Microscopia: RECONOCIMIENTO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO; PREPARADOS Y

COLORACIONES.

I. Fundamento teórico:
El microscopio es un instrumento especialmente diseñado para el estudio de estructuras y
objetos pequeños (microscópicos) que no pueden ser examinados una simple vista. Por lo que
se menciona es una herramienta fundamental en la biología y en la actualidad se ha logrado
un gran avance en su perfección, hasta el punto de que existen diversos tipos de microscopio
con diferentes características y modelos adecuados para diferentes propósitos. Por ejemplo: el
microscopio electrónico de barrido, el microscopio de contraste de fase, el microscopio
invertido, el microscopio estereoscópico, etc. Cada uno de los que se apoya en una serie de
técnicas y procedimientos propios para que podamos tener una idea de las estructuras
subcelulares que presentan los seres vivos; Dentro de estas técnicas está la criofractura, la
tinción diferencial. El descubrimiento de las células fue posible a partir de la invención del
microscopio compuesto. El conocimiento de la célula y el papel que juega en la formación de
los tejidos animales y vegetales ha avanzado de manera paralela al perfeccionamiento de las
técnicas de microscopía. Una célula animal se mide entre 10 y 20 mm de diámetro, unas cinco
veces menos que el diámetro de la partícula más pequeña observable por el ojo humano. Se
han desarrollado diferentes sistemas de iluminación para el microscopio, que permiten
observar células o tejidos vivos, fijados y teñidos. En este sistema, el recorrido que sigue la
luz va desde la lámpara hasta el ojo del observador pasando por el sistema de lentes que la
línea y la concentración. August Köhler (1866-1948), físico alemán, desarrollado para
permitir el alineamiento del sistema óptico con el sistema de iluminación sobre el mismo
eje. Esto se realiza como referencia a la diafragma de campo, que es un dispositivo que se
encuentra sobre la fuente de luz, que regula la apertura para el paso de esta. El diafragma de
campo permite centrar el condensador móvil. Esta técnica evita la aberración cromática,
mejorando la resolución de las imágenes. Se pueden cambiar los objetivos (4X, 10X, 40X y
100X), sin tener que volver a alinear el sistema. El uso correcto del microscopio es
indispensable para el inicio de cualquier observación que se produzca la iluminación de
Köhler alineando el condensador con respecto a la fuente de luz, su objetivo es obtener la
iluminación óptima de la muestra. Al igual que nuestro ojo, el microscopio es un instrumento
complejo y delicado; por lo que su manejo debe hacerse con mucho cuidado para evitar el
deterioro.
 II. Objetivos:

Al finalizar la práctica del estudiante estará en condición de:

 Dar el uso debido uso del microscopio conociendo cada uno de sus partes.
 Mediante observaciones en el microscopio observar los diferentesaumentos de las
muestras en fresco y en seco.
 Obtener correctamente un preparado en fresco y en seco y usar adecuadamente los
colorantes ácidos, básicos y neutros en las preparaciones, microscópicas.

III. Materiales :

 DE LABORATORIO:
 Microscopio
compuesto
 Azul de metileno
 Asa de koll
 Wrigth
 Pipetas
 Eosina

 DEL ALUMNO :

 Agua estancada.
 Laminas laminillas .
 Algodón.
 Alcohol
 Lancera.
 Gotero.
 Fósforos.
DESCRIPCION DEL MICROSCOPIO COMPUESTO.
El microscopio tiene dos partes, una óptica y otra mecánica las cuales serán reconocidas en el
desarrollo de la práctica:

PARTE OPTICA
 Ocular._ Se trata del lente que se halla próximo al ojo del observador, o sea es la
parte del microscopio compuesto por donde el observador mira la muestra. A través de
este se logra aumentar la imagen del objetivo. Estos por lo general tienen dos oculares,
llamándose binoculares, sin embargo hay modelos que solo poseen uno, los cuales se
nombran como monocular.

 Objetivo._ Es la lente localizada próximo a la preparación. Este logra aumentar la

imagen de la muestra a observar.
sistema de lentes convergentes que actúa como una lente que se encuentran montados
en el revólver. Lo usual es que cada microscopio tenga cuatro objetivos de diferentes
aumentos (4x, 10x, 40x, 100x) los que se clasifican en:

 Objetivos en seco: en los que el aire se interpone entre la lente y la preparación

 Objetivos de inmersión: en el cual un líquido (aceite) se interpone entre el
lente y la preparación.

 Distancia focal._ El punto de convergencia de los rayos refractados cuando los rayos
incidentes provienen de una fuente tan lejana que pueden considerarse paralelos entre sí.

SISTEMA DE ILUMINACIÓN:
Comprende las partes del microscopio que reflejan, transmiten y regulan la cantidad de luz
necesaria para efectuar la observación a través del microscopio

 Condensador.- Se trata de la lente donde se llega a concentrar todos los rayos

luminosos que inciden en la muestra.
 Diafragma._ Parte situada bajo el condensador encargado de concentrar los rayos
luminosos procedentes de la fuente de luz sobre el preparado o muestra.
 Fuente de luz._ puede ser natural o artificial (ampolleta).
PARTE MECANICA:
Está constituido por una serie de piezas en las que van instaladas las lentes, que permiten el
movimiento para el enfoque. La parte mecánica del microscopio comprende el pie, el tubo, el
revólver, elasa, la platina, el carro, el tornillo micrométrico y el tornillo micrométrico. Estos
elementos sostienen la parte óptica y de iluminación; además, permiten los desplazamientos
necesarios para el enfoque del objeto.

 PIE ._ Se trata de la misma base del microscopio, donde llega a aguantar a cada una de las
partes del microscopio compuesto.

 COLUMNA O BRAZO._ También se le conoce como brazo o asa. Se encuentra en la zona

posterior del aparato.

 PLATINA ._ Se trata de la placa que se presenta como un soporte horizontal donde se

coloca la muestra a observar. Esta posee una abertura en su centro que da paso a la luz
procedente del sistema de iluminación.

 EL TUBO OPTICO ._ Parte que permite al observador alejar o acercar la muestra,

donde para ello debe de mover un tornillo macrométrico que realiza el movimiento rápido
sea hacia arriba o hacia abajo.

 EL REVOLVER ._ Es en esta parte donde se hallan los sistemas de lentes objetivos. A

través de él se pueden cambiar y girar los objetivos. Este suele contener los sistemas de
lentes oculares.

 TORNILLO MACROMETRICO._ Se trata de un tornillo macrométrico con el cual

se puede acercar el enfoque, y a la vez es micrométrico, usado para obtener el enfoque
correcto.
Preparados y coloraciones
Los preparados para las observaciones microscópicas pueden ser de dos clases:
 Preparado en fresco ._ se llama preparado en fresco al que realizas e
inmediatamente lo observas al microscopio, por ejemplo, si va a observar
microorganismos utilizas una gota de agua estancada , si queras ver células vivas,
tomas parte de un tejido y así ves material fresco,.
 Preparado en seco._ es un preparado que lo podes ir a buscar en un laboratorio que
se hicieron hace tiempo, y está la muestra fijada en el porta objeto,. si hay células
estan muertas, pero conservadas y teñidas.

Colorantes:
Son sustancias capaces de transmitir su color a otros cuerpos .

Clases:

 Por su origen : naturales y artificiales

 Naturales :son aquellos que se obtienen de organismos
 Artificiales : llamados también sinteticos, son aquellos que se obtienen como
productos derivados de la destilación fraccionada de la hulla se le conoce como
anilinas .
 Por su afinidad tintórea :
 Colorantes ácidos: es un colorante que es una sal de un sulfúrico, carboxílico y
ácido orgánico fenólico: Las sales son a menudo de sodio o sales de amonio.
Colorantes ácidos son típicamente solubles en agua y poseen afinidad por colorantes
directos fibras anfóteros mientras que carece de afinidad por fibras de celulosa.
 Colorantres básicos: son sales amónicas o complejos formados por cloruro de cinc
o aminas. Algunos colorantes básicos, de elevado peso molecular, son absorbidos
por el algodón y el rayón.
 Colorantes neutras: Están formados simultáneamente por soluciones acuosas de
colorantes ácido y básicos, donde el precipitado resultante, soluble exclusivamente
en alcohol, constituye el colorante neutro, que tiene la propiedad tintorial de sus
componentes ácidos y básicos.
Coloración:
Es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista al
microscopio. ... Diferentes tipos de tinciones biológicas son utilizadas también para marcar células
en cartometría de flujo y para marcar proteínas ó ácidos nucleídos en electroforesis en gel

Procedimiento:
Preparado en fresco.
1. Limpiar bien una lamina portaobjetos .con un pedazo de lino o con papel para lentes
2. Con un gotero colocar una gota de agua estancada en el centro de la lamina portaobjetos y
sobre la muestra del cubreobjetos
3. Efectuar la iluminación del microscopio
4. Colocar el portaobjetos en la platina del microscopio , fijarla con las pinzas la parte que
contiene el cubreobjetos y la preparación debe estar sobre el orificio de la platina
5. Enfocar mientras observa por el ocular, eleve ligeramente el tubo con el tornillo
micrométrico hasta que se visualice el preparado haga la imagen mas nítida con el tornillo
micrométrico.
6. El ajuste de la intensidad d ella luz se hará con el diafragma
7. Se enfoca girando el tornillo micrométrico lentamente, hacia atrás o hacia adelante para
obtener detalles De varios niveles.
8. Las observaciones se inician con el objetivo de pequeño aumento, procurando enfocarlo
bien.

 Colocar una gota de agua estancada en una lámina.

 Colocar una laminilla cubreobjetos.

 Observar:
Preparado en seco
 Coloración simple
 Cuando se emplea un solo colorante, acido o básico.

Procedimiento

1. Extensión o froti s. sustancia examen mucosa labial

2. Fijación al alcohol, calor, etc.
3. Colorear de 1 a 5 con un colorante acido o básico
4. Lavar en agua corriente hasta que salga incolora
5. Secar al medio ambiente o a calor moderado
6. Observar a objetivo de menor a mayor aumento
7. Observar a inmersión colocar una gota de aceite de cedro
8. Esquematizar lo observado
 Cuestionario

1. ¿Cuál es la diferencia entre un microscopio óptico y un microscopio electrónico?

2. ¿Por qué se utiliza el aceite de cedro en la observación con los objetivos de
inmersión ¿
3. ¿Qué tipo de imagen da el ocular y el objetivo?
4. ¿Cómo se calcula el numero de aumentos en una muestra? ejemplos
5. Esquematice comparativamente la formación de imagen del microscopio óptico con
el microscopio electrónico
6. ¿Qué pasos se siguen para realizar una coloración de gran?
7. ¿Para observar plasmodium faciulparum que tipo de preparado emplearía?

DESARROLLO

1.

2. La función del aceite de inmersión es restringir el movimiento de la muestra, además de

evitarle rozamiento entre el cubre objetos y el objetivo, generalmente se lo utiliza cuando
vamos a observar con el objetivo 100x. Otra función del aceite de inmersión es evitar que
la luz se desvíe; al contrario lo que se pretende es que la luz llegue concentrada hacia la
muestra.
3. El ocular logra que veamos la imagen del objetivo con un ángulo aparente mayor
que si el objeto estuviera en el punto próximo del ojo.

La lente objetivo produce una imagen mayor, real e invertida, y la lente ocular,
actuando sobre ella, la hace más grande pero la deja invertida y virtual

 La imagen que da el microscopio es mayor, virtual e invertida..

 La imagen final después de pasar por el ojo se forma en la retina.

4. Se multiplica el aumento del objetivo por el aumento del ocular.... por ejemplo si
el objetivo es de 40 X y el ocular de 10 X = la muestra esta aumentada 400 veces.
5.
 6.

 Se extiende la muestra recogida (que suele ser líquida o viscosa) en un

porta de cristal, y se deja secar al aire.

 Se aplica metanol al porta; así, las bacterias quedan pegadas en la

superficie.

 Se añade violeta de genciana, un colorante que tiñe todas las bacterias de

color púrpura. Se debe dejar durante un minuto para que haga efecto.

 Se lava la muestra coloreada con agua y se añade alcohol-acetona para

desteñir las bacterias que se deben teñir con el violeta de genciana. Es la
parte más importante de la prueba, ya que si se deja demasiado tiempo se
desteñirían todas las bacterias. Después se lava de nuevo con agua para
eliminar el alcohol.

 Se añade fucsina, otro colorante que tiñe de rosa las bacterias que no se
han teñido de color púrpura. Así se pueden observar al microscopio,
aunque serán gramnegativas.

 El microbiólogo estudia la muestra con un microscopio e identifica

bacterias teñidas.

7.
Comparación del microscopio de luz, electrónico de transmisión yelectrónico de barrido