UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Universidad del Perú, DECANA DE AMERICA

Facultad de Medicina Veterinaria
UNIDAD DE POSTGRADO

PROYECTO DE TESIS

1. Miembros del equipo de investigación:

MV. Manchego Sayán, Alberto (Director) __________________________

Rojas Chamochumbi, Tatiana Rubí (Tesista) ________________________

2. Título: 3. Código:

Detección y expresión de los receptores retinoicos RAR en la -----------------------

mucosa intestinal de crías de alpacas (Vicugna pacos)

4. Área de investigación:

Área de Investigación: Ciencias de la Vida

Línea de Investigación: Básica, producción y sanidad de camélidos sudamericanos

5. Resumen:

En animales de laboratorio el ácido retinoico es importante en la regulación de la respuesta

inmune en la mucosa intestinal. En alpacas se ha utilizado experimentalmente como
adyudante inmunoestimulante incrementando la producción de Inmunoglobulina A e
interleucinas asociadas a la respuesta humoral de mucosas, faltando determinar los
mecanismos de acción y la modulación de esta respuesta. El presente proyecto busca
establecer la presencia de receptores retinoides y la expresión de sus genes en la mucosa
intestinal en crías de alpaca. Se utilizarán muestras de 35 yeyunos, de las cuales se
obtendrán los ARN mensajeros totales y se les realizarán los RT-PCR en tiempo real con
cebadores específicos de los genes RAR alfa, RAR beta, RAR gamma. Se espera encontrar
los receptores de ácido retinoico RAR en la mucosa intestinal de crías de alpacas (Vicugna
pacos) tratadas con ácido retinoico.
6. Planteamiento del problema:

Se ha determinado que la administración de antígenos de C. perfringens y ácido

retinoico ejerce un efecto inmunomodulador positivo sobre la expresión de Ig A e
interleucinas asociadas en mucosa intestinal de crías de alpaca tratadas. Falta
establecer la presencia de receptores retinoicos en la mucosa intestinal de crías de
alpaca a fin de más adelante establecer su participación luego de la suplementación con
ácido retinoico, en la activación del sistema inmune de la mucosa intestinal, y así
manejar eficientemente esta respuesta, buscando mejorar la salud de las crías de
alpaca.

7. Antecedentes:

La acción de la vitamina A y sus derivados sobre la función de células linfoides, tales

como macrófagos, neutrófilos, células NK, linfocitos T y B, ha sido demostrada in vitro;
así como su participación en la síntesis de IFN-γ, TNF-α, IL-1, 2,3 y 4 y TGF-β y
actividad de muchas enzimas como fosfolipasa A2 y óxido nítrico sintasa que participan

1
 en la reacción inflamatoria a patógenos (Devaux et al, 2000). Todas estas acciones se
deben a su metabolismo, en donde se producen los metabolitos que inducen diversas
respuestas celulares. La vitamina A sirve como una prohormona de la que se derivan
tres clases de metabolitos activos: los aldehídos, los ácidos carboxílicos, y los retro-
retinoides.
Pese a que estas tres clases están unidas bajo la rúbrica de la transducción de señales,
actúan por mecanismos moleculares diferentes: los 11-cis-refinaldehidos se combinan
con la opsina para formar los pigmentos visuales universales y los ácidos retinoicos
forman ligandos para factores de trascripción, mientras que los retro-retinoides se
cruzan con la transducción de señales en un sitio citoplásmico o membrana (O`Connell
et a,. 1996). A nivel de las mucosas de los animales, la Vitamina A se metaboliza en las
células principalmente células dendríticas y se produce preferentemente ácido retinoico
(AR) que junto a otras citoquinas producidas localmente regulan las respuestas inmunes
intestinales a través de acciones inmunomoduladoras sobre las células intestinales
dendríticas (DCs) y linfocitos (Zeng et al 2013), asimismo mostraron que el AR también
controla la generación de precursores de DC migratorias intestinales, denominadas DCs
pre-mucosales (pre.u.DCs).
El ácido retinoico tiene receptores celulares que le permiten estimular las diversas vías
de transducción de señal a través de sus receptores. Los receptores de ácido retinoico
se pueden dividir en RARs (alfa, beta y gama) y RXRs (alfa, beta y gamma), cuyas
distribuciones son tejidos específicos (Niederreither y Dolle, 2008). El ácido retinoico
(RA) ejerce sus efectos sobre el crecimiento celular, la diferenciación, y la función
exclusiva de estos receptores nucleares (Dawson et al., 2008). Investigando la
expresión de estos receptores en los ganglios linfáticos y el timo se encontró que RARs
desempeña un papel clave en la modulación de los linfocitos T y B por el AR (Wei et al.,
2007, Zhou et al., 2008).La expresión de estos receptores de ácido retinoico se examinó
por primera vez en la mucosa intestinal de ratas normales y ratas con deficiencia de
vitamina A (VAD) para evaluar que expresión del receptor está influenciada más por VAD
utilizando un antagonista especifico de RARa (Ro 41-5253) para eliminar el papel de
RAR-a en la modulación de la AR de inmunidad de la mucosa intestinal. En la mucosa
intestinal de las ratas VAD, el ARNm de RARa fue regulado negativamente, el número
de células dendríticas (DC) aumentó, la secreción de IL-12 aumentó, pero la secreción
de IFN-g e IL-10 disminuyó. En las placas de Peyer cultivadas in vitro, el ácido retinoico
(all trans) promovió la maduración de DC, el ARNm de RARa fue regulado positivamente
y la IL-12 e IFN-g reducida, pero aumentó la expresión génica de IL-12. Estos efectos
del ácido trans-retinoico se invirtieron cuando se cultivaron con Ro 41-5253 (un
antagonista especifico de RAR-a (Dong et al., 2010).
Actualmente los integrantes del grupo de investigación GIVIVET recién formado, han
realizado estudios sobre el efecto que ejercen los inmunomoduladores e
inmunoestimulantes sobre la respuesta inmune en el intestino de camélidos
sudamericanos. Se ha determinado que la administración de antígenos de C.
perfringens y ácido retinoico ejerce un efecto inmunomodulador positivo sobre la
expresión de Ig A en mucosa intestinal de crías de alpaca tratadas. Los animales de
diversos grupos etarios presentaron mayor producción de ARNm de IgA en relación a
los animales controles (p<0.05) (Lázaro et al, 2015). Falta establecer la presencia de
receptores retinoicos en la mucosa intestinal de crías de alpaca a fin de más adelante
establecer su participación luego de la suplementación con ácido retinoico, en la
activación del sistema inmune de la mucosa intestinal, y así manejar eficientemente esta
respuesta, buscando mejorar la salud de las crías de alpaca.

8. Hipótesis:

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Los receptores retinoicos RAR están presentes, y expresan sus genes en la mucosa
intestinal de crías de alpacas.

9. Objetivos:
9.1. Objetivo general:

Establecer la presencia de receptores retinoides y la expresión de sus genes en la mucosa

intestinal en crías de alpaca.

9.2. Objetivos específicos:

1. Estandarizar pruebas de extracción de ARNm de receptores retinoides en mucosa

intestinal de crías de alpaca para más adelante trabajar con un inmunoestimulante de
receptores retinoicos.

10. Materiales y métodos:

10.1. Lugar de ejecución y periodo de duración:

El presente estudio se desarrollará en las instalaciones del Laboratorio de Microbiología y

Parasitología Veterinaria, sección Inmunología, de la Facultad de Medicina Veterinaria de la
Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM), ubicado en el distrito de San Borja,
ciudad de Lima Metropolitana, provincia de Lima, departamento de Lima, Perú. Se
desarrollará dentro el periodo comprendido entre Marzo del 2018 a Marzo del 2019.
10.2. Descripción del material experimental:

Las pruebas moleculares se realizarán en los ambientes de las secciones de Inmunología

veterinaria y Virología veterinaria del Laboratorio de Microbiología y Parasitología veterinaria
de la facultad de medicina veterinaria. En la sección de virología veterinaria se cuenta con
los ambientes (unidades) de diagnóstico molecular que consta de un área de 20 metros
cuadrados con esterilización con luz UV para realizar pruebas moleculares y cinética de
expresión de genes. En la sección de Inmunología se cuenta con equipo especializado para
la preparación de antígenos y desarrollo de pruebas serológicas. Se cuenta con una oficina
y equipos de computación necesarios para realizar el análisis estadístico de información.

Animales:

 35 crías de alpaca

Equipos e Instrumental

 Tanques de Nitrógeno líquido (-196º)

 Suero fisiológico al 0.9%
 Agua libre de nucleasas
 Cloroformo
 Microcentrifuga refrigerada
 Agitador Vórtex
 Etanol al 75%
 Tubos de 500 µl
 Pipetas
 Gradillas

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  Tubos Eppendorf de 2ml
 Termociclador a tiempo real (Equipo para PCR)
 Incubadora

Reactivos y Kits

 Trizol®Reagent (Invitrogen, USA): Solución monofásica de fenol con isotiocianato de

guanidina.
 SuperScript™ III First Strand Synthesis SperMix for qRT- PCR (Invitrogen, USA): Kit
de transcriptasa reversa MuLV H+, con RNAsa H+ de E.coli
 iQ CYBR Green Supermix (Bio-Rad)

Programas informáticos

 SoFtware Primer blast

 MS Word
 MS Excel

10.3. Diseño experimental u observacional:

Se trabajarán 35 muestras de intestino delgado (yeyuno) de crías de alpacas desde la

primera hasta la sexta semana, provenientes de la estación experimental de IVITA, en el
Departamento de Cusco, provincia de Canchis, distrito de Maranganí, obtenidas entre los
meses de enero y marzo del 2015. Éstas muestras han sido recolectadas en porciones 2cm
de yeyuno, lavados inmediatamente con suero fisiologicco al 0.9% para eliminar el
contenido intestinal potencialmente inhibidores de la técnica de RT – PCR TIEMPO REAL,
rotuladas cada muestra en su respectivo criovial de 20 ml y almacenadas en el tanque en
nitrógeno líquido a -196ºC, por los integrantes del grupo de investigación GIVIVET, llevadas
hacia las instalaciones del Laboratorio de Microbiología y Parasitología Veterinaria, sección
Inmunología, de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de
San Marcos (UNMSM),

1) Procesamiento de las muestras.

Se tomarán estas secciones y serán lavadas con suero fisiológico al 0.9% para luego
realizar el raspado profundo de la mucosa con hoja de bisturí. El raspado será reconstituido
con 500µl de agua libre de nucleasas. Se obtendrá dos alícuotas por cada muestra y se
conservarán a -196ªC.

2) Extracción de ARN total.

Con el fin de evaluar la expresión de diversas isoformas de receptores retinoicos
(RARs) se realizará la obtención de los ARN totales de cada muestra, procesándolas
con 1ml del reactivo Trizol®Reagent de la marca Invitrogen (USA). Éste método se
basa en el uso de una solución monofásica de fenol con isotiocianato de guanidina
para la lisis de las células y la separación de la muestra en dos fases (acuosa y
orgánica), seguida de la extracción y precipitación del ARN total con cloroformo e
isopropanol respectivamente a partir de la fase acuosa. La mezcla se homogenizará
mediante votex y se le adicionara a 200 µl de cloroformo, se agitará vigorosamente
durante 15 seg. Posteriormente la muestra se centrifugará a 12000 g por 10 minutos
a 4ºC; en este paso se formarán dos fases: la fase fenólica orgánica, contiene ADN y
restos de proteínas desnaturalizadas y la fase superior acuosa contiene el ARN en

4
 cloroformo. Ésta fase acuosa se transferirá a un tubo nuevo y libre de nucleasas de
1.5 ml, luego se adicionarán 500 µl de isopropanol el cual precipitará el ARN. Se
centrifugará la mezcla a 12000 g por 10 minutos a 4ºC y luego se eliminará el
sobrenadante, dejando sólo el pellet de ARN. Se lavará con etanol al 75% frio y se
centrifugará a 7500 g por 5 minutos a 4ºC. Finalmente se procederá a disolver el
pellet en 60 µl de agua libre de nucleasas y se alicuotará en tubos de 500 µl, cada
uno con 30 µl de ARN. Se almacenará en nitrógeno líquido a -196ºC, hasta su
procesamiento para RT-PCR. El ARN obtenido se cuantificará usando el kit Quant-
iT™ RNA HS (Invitrogen, EEUU) y el fluorómetro Qubit® (ThermoFisher Scientific,
EEUU), siguiendo las indicaciones del fabricante, para cuantificar el ARN y poder
aislar 1 µg de ARN total. Una vez cuantificado se procederá a realizar diluciones en
agua libre de nucleasas con el fin de trabajar con 1µg en un volumen de 2 µl por
muestra y usarla en el RT – PCR tiempo real.

3) Síntesis de ADNc (Transcripción reversa)

El ARN obtenido de cada una de las muestras será tomado como templado para
síntesis de ADNc (ADN complementario) empleado el kit “SuperScript™ III First
Strand Synthesis SuperMix for qRT- PCR (Invitrogen, USA), según las instrucciones
del fabricante. El kit emplea la transcriptasa reversa MuLV H+ para generar ADNc a
partir de moléculas de ARN templado en las muestras y viene proveído de dNTP,
hexámeros al azar (0.2 µM, concentración final) y sales para optimizar la reacción.
Todo el material empleado será nuevo y libre de nucleasas, adicionalmente, la
habitación y materiales como pipetas, gradillas, y además materiales plásticos no
perecibles serán irradiados con luz ultravioleta por espacio mínimo de 12 horas
previas a su uso.
Los componentes de la reacción se preparan como premezcla de Síntesis de ADNc,
teniendo en cuenta el número de muestras y volumen final de reacción por muestra,
mediante su mezcla en tubos eppendorf de 2ml de capacidad.
Ésta pre mezcla se mantendrá en hielo durante su preparación y antes del uso para
prevenir el inicio de la reacción a temperatura ambiente. Las concentraciones finales
de los componentes de la síntesis de ADNc en un volumen final de 20 µl por
reacción/muestra serán agregados en el siguiente orden y concentración:
a) 2xRT Reaction mix 10µ x n*
b) RT enzyme mix 1µl x n
c) Hexámeros al azar 1µl x n
d) H2O 6 µl x n
*donde “n” significa el número de muestras a trabajar.

Se dispensará 18 µl del master mix en tubos descartables individuales con tapa

incorporada para termociclador de 200 µl de capacidad. Seguidamente, se añadirá 2
µl de ARN templado de cada una de las muestras en los tubos correspondientes de
modo que el templado no exceda al 10% del volumen final de la reacción.Las
muestras serán llevadas al termociclador PTC-200 Engine Chromo IV de MU
Research – Biorad (USA) programado con el siguiente protocolo: 25ºC por 10
minutos, 50ºC por 30 minutos, terminando la reacción a 85ºC por 5 minutos. Se
añadirá 2 UI de RNAs a H+ de E.coli (provisto por el kit) a cada pocillo y se incubará
a 37ºC por 20 minutos para destruir la molécula ARN de hibrido ARN: ADNc. El
ADNc obtenido será congelado será congelado a -70ºC hasta su uso en la reacción
de PCR Tiempo Real.

4) Elaboración de cebadores o primers.

Se hará uso del software Primer blast para la obtención de los cebadores de cada
uno de los genes utilizando las secuencias establecidas en el Genbank como sigue:

5
 Gen código identificación Genbank
RARa XM 006214276.2
RaRb XM_006205308.2
RARg XM_006203038.2

5) PCR a Tiempo Real.

El ADNc previamente obtenido será analizado mediante el PCR en tiempo real
cuantitativo en triplicados usando iQ CYBR Green Supermix (Bio-Rad). La cantidad
inicial (SQ) de la muestra de ADNc inicial será calculada de curvas estándar primers
específicas usando el Sofware de Análisis de información iCycler. El nivel de
expresión de cada gen será normalizado al nivel de expresión de actina usando un
método de curva estándar.

Las condiciones de la PCR a tiempo real para todos los genes serán las siguientes:
50ºC por 2 min, 95ºC por 10 min (activación de la ADN polimerasa), seguido de 45
ciclos d 95ºC por 15 segundos y 60ºC por 60 segundos. Una vez finalizado el
proceso (stop), los tubos serán retirados del termociclador y refrigerados a 4ºC.

Los resultados serán visualizados a través del software 7500 For 7500 and 7500
Fast Real Time PCR versión 2.0.6, obteniéndose los valores de Ct (ciclo umbral) y
temperaturas de disociación de cada uno de los productos de PCR. La fluorecencia
emitida por los amplicones al finalizar cada ciclo (extensión) y empezar el siguiente
(desnaturalización) es interpretada como “temperatura de disociación”.

10.4. Análisis de la información:

Se empleará la prueba de Shapiro-Wilk para determinar la normalidad de las variables. En

las variables seguirá la distribución normal, que se realizará con la prueba de Análisis de
varianza (ANOVA) de un factor para determinar si existe diferencia estadísticamente
significativa entre los grupos.

10.5. Consideraciones éticas

Ninguno de los procedimientos usados en el diseño experimental contempla dolor o

sufrimiento de los animales usados. Los animales fueron sacrificados según el protocolo de
Autorización Nº2009-001 del Comité de Ética y Bienestar Animal de la Facultad de Medicina
veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Para el sacrificio de los
animales se empleó 1.5 mg/kg de xilacina (Rompun®) y 7.5 mg/kg de ketamina (Vetalar®),
vía intramuscular, seguido por una sobredosis de 50 mg/kg, vía endovenosa, de
pentobarbital sódico (Halatal®).

11. Literatura citada:

1.- Lázaro R, Manchego A, Pezo D, More J, Castro G, Siuce J, Sandoval N. 2015. Efecto de
antígenos de Clostridium perfringens y ácido retinoico sobre la expresión de IgA en la
mucosa intestinal de crías de alpacas (Vicugna pacos) Rev. Investig. Vet. Perú vol.26 nº4
Lima.
2.- Livak K, Schmittgen T. 2001. Analysis of relative genes expression data using Real Time
Quantitative PCR and the 2- ΔΔCt Method. ElsierverScience 25:401112-408.

6
3.- Niess J, Brans S, Gu X, Landsman L, Jung S, McCormick B, Vyas J, Boes M, Ploeg H,
Fox J. 2005. CX3CR1-mediated dendritic cell Access to the intestinal lumen and bacterial
clearance. Science, 307 (2005), pp.254-258.
4.- O`Connell MJ, Chua R, Hoyos B, Buck J, Chen Y, Derguini F, Hammerling U. 1996.
Retro-retrinoids in regulated cell growth and death. J Exp Med 184(2): 549-555.
5.- Wei D, Yang Y, Wang W. 2007. The expression of retinoica cid receptors in lymph nodes
of young children and the effect of all-trans-retinoic acido n the B cells from lymp nodes. J
Clin Inmunol: 27:88-94.
6.- Zeng R, Oderup C, Yuan R,Lee M, Habtezion A, Hadeiba H, Butcher EC.2013. Retinoic
acid regulates the development of a gut-homing precursor for intestinal dendritic cells.
Mucosal Inmunol 6(4): 847-856.
7.- Zhou X, Wang W, Yang Y. 2008. The expression of retinoica acid receptors in thymus of
Young children and the effect of all-trans-retinoic acido n the development of T cells in
thymus. J Clin Immunol; 28:85-91.

12. Impacto potencial de los resultados de la investigación:

Los resultados del proyecto permitirán tener conocimientos sobre efecto del ácido retinoico
como inmunomodulador de la respuesta inmune de la mucosa intestinal de las alpacas a
edades tempranas y así establecer estrategias que permitan una eficiente protección
inmune, como vacunaciones o suplementaciones alimenticias, que evite los problemas
infecciosos en las crías de alpacas que es la edad critica en la crianza de éstas. Este
estudio es novedoso y los resultados permitirán establecer herramientas que mejores la
sanidad de los camélidos sudamericanos en el país.

13. Estrategia operativa (optativo) y cronograma de ejecución de actividades:

Actividad Fecha inicial Fecha final
1 Preparación de muestras 04/12/2018 05/12/2018
2 Extracción de ARN total y síntesis de cDNA 05/12/2018 05/12/2018
3 Desarrollo de PCR tiempo real 06/12/2018 06/12/2018
4 Elaboración de cebadores específicos y 01/12/2017 01/03/2018
estandarización de la prueba
5 Análisis de resultados 14//12018 30/12/2018
6 Informe económico 28/12/2018 28/12/2018
7 Informe académico 15/03/2019 15/03/2019

7
15. Presupuesto:
Partida Monto s/ Tipo %
1 Papelería en general, útiles y materiales de 250.00 bienes 1.67%
oficina.
2 Materiales, insumos, instrumental y 5175.00 bienes 34.50%
accesorios médicos, quirúrgicos,
odontólogos y de laboratorio.
3 Equipos (laboratorio) 2000.00 bienes 13.33%
4 Subvención Financiera a Investigadores 3000.00 otros 20.00%
Científicos
5 Pasajes y gastos de transporte )Interior) 750.00 servicios 5.00%
6 Viáticos y asignaciones por comisión de 500.00 servicios 3.33%
servicio
7 Otros gastos (movilidad local) 325.00 servicios 2.17%
8 Servicios diversos 3000.00 servicios 20.00%
TOTAL 15000.00 100%

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