TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y PURIFICACIÓN

DE PROTEÍNAS

Pasos
Iniciales:
Cromatografía
de
Cromatografía
de Filtración
Electroforesis
en Gel de
ELISA
Precipitación Intercambio en Gel Poliacrilamida
y Iónico
Centrifugación
 Objetivo y Selección del Tejido
• Debe determinarse de que tejido se va a purificar
la proteína y cuál es el objetivo.
• Objetivo 1: Determinar la presencia de una
proteína o determinar la actividad de una enzima
normal o anormal en un tejido
• Objetivo 2: Obtener una proteína o enzima
purificada con fines terapéuticos
• Puede obtenerse de líquidos
corporales (sangre, suero, etc) o de
un tejido
 Métodos de rompimiento celular
Mecánico Químico Enzimático

Homogenizador Solventes Lisozima

Prensa francesa Detergentes Proteasas

Molino Álcalis
Precipitación y centrifugación
 Cromatografía de Intercambio Iónico
• Hace uso de las propiedades iónicas de las
proteínas.
• Para ello, se emplean columnas empacada con
resinas de tienen en su superficie grupos
funcionales con carga.
• Dependiendo de la carga, pueden ser
intercambiadores catiónicos o aniónicos.
• En la industria se emplean Columnas pre
empacadas.
 Cromatografía de
intercambio iónico
NR
3+ NR

3+
NR
3+
NR
3+
NR
3+

NR
3+
NR
+
NR3
NR 3+
3+
 Cromatografía de intercambio
iónico Emplea resinas de
intercambio iónico

Pueden ser
Intercambiadores:
 Catiónicos
 Aniónicos
Analizador de Aminoácidos
ANALIZADOR
DE
AMINOACIDOS
Cromatografía de Filtración en Gel
• Separa en función del tamaño molecular de la
proteína.
• Emplea un biomaterial, que es un polímero de
dextrana (Sephadex) que se comporta como gel.
• Este material es poroso, con un tamaño de poro
determinado para rangos de tamaño molecular
de la proteína.
• El Sephadex G-100 no permite el paso de
proteínas de mas de 100 KDa
Salen primero las de mayor tamaño y al final las de menor tamaño
Gel de
Sephadex
visto al
microscopio.
Presenta
diferentes
tamaños de
poro.
Sephadex: Gel de
dextrana con poros
Cálculo del peso molecular.
Se grafica el volumen de elusión
en la columna contra el log del
peso molecular.
Electroforesis en gel de poliacrilamida
• Separa aplicando un campo eléctrico en un gel de
poliacrilamida, en función del tamaño molecular
de las proteínas.
• El gel, se prepara polimerizando la acrilamida, y
permitiendo la formación de una matriz porosa.
• Las proteínas e hacen correr a través de esta
matriz, aplicando un campo eléctrico.
• Las grandes avanzan mas lento que las pequeñas,
de modo que las bandas que menos avanzan
corresponden a las de mayor tamaño.
Electroforesis en gel de Poliacrilamida para proteínas.
Equipo empleado.
 Polimerización de
la acrilamida

Malla porosa que se

forma en la
polimerización de la
acrilamida
Cálculo de Peso
Molecular (PM)
Ensayo Western para la prueba confirmatoria de VIH.
Se emplean anticuerpos específicos para las proteínas
del Virus.

En el carril
señalado como
MW, se corre un
patrón de bandas
de proteína del
virus.
Las muestras que
den un patrón de
bandeado igual, se
consideran
positivas
 ELISA
• Enzyme Linked Inmonoadsorvent Assay, es una
técnica de identificación de proteínas mediante el
uso de anticuerpos.
• En un pozo se encuentra adsorbido un anticuerpo
(Ac), al cual se unirá el antígeno (Ag), proteínas,
presente en una muestra biológica. Un segundo
Ac, unido a una enzima, hará efecto sándwich.
• Después se agrega el sustrato de la enzima y un
cromóforo, que al desarrollar color, hará patente
la presencia de la proteína específica en la
muestra.
ELISA
Placa de Lector de ELISA,
ELISA. Los para cuantificar la
positivos cantidad de
desarrollan proteína
color

Kit comercial
para la
identificación
de HAV
mediante ELISA