UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA

1._ INTRODUCCION:

La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más

utilizadas para la detección específica de moléculas. Se caracteriza por
su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta
naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc) y estado de agregación
(sólido, líquido, gas). Los fundamentos físico-químicos de la
espectrofotometría son relativamente sencillos.
La mayoría de los problemas analíticos reales comienzan con una
compleja mezcla a partir de la cual es necesario aislar, identificar y
cuantificar uno o más componentes dela misma. Se pueden plantear las
siguientes cuestiones: una, de carácter cualitativo (¿de qué componente
se trata?), y otra de carácter cuantitativo (¿cuánto hay de ese
componente?).Para ello, se puede utilizar el método instrumental de
análisis, como es la espectrofotometría para medir la absorción
de radiación ultravioleta y visible que interactúa con la materia (átomos
y moléculas), la misma es considerada una técnica cuali y cuantitativa
basándose en la medición del color o de la longitud de onda de una
radiación e intensidad de la misma. Se hará una descripción del método
espectrofotométrico para dar al lector una idea del empleo del mismo y
su utilidad en los ensayos de sustancias.

BIOQUIMICA Y NUTRICION
 UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA

2.- OBJETIVOS:

 Conocer el funcionamiento del espectrofotómetro.

 Conocer la diferencia entre un fotocolorímetro y un

espectrofotómetro.

 Graficar el espectro de luz.

 Indagar la relación matemática entre la absorbancia y tramitación.

3.- Marco Teórico:

BIOQUIMICA Y NUTRICION
 UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA

La espectrofotometría se refiere a la medida de cantidades relativas de

luz absorbida por una muestra, en función de la longitud de onda.
Cada componente de la solución tiene su patrón de absorción de luz
característico comparando la longitud de onda y la intensidad del
máximo de absorción de luz de una muestra versus soluciones estándar,
es posible determinar la identidad y la concentración de componente
disueltos en la muestra (solución incógnita).
Los métodos espectrofotométricos se basan en la medida de la
radiación electromagnética emitida o absorbida por la materia; los
métodos de emisión utilizan la radiación emitida cuando un analito es
excitado por energía térmica, eléctrica o radiante; los métodos de
absorción están basados en la disminución de la potencia de la radiación
electromagnética como consecuencia de la absorción que se produce
en su interacción con el análisis. Si se aplica energía a un átomo, esta
puede ser absorbida y un electrón externo puede ser promovido a una
configuración conocida como estado excitado; dado que ese estado es
inestable, el atomo retornara inmediatamente al estado fundamental,
emitiendo energía.
La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas
depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada
sustancia química.
Por lo tanto se dice que la espectrofotometría es fundamental en el
estudio de sustancias desconocidas. Cuando la luz atraviesa una
sustancia, parte de la energía es absorbida. El color de las sustancias se
debe a que estas absorben ciertas longitudes de onda de luz blanca que
incide sobre ellas y solo dejan pasan a nuestros ojos aquellas longitudes
de onda no absorbidas.

Ley de Bourguer-Lambert- Beer:

BIOQUIMICA Y NUTRICION
 UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA

Bourguer, Lambert y Beer, a través de sus observaciones establecieron

relaciones dela variación de la intensidad de luz transmitida por una
muestra con el espesor de ella o con la concentración de la sustancia,
para materiales translúcidos. Estas relaciones se conocen como la ley
de Bourguer-Lambert-Beer o ley general de la espectrofotometría que
permite hallar la concentración de una especie química a partir de la
medida dela intensidad de luz absorbida por la muestra.
Esta ley se puede expresar en términos de potencia de luz o de
intensidad de luz, asumiendo luz monocromática, como:
It/ I0= 10-e bc
Donde:
It, es la intensidad de la luz transmitida por la muestra.
I0, es la intensidad de la luz que incide sobre la muestra y que proviene
de la fuente.
e, es el coeficiente de absortividad molar en unidades de M-3. cm-
b , es la longitud de la trayectoria del haz de luz a través de la muestra o
el espesor de la celda en cm o lo que se conoce como paso óptico.

4.- Procedimiento experimental

1.- Preparar la siguiente batería de tubos:

BIOQUIMICA Y NUTRICION
 UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA

Tubo I Tubo II Tubo III Tubo IV Tubo X

Bicromato de 0.8 ml 1 ml 1.3 ml 1.5 ml ……………….
potasio
Agua 9.2 ml 9 ml 8.7 ml 8.5ml 9 ml
destilada
Concentración ………… ………….. ………….. …………… ………………..
(mg%)
Muestra X ………… ………….. ………….. ……………. 1 ml

Solución stock: Bicromato de Potasio 80 mg%. Calcular la concentración

en mg% de bicromato de K en cada uno de los tubos Standard (I-II-II-IV).
Leer las absorbancia de los cuatro tubos a 350 nm de longitud de onda (
) ‫ ג‬en el espectrofotómetro contra el H2O destilada (Abs. H2O=0).

2. Con los datos obtenidos construir en un papel milimetrado la gráfica

de absorbancia en el eje de las Ordenadas vs concentración de
bicromato de K en el eje de las Abscisas.

3. Una vez obtenida la curva de calibración, medir la absorbancia de la

muestra problema (Problema X).
4. Obtener el factor de calibración (Fc) promedio con las soluciones
standard y sus Absorbancia utilizadas para construir las curvas de
calibración ajustadas.
5. Calcular la concentración de la muestra problema por los siguientes
métodos:

BIOQUIMICA Y NUTRICION
 UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA

A.- Gráficamente extrapolando su absorbancia en la curva de

calibración.
B.- Usando Factor de Calibración, multiplicando su absorbancia por el
factor de calibración del standard.

5.- Desarrollo experimental

6.- Conclusiones :

Se ha llegado a la conclusión de que la espectrofotometría es un

método analítico indirecto porque se basa en la medición de la

BIOQUIMICA Y NUTRICION
 UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA

absorbancia o transmitancia de las radiaciones; es de gran utilidad en la

actualidad para la identificación de un analito en una muestra problema.
La espectrofotometría es el método más usado, debido a que es
sencillo, específico y sensible.

7.- Cuestionario

1.- Explique el mecanismo de funcionamiento de un

espectrofótometro

BIOQUIMICA Y NUTRICION
 UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA

Un espectrofotómetro es un instrumento usado en el análisis

químico que sirve para medir, en función de la longitud de onda, la
relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a
dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones químicas que
se miden en una muestra. También es utilizado en los laboratorios de
química para la cuantificación de sustancias y microorganismos.
Hay varios tipos de espectrofotómetros, puede ser de absorción
atómica o espectrofotómetro de masa y visuales.
Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz
monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que
es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos
funciones:

1. Dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra

2. Indicar indirectamente qué cantidad de la sustancia que nos
interesa está presente en la muestra
Componentes de un espectrofotómetro
Cubetas de espectofotometría. En un primer plano, dos de cuarzo aptas
para el trabajo con luz ultravioleta; en segundo plano, de plástico, para
colorimetría (es decir, empleando luz visible).

Fuente de luz
La fuente de luz que ilumina la muestra debe cumplir con las siguientes
condiciones: estabilidad, direccionabilidad, distribución de energía
espectral continua y larga vida. Las fuentes empleadas son: lámpara
de wolframio (también llamado tungsteno), lámpara de arco de xenón y
lámpara de deuterio que es utilizada en los laboratorios atómicos.

Monocromador
BIOQUIMICA Y NUTRICION
 UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA

El monocromador aísla las radiaciones de longitud de onda deseada que

inciden o se reflejan desde el conjunto, se usa para obtener luz
monocromática.
Está constituido por las rendijas de entrada y salida, colimadores y el
elemento de dispersión. El colimador se ubica entre la rendija de
entrada y salida. Es un lente que lleva el haz de luz que entra con una
determinada longitud de onda hacia un prisma el cual separa todas las
longitudes de onda de ese haz y la longitud deseada se dirige hacia otra
lente que direcciona ese haz hacia la rendija de salida.

Compartimiento de Muestra
Es donde tiene lugar la interacción, R.E.M con la materia (debe
producirse donde no haya absorción ni dispersión de las longitudes de
onda). Es importante destacar, que durante este proceso, se aplica
la ley de Lambert-Beer en su máxima expresión, con base en sus leyes
de absorción, en lo que concierne al paso de la molécula
de fundamental-excitado.

Detector
El detector, es quien detecta una radiación y a su vez lo deja en
evidencia, para posterior estudio. Hay de dos tipos:
a) Los que responden a fotones;
b) Los que responden al calor.

Fotodetectores
En los instrumentos modernos se encuentra una serie de
16 fotodetectores para percibir la señal en forma simultánea en 16

BIOQUIMICA Y NUTRICION
 UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA

longitudes de onda, cubriendo el espectro visible. Esto reduce el tiempo

de medida, y minimiza las partes móviles del equipo.

2.- ¿Que diferencias existen un fotocolorímetro y

un espectrofotómetro?

Los espectrofotómetros son espectrómetros que permiten medir la

relación entre la energía radiante de dos rayos, lo cual es necesario para
medir la absorbancia. Los fotocolorímetros emplean filtro para
seleccionar las longitudes de onda en combinación con un transductor
de radiación adecuado, a diferencia de los espectrofotómetros en los

BIOQUIMICA Y NUTRICION
 UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA

que la longitud de onda se puede modificar continuamente, por lo que

es posible registrar espectros de absorción.
Otra diferencia radica en que la mayoría de los modelos de
espectrofotómetros pueden cubrir la región UV/visible y a veces la
infrarroja cercana, mientras los foto colorímetros se emplean más
comúnmente en la región visible.

BIOQUIMICA Y NUTRICION
 UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA

3.- Grafique el espectro de luz, tanto en el rango visible

como no visible con sus respectivas longitudes de
ondas

BIOQUIMICA Y NUTRICION
 UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA

4.- ¿Que reacio matemáticamente existe entre

absorbancia y transmitancia?
El logaritmo:

Abs = -log T = -log (It/Io)

donde Abs es absorbancia, T es transmitancia, I es intensidad

transmitida (la intensidad de la luz luego de atravesar la muestra) y Io es
intensidad incidente (la intensidad de luz antes de atravesar la
muestra).

5.- Construya una curva de calibarcion con los

siguientes valores:

Standard Standard Standard Standar4 Estándar

1 2 3 5
Concentracion 5 mg/d 10 mg/d 20 mg/d 30 mg/d 40 mg/d
Absorbancia 0.025 0.050 0.100 0.150 0.200

Con la curva obtenida halla la concentración de las siguientes muestras,

sabiendo que sus absorbancias fueron:
Muestra A…………………. 0.015
Muestra B………………….. 0.125
Muestra C………………….. 0.350

BIOQUIMICA Y NUTRICION
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA

BIOQUIMICA Y NUTRICION