetección de HSA en
extractos vegetales
LSU
45 KDa

SDS-Page
revelado con plata
Tomado de: Fernandez-San Millán et al., Plant Biotechnology Journal, 2003
Producción de hormona de crecimiento humana (hGH)
en cloroplastos de tabaco

Expresión de los genes quiméricos hGH

en plantas transgénicas
Concentración de
Localización Localización
Plásmido proteína
del gen de la proteína
expresada (% pts)
Wrg4747 Núcleo Cloroplasto ND - 0,025 a
Wrg4776 Núcleo RE 0,004 - 0,008 a
Wrg4838 Cloroplasto Cloroplasto 0,2 a
pMON38755 Cloroplasto Cloroplasto 1,0 b
pMON38794 Cloroplasto Cloroplasto 7,0 b

Tomados de: Staub et al., Nature Biotechnology, 2000.

Producción Herencia materna de los transgenes plastídicos
de hormona
de crecimiento
humana (hGH)
en cloroplastos
de tabaco

Transformación
de cloroplastos Tomado de: Staub et al., Nature Biotechnology, 2000.

NT: no transgénico Nt-4838: planta transplastómica expresando hGH

♀: planta receptora ♂: planta donora de polen
Expresión • Péptidos antimicrobianos
plastídica - Son péptidos con estructuras a-hélice componentes del
de un péptido sistema de defensa innato de los animales.

antimicrobiano
- Participan en el control de la flora bacteriana normal
y en la defensa contra patógenos.
para el control - Fueron aislados de diversos organismos (batracios, insectos,

de bacterias
células de mamíferos).
- El péptido MS1-99 es un análogo de la magainina-2
y hongos secretado por la piel del anuro Xenopus laevis.

fitopatógenos • La acción de los péptidos antimicrobianos es concentración-

dependiente. Los cloroplastos son un sistema atractivo para
lograr altos niveles de acumulación.

Construcción empleada para transformar cloroplastos de Nicotiana tabacum

Orf131
trnI 16SrDNA trnV rps12
Orf70B

Transformación MS1-99 aadA

de cloroplastos
Prrn TpsbA
Expresión plastídica de un péptido antimicrobiano
para el control de bacterias y hongos fitopatógenos
Ensayos de actividad antibacteriana
in vitro de extractos vegetales sobre Resistencia in planta a
Pseudomonas syringae pv tabaci
Pseudomonas syringae pv tabaci

TransgénicaT0 No transformada

Tomado de: De Gray et al., Plant Phisiology, 2001.

Se cuantificó por DO el crecimiento bacteriano Se inocularon las hojas con distinto número
T1 y T2: generaciones de plantas transgénicas de células de Pseudomanas syringae pv tabaci;
10A, 11A y 13A: líneas de plantas transgénicas. se evaluaron los síntomas a los 5 días.
Expresión plastídica de un péptido antimicrobiano
para el control de bacterias y hongos fitopatógenos
Ensayos in vitro de actividad
antifúngica de extractos vegetales Resistencia antifúngica in planta

No transformada Transgénica

Se inocularon las hojas con Colletotrichum destructivum

y se observó la aparición de lesiones. Las plantas controles
desarrollaron lesiones entre 48-72 h post-inoculación,
mientras que las transformadas no desarrollaron lesiones
aún después de una semana.
Resultados:
- 96% de inhibición de Pseudomonas syringae pv tabaci.
- >95% de inhibición de las especies fúngicas
- Ausencia de lesiones antracosas frente a Colletotrichum
destructivum.
- Ausencia de anomalías en plantas transgénicas
Inhibición de conidios germinados
UFC: unidades formadoras de colonias. Tomado de: De Gray et al., Plant Phisiology, 2001.
La expresión de toxina Cry de Bacillus thurigiensis
en cloroplastos confiere amplia resistencia contra insectos

• Proteínas Cry de Bacillus thuringiensis

- Poseen potente actividad insecticida contra
insectos lepidópteros, dípteros y coleópteros.

• La transformación de cloroplastos podría

ser un sistema apropiado para acumular
altos niveles de la -entomotoxina Cry
debido al origen procariota del gen.

Resultados:
Se obtuvieron altos niveles de expresión
de la toxina (aproximadamente 2-3 % de peso
total soluble) asociados a una alta tasa de
mortalidad (~100 %) para Heliothis virescens,
Helicoverpa zea y Spodoptera exigua en los
ensayos de infestación.

Tomado de: Kota et al., PNAS U.S.A., 1999.

La expresión del operón Cry2Aa2 de Bacillus thurigiensis
en cloroplastos induce la formación de cristales insecticidas

- El gen cry2Aa2 es uno de los tres Cuantificación de la

proteína Cry2Aa2 por
marcos abiertos de lectura del operón
ELISA
cry2Aa2 de Bacillus thurigiensis.

- El ORF2 codifica una chaperona

que guía el plegamiento de Cry2Aa2.

- Se expresaron policistrones
conteniendo estos genes en
cloroplastos para aumentar la
acumulación de entomotoxina.
Cristales de Cry2Aa2
en cloroplastos
Tomado de: De Cosa et al., Nature Biotechnology, 2000.

Construcción empleada para transformar

cloroplastos de Nicotiana tabacum

16S trnI trnA Resultados:

- Expresión de Cry: 45,3% de PTS (hojas
aadA orf1 orf2 cry2Aa2
maduras y hojas viejas).

Prrn Operón cry2Aa2

TpsbA
- Provocó una mortandad del 100% en insectos
normalmente difíciles de controlar.
Transformación genética estable de cromoplastos de
tomate con el gen selector aad-A
Construcción empleada para transformar
cloroplastos de Lycopersicum esculentum
A B

psaB rps14 trnfM trnG ycf9 trnS

aadA

Prrn TpsbA
Selección primaria de Propagación de líneas
callos de tomate de tomate resistentes a
Acumulación de aadA en hojas, frutos verdes y rojos
resistentes a espectinomicina
espectinomicina
(maduros) de plantas transplastómicas de tomate
C D
Frutos
Hojas verdes rojos
Nt control

Le control

Le control
Nt iycf9

Le-aadA

Le-aadA

Le-aadA

Le-aadA

Le-aadA

Le control

Le-aadA

Regeneración de plantas Enraizamiento de

a partir de callos brotes de tomate
transplastómicos transplastómicos
1:2 1:4 1:8
homoplásticos
dilución
Tomado de: Ruf et al., Nature Biotechnology, 2001.
 Factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF)

D. extracelular D. citoplasmático
1 22 1033 1053 1207
ss hEGF Tr N-glic. pre-pro-hEGF
(114 Kda)
971 53 1023

hEGF maduro: 6,2 Kda •Une a un receptor tirosina-quinasa presente

en casi todos los tipos celulares.

•Factor mitogénico. Interviene en el

desarrollo, diferencianción, reparación y
protección de tejidos epiteliales.

Tratamiento de heridas y quemaduras

Agente reparador en transplantes de córnea
Puentes -SH Tratamiento de úlceras gástricas y otras
afecciones gastrointestinales
 Construcción del vector:
clonado de las secuencias flanqueantes

Nicotiana tabacum
cloroplasto
155.393 pb
Sitio de inserción

Secuencias flanqueantes
Procesamiento y splicing del operon de los ARN ribosomales
 Plásmidos para la transformación de
cloroplastos de tabaco
Sac II Sac II

16S
Prrn 16S Prrn

aadA aadA
5’ UTR
pBSWGUS RBS
(psbA) pBSWUTRGUS 5’ UTR Nde I
Nde I
(8163 pb) (8357 pb)

uidA uidA

trnA Trps16 trnA Trps16

trnI Xba I trnI Xba I
Sac I Sac I
Análisis de las plantas: PCR
pBSWUTREGF

Verificación de la homoplastía por Southern blot

 Niveles de expresión :Coomasie
GUS P1GUS

M WT Nu R1 R3 R5 R1 BSA

0,1 1 2 ug

SUBUNIDAD
MAYOR
RUBISCO

20 ug de proteínas totales de hojas de tabaco

Virus de la
fiebre aftosa
Virus de la
fiebre aftosa
Caracterización molecular de las plantas VP-βGUS

Northern blot

Southern blot

<
<

Tomado de Lentz et al Planta 2010

Virus de la
fiebre aftosa

Expresion de VP-βGUS en las plantas transplastómicas

Coomasie Western blot

Tomado de Lentz et al Planta 2010

Virus de la Cuantificación de la expresión
fiebre aftosa

VP- βGUS
Rubisco L

Tomado de Lentz et al Planta 2010

Virus de la
fiebre aftosa Fenotipo de las plantas VP-βGUS

<
<

Tomado de Lentz et al Planta 2010

Virus de la Inmunización
fiebre aftosa
transplastómica
wild-type
VP-βGUS
vacuna VFA

Tomado de Lentz et al Planta 2010

Virus de la
Análisis de los sueros
fiebre aftosa
transplastómica control
VP-βGUS

p135-160

Tomado de Lentz et al Planta 2010

Rotavirus
bovino

Responsable del 60% de las

Gastroenteritis de bovinos

Genoma mulipartito (11dsRNA)

VP5* VP8*
Rotavirus
bovino

VP8*
Inmunización y
desafío
Anticuerpos en las hembras
Protección de
los lactantes
 Otras aplicaciones de la transformación
de cloroplastos

Transformación
de cloroplastos
RESISTENCIA A PATOGENOS
Transformación de plástidos de tabaco con genes antimicrobianos
Construcciones utilizadas
 Ensayos en invernáculo con Rizoctonia solani

wt GUS

gluc AP+Gluc7 AP+Gluc2

Ensayos a campo (condiciones infección naturales) con Phytophthora
parasitica var. nicotianae y Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina
 Monitoreo visual de la
enfermedad

Rhizoctonia solani

Peronospora hyoscyami
f. sp. tabacina

Phytophthora parasitica
var. nicotianae
 Biomasa del patógeno
qPCR

Rhizoctonia solani

Peronospora hyoscyami
f. sp. tabacina

Phytophthora parasitica
var. nicotianae

AP15 Glu4 Glu7 Der21 AP/Glu6 AP/Glu2 AP/Glu7 Der/Glu5 Gus PH/WT
María Eugenia Segretin
Mauro Miguel Morgenfeld
Ezequiel Matías Lentz
Federico Alfano
Sonia Wirth INGEBI-CONICET
Noelia Boccardo
Federico Mirkin
Fernando Bravo Almonacid

María
María José
José Dus
Dus Santos
Santos INTA-CASTELAR
INTA-CASTELAR
Marina Valeria Moz Instituto
Marina Mozgovoj Instituto de
de Virología
Virología
Demian
Demian Bellido
Bellido
Andrés Wigdorovitz
Andrés Wigdorovitz

Ingrid Hernández
Osmany Chacón CIGB-HABANA-CUBA
Yunior López
Orlando Borrás-Hidalgo

CIGB