Pada banyak spesies, orientasi pembelahan sel pertama tergantung

pada posisi spindel mitosis relatif terhadap sumbu polaritas (Siller dan
Doe, 2009) (Lu dan Johnston, 2013). Di manusia, tidak
data langsung tersedia pada mekanisme yang terlibat dalam pembentukan
polaritas atau orientasi bidang pembelahan selama pembelahan; namun,
kemungkinan hal ini diatur oleh interaksi antara sitoskeleton, pensinyalan
reseptor yang diaktifkan proteinase dan sel ke sel
komunikasi analog dengan yang dilaporkan pada spesies lain (Ajduk
dan Zernicka-Goetz, 2016).
Pada perkembangan embrio awal, penampilan fragmentasi diketahui
mempengaruhi kualitas embrio,
sebagian besar fragmen muncul pada tahap dua sel,
fragmentasi hanya dijelaskan ketika sitokinesis
lengkap, dan dua blastomer bulat dan sepenuhnya
terbentuk. Tingkat fragmentasi dinyatakan sebagai 0–10%, 10–
20%, 20-50%, dan lebih dari 50%.

(A)Pengamatan benang perivitelline dan hubungannya dengan fragmentasi dan

orientasi pembelahan. Setelah pronuklir
memudar, zigot bergerak menuju permukaan bagian dalam zona pellucida (panah
putus-putus) untuk membentuk area kontak langsung (B, panah). Itu
alur pembelahan dimulai dari daerah paling jauh dari zygote (C, kepala
panah), tepat di seberang area kontak ini (panah).
Benang perivitelline diperkirakan meluas di sepanjang sumbu ini,
mengarahkan pembelahan dalam efek string purse string ’yang menarik
sitoplasma distal
membran ke dalam menuju area ini kontak membran - zona pellucida (D). Saat
alur pembelahan memperdalam benang perivitelline
diamati di ruang perivitelline (E). Ketika sitokinesis berkembang, benang
diamati melekat pada sitoplasma ekstra-embrionik,
yang diambil sebagai fragmen (f)
Setelah pronukleus memudar, zigot biasanya bergeser di dalam
ruang perivtelline, bersentuhan dengan zona pellucida
(Gambar 6B, panah hitam). Pembelahan alur diamati untuk memulai di wilayah
yang berhadapan langsung dengan bidang kontak ini (Gambar 6C,
kepala panah kecil). Benang-benang tampak memanjang di sepanjang sumbu ini,
tampaknya menarik membran sitoplasma ke dalam menuju area ini
kontak (Gambar 6D). Ketika sitokinesis berkembang, benang muncul untuk
mengeluarkan fragmen dari membran sitoplasmik di
belahan pembelahan (Gambar 6E). Fragmen-fragmen itu tampaknya tidak
terlepas
sepenuhnya dari membran, yang tersisa terakumulasi di alur
Louise Kellam, and et.al. 2017. Perivitelline threads in cleavage-stage
human embryos: observations using time-lapse imaging. Vol 35 Page 646–656.
Reproductive Healthcare. Elsevier Ltd.

Pada domba, hampir 85% matang

oosit dibuahi setelah IVF. Namun, hanya sekitar
30% zigot berkembang ke tahap blastokista setelah 8 hari
kultur in vitro

PROSEDUR PENELITIAN
Semua bahan kimia dan media kultur sel dibeli dari
Sigma – Aldrich (St. Louis, MO, USA), kecuali dinyatakan lain.
Semua peralatan plastik diperoleh dari Falcon Becton Dickinson
(Franklin Lakes, NJ, USA). Indung telur Sanjabi diperoleh
dari rumah potong hewan lokal dan diangkut dalam termo
mengandung saline normal (30-35 8C), diperkaya dengan penisilin
(400 IU / mL) dan streptomisin (50 mg / mL). Semua ovarium
dicuci dengan garam. Folikel terlihat di permukaan
(Diameter 2-6 mm) disedot menggunakan alat ukur 21 steril
jarum ke dalam media pengumpul oosit, terdiri dari TCM199 yang dilengkapi
dengan 25 mM HEPES + 0,3% serum sapi
albumin (BSA). Semua oosit dicuci 5-6 kali dengan
media cuci yang terdiri dari TCM-199 ditambah dengan
50 mg / mL gentamisin dan 10% (v / v) serum ovin janin (FOS).
Kompleks oosit kumulus (COC) dengan ≥3 lapisan
sel kumulus kompak dan ooplasma homogen
digunakan dalam percobaan.
Setelah klasifikasi oosit, COC dicuci tiga
kali dalam medium pematangan (TCM-199; Earle's Garts dengan Lglutamine dan
sodium bicarbonate; Gibco, Waltham, MA, USA)
ditambah dengan 0,5 mg / mL FSH, 5 mg / mL LH, 1 mg / mL
estradiol 17-ß, 50 mg / mL gentamisin sulfat dan 10% (v / v)
FOS). COC diinkubasi dalam cawan kultur jaringan selama 24 jam
pada 38,5 8C dalam atmosfer yang lembab 5% CO2 di udara.
Semen segar ram dengan kesuburan yang diketahui digunakan untuk
IVF. Motilitas sel sperma dievaluasi di bawah
mikroskop terbalik dan spermatozoa motil adalah
dipisahkan menggunakan teknik berenang [7]. Setelah IVM, itu
COCs sebagian gundul sel granulosa oleh lembut
pemipaan, lalu dicuci tiga kali dalam pemupukan
sedang (TALP). Kelompok 5-7 oosit dipindahkan ke
48 mL tetesan pembuahan. Inseminasi pun dilakukan
dengan menambahkan 1-22 spermatozoa / mL, 2 mg / mL heparin,
dan PHE (penicillamine, 20 mmol / L; hypotaurine, 10 mmol / L;
epinefrin, 1 mmol / L). Oosit diinkubasi dengan
spermatozoa selama 6-7 jam pada suhu 38,5 8C dan 5% CO2 dalam kondisi
lembab
suasana udara.
Setelah 6-7 jam co-inkubasi, zigot yang diduga adalah
gundul dari sel kumulus yang tersisa oleh pemipaan lembut.
Setelah dicuci, zigot dugaan dikultur
kelompok 10-15 dalam 60 mL tetesan media KSOM-aa dan
dikultur sampai hari ke 8 setelah pemupukan pada suhu 38,5 8C dalam kondisi
lembab
atmosfer CO2 5%. Media kultur disegarkan
setiap 48 jam. Pembelahan dinilai setelah 48 jam kultur, dan
jumlah embrio berkembang ke morula dan blastokista
tahap dinilai pada hari 4 dan 6, masing-masing (hari 0 = hari
IVF). Dalam penelitian ini, sistem dua langkah budaya
bekas. Media KSOM-aa pertama (KSOM-aa1) mengandung 0,8%
BSA mengkristal digunakan untuk 48 jam pertama. Lalu, medianya
digantikan oleh media KSOM-aa kedua (KSOM-aa2)
mengandung 0,8% FOS dan digunakan selama 6 hari tersisa
budaya.
Setelah pematangan dan pembuahan, dugaan zigot
dikultur dalam medium KSOM-aa yang dilengkapi dengan
konsentrasi sericin yang berbeda. Ex vivo dibuahi
zygote ditugaskan ke kontrol, mis., sericin-tidak terpapar,
kelompok (treatment1; T1) dan kelompok berikut in vitro
embrio kultur terpapar 0,1% (pengobatan 2; T2), 0,5%
(pengobatan 3; T3), 1% (pengobatan 4; T4) atau 2,5% (pengobatan 5; T5)
sericin. Setiap percobaan diulang lima kali. Itu
analisis statistik dilakukan dengan menggunakan paket program SAS
(SAS untuk Windows, versi 9.1). Pembelahan, morula dan
tingkat blastokista di antara kelompok perlakuan diperiksa
distribusi normal menggunakan Proc Univariate. Jika diperlukan, kami
menggunakan
konversi data (log data) kemudian analisis varian
(ANOVA) dilakukan pada data baru (didistribusikan secara normal)
menggunakan Proc GLM. Tes rentang berganda Duncan adalah
digunakan untuk menguji perbedaan antara perawatan. Nilai-nilai
dinyatakan sebagai rata-rata SD dan p <0,05 dianggap
tingkat signifikan

Laju sintesis adenosin trifosfat (ATP) meningkat pada saat pembentukan

blastokista untuk mendukung secara cepat
sintesis protein dan peningkatan aktivitas ion membran transpor [13].
Peningkatan oksigen dan energi substrat seperti glukosa dan piruvat,
bersama dengan
peningkatan laju sintesis ATP, menunjukkan peningkatan oksidatif
metabolisme, yang mengarah ke peningkatan spesies oksigen reaktif
(ROS) produksi selama pengembangan embrio. Karena itu, suplementasi sedang
dengan
tingkat antioksidan yang tepat memungkinkan untuk mencapai yang optimal
perkembangan embrio.

Faranak Aghaz,and et al. 2016. In vitro culture medium (IVC)

supplementation with sericin improves developmental competence of ovine
zygotes. Vol 6. Page 8 7 – 9 0. Society for Biology of Reproduction & the
Institute of Animal Reproduction and Food Research of Polish Academy of
Sciences in Olsztyn. Elsevier Sp. z o.o.

PROSEDUR PENELITIAN
Produksi embrio in vitro dilakukan sesuai dengan yang dipublikasikan
prosedur (Shirazi et al., 2009). Secara singkat, ovarium dikumpulkan pada a
rumah jagal lokal dan diangkut ke laboratorium pada 20-25 ° C
dalam 3–5 jam dalam salin normal yang ditambah dengan 100 IU / ml
penisilin.
Indung telur dicuci tiga kali dengan saline segar yang dipanaskan
sebelumnya (37 ° C),
dan semua folikel yang terlihat dengan diameter 2-8 mm disedot menggunakan
vakum lembut melalui set 21 vena kulit kepala terhubung ke tabung 50 ml.
Isi folikel dilepaskan ke dalam pra-inkubasi HEPES-TCM199,
ditambah dengan penisilin dan streptomisin dan 50 IU / ml heparin.
Cumulus – oocyte complexes (COCs) dengan ≥ tiga lapis kumulus
sel, sitoplasma seragam seragam dan distribusi homogen
tetesan lipid dipilih untuk percobaan. COC terpilih
(n = 851) secara in vitro dimatangkan dalam TCM199 ditambah dengan 10%
FBS (serum janin sapi, Gibco 10270, Jerman), 0,2 mM Na-piruvat
dan 0,1 IU / ml FSH. Sepuluh hingga 12 COC dipindahkan dalam 50 μl media
pematangan dalam cawan Petri 60 mm (Falcon 3004; Becton & Dickinson,
Franklin Lakes, NJ), dilapisi dengan minyak mineral steril dan
dibudidayakan
selama 24 jam dalam 8% CO2 di udara pada 39 ° C. Setelah maturasi, COC (n =
851)
terpapar spermatozoa motil (pada 1 × 106 spermatozoa / ml
konsentrasi) diperoleh dengan sentrifugasi dari breed beku yang dicairkan
ram semen pada gradien kepadatan Percoll yang terputus-putus (1 ml 40%
lebih
1 ml 90%) pada 700g selama 20 menit. Oosit dikultur bersama dengan
spermatozoa dalam media TALP yang dilengkapi dengan 6 mg / ml BSA yang
merupakan
dilapisi dengan minyak mineral pada suhu 39 ° C dalam atmosfer 8% CO2 di
udara. Di
18-20 jam post inseminasi (hpi), dugaan zigot (n = 827) adalah
mekanis gundul sel kumulus mereka dan dialokasikan untuk
Grup CSM, IMO atau OCM.
Dalam CSM, embrio dikultur dalam 20 μl droplet (lima hingga enam embrio /
droplet) dari cairan saluran telur sintetis yang dilengkapi dengan amino
asam dan BSA (SOFaaBSA) dilapisi dengan minyak mineral, selama 7 hari pada
39 ° C
dalam atmosfer 7% O2, 7,5% CO2, dan 85,5% N2. SOFaaBSA
dilengkapi dengan 2% (v / v) basal medium eagle (BME) -penting
asam amino, 1% (v / v) MEM asam amino tidak penting, dan 8 mg / ml
BSA bebas asam lemak (Tervit et al., 1972). Setelah tiga hari budaya (Hari
0 hari pembuahan) 10% arang striped fetal bovine serum (CSS)
ditambahkan ke dalam medium dan kultur dilanjutkan sampai 7 hari setelah
pemupukan.
ROS
Spesies oksigen reaktif (ROS) menyebabkan pembentukan sangat
radial hidroksil yang merusak, yang pada gilirannya, meningkatkan
peroksidasi lipid,
Kerusakan DNA, dan apoptosis yang
akhirnya menurunkan sel embrionik
viabilitas (Lane et al., 2002).

Abbas Farahavar., and et al. 2018. Improving the quality of ovine embryo produced in vitro

by culturing zygote in isolated mouse oviduct. Vol 161. Page 1-6. Small Ruminant Research.

Elsevier B.V.

Berdasarkan pada sumber dan sifat dari sinyal hipotetis, model untuk
pembelahan alur pembelahan telah secara konseptual diklasifikasikan
menjadi empat kelas utama: (a) stimulasi astral, (b) relaksasi kutub,
(c) stimulasi gelendong pusat dan (d) spesifikasi MA-independen (Gbr. 1).
Sejak ditemukannya Rho GTPase sebagai aktivator kunci
dari jaringan kontraktil actomyosin selama sitokinesis [16-18],
model-model ini telah dirumuskan ulang untuk memasukkan aktivasi lokal atau
inaktivasi Rho (dan GTPase terkait), yang dapat
divisualisasikan secara langsung dengan aktivitas neon yang baru
dikembangkan
probe [19–21].
1.1. Stimulasi astral
Model stimulasi astral mengasumsikan bahwa sinyal positif untuk
kontraksi kortikal memancar di sepanjang mikrotubulus astral dan itu
bentuk pembelahan alur di lokasi stimulasi maksimal,
kemungkinan besar di mana aster dari dua kutub bertemu atau tumpang tindih
(Gbr. 1A). Model ini telah didukung oleh berbagai jenis percobaan
mikromanipulasi pada embrio echinoderm oleh Rappaport
dan lainnya, diwakili oleh percobaan "torus" ikonik Rappaport
[22]. Zigot yang dideformasi menjadi torus oleh mikroneedle terbagi pada
posisi yang diprediksi oleh spindel mitosis dan
kromosom, menghasilkan sel binukleat berbentuk tapal kuda
(Gbr. 2, Divisi 1). Di divisi kedua, dua spindle terbentuk
di dekat kedua ujung tabung berbentuk tapal kuda, dan belahan pembelahan
membentuk sedemikian rupa sehingga mereka membagi dua kromosom segregasi
(Gbr. 2,
Divisi 2, alur utama). Terkadang, galur sekunder adalah
terbentuk di sisi jarum di seberang situs pembelahan pertama,
di mana tidak ada nukleus atau spindel mitosis (Gbr. 2, 2
divisi, alur sekunder). Eksperimen ini menunjukkan bahwa a
alur dapat membentuk independen dari spindel dan kromosom dan
bahwa aster, satu-satunya substruktur MA yang dapat mempengaruhi
zona antara kedua MA, dapat menginduksi alur. Pengamatan
bahwa alur sekunder tidak terbentuk pada divisi pertama, juga tidak
dalam beberapa kasus di divisi kedua, ketika spindle terlalu jauh
dari korteks bagian belakang menentang model relaksasi polar
dan menunjukkan bahwa geometri antara kita aster dan korteks adalah
penting. Percobaan mikromanipulasi serupa pada embrio Caenorhabditis
elegans menunjukkan bahwa penjajaran dua aster
cukup untuk induksi alur, sedangkan kromatin dan
spindle pusat dapat digunakan
Namun, simulasi teoritis telah mengungkapkan bahwa asumsi paling sederhana,
yaitu, bahwa
sinyal penginduksi alur sebanding dengan kepadatan permukaan
mikrotubulus yang didistribusikan secara alami dari kutub gelendong,
tidak menjelaskan hasil eksperimen [24]. Namun, masalah ini dapat diatasi
dengan memasukkan asumsi tambahan [25-27],
yang menyiratkan bahwa variabel tambahan, seperti geometri
rakitan mikrotubulus (mis., tumpang tindih mikrotubulus dari
berlawanan kutub), harus dipertimbangkan selain mikrotubulus
massa jenis.
1.2. Relaksasi kutub
Model relaksasi polar memberikan kesesuaian yang lebih baik dengan
pengaturan distribusi mikrotubulus astral yang paling sederhana dalam sel
bola.
Dalam model ini, mikrotubulus astral, yang memiliki lebih intim
kontak dengan korteks kutub daripada korteks khatulistiwa, menginduksi
relaksasi kontraktilitas kortikal di daerah kutub [28]
(Gbr. 1B); ini akan menghasilkan kontraksi yang relatif lebih besar di
wilayah khatulistiwa dan menginduksi alur. Eksperimen pada embrio C.
elegans, di mana diamati kortikal myosin-II
gangguan penempatan spindle atau panjang mikrotubulus astral, menunjukkan
bahwa mikrotubulus astral memang memiliki negatif
efek pada kontraktilitas kortikal [23,29]. Namun, kehadiran
perkiraan kepadatan mikrotubulus lokal minimum di wilayah alur dugaan masih
kontroversial [30-32]. Model ini adalah
didukung oleh hasil reposisi aster pada spermatosit ulat sutra [33],
depolimerisasi selektif mikrotubulus astral
dalam sel epitel mamalia [34] dan embrio echinoderm [35],
dan laser ablasi dari centrosome tunggal pada C. elegans embrio [36].
Tantangan utama mengenai skema ini adalah bahwa regulasi negatif saja tidak
dapat menjelaskan hasil dari berbagai pengaturan mikro
eksperimen yang mengubah geometri bentuk dan spindel sel
posisi
1.3 Poros tengah
Berbeda dengan hasil dengan zigot / embrio besar, yang
mengandalkan mikrotubulus astral untuk induksi alur, percobaan di
sel yang lebih kecil telah menyoroti peran poros tengah
induksi pembelahan alur (Gbr. 1C). Spindel pusat (juga disebut
midzone gelendong, terutama ketika fokus pada tumpang tindih pusat) adalah
substruktur dari anafase MA, yang terbentuk di antara
memisahkan kromosom dengan bundel mikrotubulus non-kinetokor dengan tumpang
tindih anti-paralel sentral, interdigitating, [37]. Di
sel ginjal tikus normal (NRK), yang memiliki asal epitel dan
tetap menyebar dengan baik selama mitosis, perforasi yang dibuat oleh jarum
antara poros tengah dan salah satu pinggiran khatulistiwa memungkinkan
pembentukan alur di sisi perforasi di mana
poros tengah berada [38]. Sebaliknya, ini mencegah alur
formasi di sisi lain perforasi, di mana poros tengah tidak berada, meskipun
banyak mikrotubulus astral
dari dua kutub terdeteksi di wilayah ini. Divisi sel di
Mutan Drosophila asterless [39] dan mikromanipulasi MA
pada neuroblas belalang [40] juga berimplikasi pada poros tengah
dalam induksi alur. Penemuan molekul yang melokalisasi keduanya
ke spindel pusat dan ke korteks alur pembelahan, seperti
kompleks kromosom penumpang (CPC) dan Ect2, aktivator utama Rho selama
sitokinesis, juga mendukung model ini (lihat di bawah)
[41–45].
1.4. Spesifikasi alur MA-independen
Secara umum, kontraktilitas kortikal oleh jaringan actomyosin dapat
diinduksi independen dari anafase MA. Pseudocleavage selama
tahap pra-mitosis pada C. elegans zygotes dan metaphase-furrow
pembentukan selama divisi sinkronisasi embrio Drosophila adalah
contoh-contoh seperti itu [46,47]. Persyaratan molekuler dasar untuk
kontraktilitas kortikal, seperti Rho dan myosin-II, tampaknya dimiliki
bersama
antara tipe ini berkerut dan sitokinesis normal. Baru saja,
kasus-kasus dari spesifikasi alur-alur sitokinetik MA-independen miliki
telah dilaporkan, di mana kortikal myosin-II sangat asimetris
kemungkinan terlokalisasi di bawah isyarat polaritas menentukan posisi alur
[48–50] (Gbr. 1D). Bagaimana isyarat polaritas seperti protein PAR mungkin
memiliki peran dalam penentuan posisi alur MA-independen dalam asimetris
pembelahan sel menjadi topik hangat saat ini [51,52].
1.5. Koeksistensi dan kerja sama
Model-model konseptual berbeda dari induksi alur tidak
saling eksklusif. Memang, koeksistensi aster-dependent
dan jalur bergantung spindle sentral dalam satu sel telah
diperagakan dalam embrio C. elegans dengan manipulasi laser untuk
memisahkan aster secara spasial dan gelendong pusat [53]. Selain itu
alur primer diprediksi oleh mikrotubulus astral, sekunder
alur terbentuk ketika poros tengah yang dipindahkan mendekati
korteks sel. Persyaratan komponen gelendong pusat yang
menstimulasi aktivasi Rho (lihat di bawah) untuk pengerutan dalam oleh
jalur yang bergantung pada aster mendukung model stimulasi astral.
Jadi, bersama dengan relaksasi kutub yang bergantung pada aster [23,29],
semuanya
tiga skema MA-dependen hidup berdampingan dalam embrio C. elegans di
tahap satu sel. Peran mikrotubulus astral dalam melokalisasi protein
kontraktil juga telah dilaporkan dalam sel mamalia
Gambar Model-model induksi pembelahan alur

Gambar Pembelahan sel pertama terjadi antara memisahkan kromosom,

menghasilkan berbentuk tapal kuda
sel binukleat. Menariknya, pada divisi kedua, di samping alur-alur yang
membagi kromosom-kromosom yang memisahkan (alur-alur primer), alur-alur
lain muncul di antara
asters yang tidak terhubung oleh spindle (galur sekunder)

Masanori Mishima. 2016. Centralspindlin in Rappaport’s cleavage signaling.

Vol 53 Page 45–56. Seminars in Cell & Developmental Biology. Elsevier Ltd.

Intracytoplasmic sperma injection (ICSI) adalah teknik reproduksi

berbantuan di mana satu spermatozoon disuntikkan langsung ke oosit matang
untuk mencapai pembuahan
(Palermo et al., 1992). Pemupukan adalah proses kompleks
interaksi sperma-oosit di mana spermatozoon mengaktifkan metafase kedua
(MII) -ditangkap oosit (Williams,
2002), dan yang terdiri dari serangkaian perubahan morfologi dan biokimia
yang teratur yang penting untuk perkembangan normal: kumulus dan penetrasi
zona oleh spermatozoa diikuti oleh fusi dengan oolemma; aktivasi oosit;
eksositosis granula kortikal yang menyebabkan pengerasan zona
blok pellicuda dan polispermia; penyelesaian meiosis dan
pengusiran tubuh kutub kedua, spermatozoa dan oosit
pembentukan pronukleus (dua-pronuklear zigot [2PN]); persatuan pronuklir;
dan inisiasi siklus sel embrionik awal
Jika ICSI dilakukan, peristiwa penetrasi sperma dilewati dan pembuahan
dimulai dari
Peristiwa aktivasi oosit (Ebner et al., 2012).
Aktivasi oosit ditandai dengan peningkatan, dan
penyebaran gelombang Ca2 + intraseluler (Whitaker, 2006). Spermatozoa
adalah stimulus alami yang bertanggung jawab untuk menginduksi
Osilasi Ca2 + (Miyazaki et al., 1993), mengarah ke kompleks
serangkaian peristiwa (Nasr-Esfahani et al., 2010) yang mengubah
oosit MII matang menjadi 2PN (Horner dan Wolfner, 2008)
dan secara kolektif dikenal sebagai 'aktivasi oosit.' Setelah pembentukan
pronukleus pria dan wanita, pensinyalan kalsium
terus berperan dalam fusi 2PN, sintesis DNA, dan
inisiasi pembelahan pertama Itu
peran osilasi Ca2 + tidak terbatas pada inisiasi dan
penyelesaian proses pembuahan, tetapi berlanjut beberapa
jam setelah pembuahan (Tesarik, 1999) menjadi pemicu berikutnya
peristiwa mitosis dan berkontribusi pada regulasi siklus sel
Aktivasi oosit secara artifisial dapat dicapai dengan suatu variasi
dari stimuli: kimia, listrik dan mekanik, yang meningkatkan level Ca2 +
intraseluler (Alberio et al., 2001; Yamano
et al., 2000). Aktivasi oosit kimia adalah yang paling luas
menggunakan metode untuk aktivasi setelah ICSI (Ebner et al., 2012), dan
dapat dicapai dengan berbagai agen kimia seperti 7%
etanol (Presicce dan Yang, 1994), strontium chloride
(Cuthbertson et al., 1981), ester phorbol (Cuthbertson dan
Cobbold, 1985), thimerosal (Fissore dan Robl, 1993), dan Ca2 +
ionofor (Hosseini et al., 2008; Meo et al., 2007; Santella
dan Dale, 2015; Van Blerkom et al., 2015).
Osilasi Ca2 + optimal terkait dengan aktivasi oosit yang optimal, yang
selanjutnya meningkatkan kualitas embrio (Ozil
et al., 2006; Tóth et al., 2006). Aktivasi listrik telah
dilaporkan sebagai metode yang efektif untuk meningkatkan pembelahan dan
perkembangan embrio setelah ICSI dalam oosit bovine (Hwang
et al., 2000). Demikian pula, aktivasi kimiawi oosit sapi
dengan menggunakan Ca2 + ionophore memiliki efek positif pada belahan dada
(Acar
dan Bastan, 2011).
Aktivasi oosit buatan (AOA) sebelumnya telah disarankan sebagai cara untuk
mengatasi masalah kegagalan pemupukan total (TFF) (Montag et al., 2012;
Vanden Meerschaut
et al., 2014), yang mempengaruhi sekitar 1-3% dari siklus ICSI
(Heindryckx et al., 2005; Liu et al., 1995; Mahutte dan Arici,
2003; Pabuccu et al., 2015). Kegagalan total pemupukan adalah
pada dasarnya kegagalan aktivasi oosit (Ebner et al., 2004;
Sousa dan Tesarik, 1994). Beberapa laporan telah menunjukkan perbaikan
pembuahan pada pasien dengan riwayat lengkap atau
kegagalan pemupukan parsial setelah menerapkan AOA yang berbeda
metode (Borges et al., 2009), seperti listrik (Baltaci et al.,
2010; Mansour et al., 2009), mekanik (Tesarik et al., 2002)
dan aktivasi kimia (Nakagawa dkk., 2001; Tejera dkk.,
2008; Kashir et al., 2010; Ebner et al., 2015).
Atas dasar temuan sebelumnya, kami melakukan novel
studi tentang penerapan AOA kimia menggunakan Ca2 + ionophore untuk
meningkatkan perkembangan embrio pada empat wanita dengan
riwayat penangkapan fertilisasi lengkap dan ketidakmampuan untuk transit
untuk pembelahan tahap selama uji coba ICSI sebelumnya.

Ehab Darwish, Yasmin Magdi. 2015. A preliminary report of successful

cleavage after calcium ionophore activation at ICSI in cases with previous
arrest at the pronuclear stage. Vol 31, Page 799–804. Reproductive
Healthcare Ltd.Elsevier Ltd.

pada embrio preimplantasi manusia, direkomendasikan untuk menggunakan

waktunya
pembelahan pertama sebagai penanda tambahan mereka
viabilitas dan faktor prognostik yang kuat untuk transfer lebih lanjut
hasil
Kelangsungan dan potensinya
tergantung pada kualitas embrio intrinsik dan sistem kultur
digunakan

Ma1gorzata Ochota*, Wojciech Niza_ nski. 2017. Time of early cleavage

affects the developmental potential of feline preimplantation embryos in
vitro Vol. 89 Page 26–31. Theriogenology.Elsevier Inc

Bahan kimia dibeli dari Sigma Chemical Co.

(Saint Louis, MO, USA) kecuali dinyatakan sebaliknya.
2.1. Klasifikasi saluran telur dan OF recovery
Saluran genital dari induk babi diperoleh di daerah setempat
rumah jagal dan diangkut ke laboratorium di atas es.
Tahap siklus estrus betina dinilai dalam
laboratorium, berdasarkan morfologi ovarium pada keduanya
ovarium dari setiap wanita. Saluran telur dari induk babi diklasifikasikan
sebagai folikel awal, folikel akhir, luteal awal, atau akhir
fase luteal, sesuai dengan kriteria yang ditentukan oleh Hafez
dan Hafez [33]. Kedua saluran telur itu berasal dari sama
saluran genital, diklasifikasikan sebagai fase folikuler akhir, digunakan.
Saluran dengan indung telur tidak cocok dengan kriteria ini,
polikistik, dan dari wanita hamil dibuang.
Setelah klasifikasi, saluran telur yang ditabur dengan cepat dicuci
sekali dengan larutan etanol 70% dan dua kali dengan
PBS Dulbecco dan dipindahkan ke cawan Petri di atas es dan
dibedah bebas dari jaringan di sekitarnya. Saluran telur memerah
dengan 500 mL PBS dimasukkan ke dalam ujung ampula
untuk mencuci lumen. Membuat ascendant manual
tekanan dari ampula ke tanah genting, cairan itu
pulih. Prosedur ini diulangi dalam 10 saluran.
Cairan yang sama pulih di saluran telur pertama digunakan kembali
cuci yang berikutnya. Flush saluran telur disentrifugasi
7000 g selama 10 menit pada suhu 4 C untuk menghilangkan kotoran seluler.
Kemudian, supernatan segera disimpan pada 20 C
sampai digunakan.
2.2. Pematangan in vitro
Ovarium dikumpulkan dari peripubertal yang dibantai
gilt dan diangkut ke laboratorium dalam waktu 2 jam di
0,9% NaCl pada 30 C. Kompleks oosit kumulus (COC) adalah
disedot dari folikel antral (3-6 mm) dengan
jarum pendek 18-gauge yang terhubung ke tabung Falcon
di bawah vakum terkendali (30 mm Hg). Lalu, COC adalah
pulih di bawah mikroskop stereo. COC yang belum menghasilkan dengan
massa sel kumulus padat dicuci tiga kali dalam
25-mM medium kultur jaringan buffer-Hepes 199
(TCM199) dengan garam Earle ditambah dengan 4-mg / mL
gentamicin (G1272) dan 1-mg / mL BSA (A9647) dan
dicuci sekali dalam media pematangan. Kelompok 50 COC
dipindahkan ke piring 4-sumur (Nunc Roskilde,
Denmark); masing-masing sumur mengandung 500 mL pematangan
sedang dan dikultur selama 44 jam pada 38,8 C dalam atmosfer 5% CO2 di
udara dengan kelembaban maksimum. Itu
media pematangan terdiri dari TCM199 dengan garam Earle
(M4530) ditambah dengan 10 ng / mL epidermal
faktor pertumbuhan (E4127), 400 ng / mL follicle-stimulating
hormon (PRIMUFOL, Rhône Mérieux, Lyon, Prancis),
570-mM cysteamine (M9768), dan 10% serum janin janin
(F2442; [34]).
2.3. Persiapan spermatozoa
Sedotan semen beku disiapkan dari kolam
tiga ejakulasi babi hutan putih besar [35]. Setelah mencair dalam
mandi air pada suhu 37 C selama 30 detik, sperma dari satu sedotan
dicuci dalam larutan pencairan Beltsville (Landata,
Perancis) dengan sentrifugasi pada 100 g selama 10 menit di kamar
suhu. Spermatozoa motil diperoleh dengan
sentrifugasi pelet pada Percoll (Pharmacia,
Uppsala, Swedia) gradien diskontinyu (2 mL 45% lebih
2 mL 90%) selama 30 menit pada 700 g. Sel dikumpulkan di
Bagian bawah fraksi 90% dicuci dalam fertilisasi
sedang dengan sentrifugasi pada 100 g selama 10 menit. Itu
pelet sperma itu kemudian diresuspensi untuk memberikan konsentrasi
dari 2 108 sel / mL.
2.4. Fertilisasi in vitro
Setelah periode pematangan, oosit digunduli oleh
vortexing 2,0 menit dalam 2 mL TCM199 hepes lalu
dicuci tiga kali dalam media yang sama dan sekali dalam
media pemupukan sebelum dipindahkan dalam kelompok
50 oosit menjadi lempeng 4-sumur. Setiap sumur mengandung 250 mL
media pemupukan. Media pemupukan terdiri dari medium buffer-Tris yang
dimodifikasi (1), dengan
113,1-mM NaCI, 3-mM KCl, 10-mM CaCl2, 20-mM Tris,
11-mM glukosa, 5-mM natrium piruvat, 1-mM kafein,
dan 0,1% BSA EFAF [34]. Aliquot dari suspensi sperma itu
ditambahkan ke setiap sumur pemupukan untuk mendapatkan konsentrasi akhir:
0,5, 1,5, atau 4,5 105 sel / mL. Pemupukan dulu
dilakukan pada 38,8 C, kelembaban 100% di atmosfer
5% CO2 di udara
Pengembangan in vitro
Pengembangan embrio terjadi dalam sintetis yang dimodifikasi
oviduct fluid (SOF) medium di bawah minyak mineral dalam atmosfer lembab 5%
CO2, 5% O2, dan 90% N2 pada 38,8 C
[36] Media SOF berisi 107,7-mM NaCI, 7,16-mM
KCl, 1,19-mM KH2PO4, 1,71-mM CaC12, 0,49-mM MgCl2,
25,07-mM NaHCO3, 3,3-mM Na laktat, 0,3-mM Na piruvat, 1-mM glutamin, 3%
esensial (B-6766) dan 1% asam amino tidak esensial (M-7145), dan 0,3%
fraksi BSA V
[34]. Setelah 20 jam pembuahan, sperma dikeluarkan oleh
vorteks lembut dari zigot diduga. Mereka dulu
dicuci tiga kali dalam TCM199 Hepes dan sekali dalam SOF
sedang sebelum dipindahkan dalam kelompok 20 ke dalam minyak
dilapis tetesan 25 mL media SOF, ditambah
dengan serum betis janin 10%. Pada Hari 8, semua blastokista yang diperluas
dipindahkan ke piring pencuci, dicuci ke
menghapus minyak mineral, diperbaiki, dan diwarnai dengan Hoechst ke
hitung jumlah sel mereka. Penghitungan sel dilakukan
di bawah mikroskop epifluoresensi.
2.6. Penilaian pemupukan
Setelah pembuahan, lima zigot diduga dari masing-masing kelompok
di setiap ulangan dikumpulkan secara acak dan ditempatkan pada a
meluncur, dikeringkan dengan udara, dan difiksasi dalam etanol absolut
selama 24 jam.
Mereka kemudian diwarnai dengan Hoechst 33342 (10 mg / mL dalam
2,3% natrium sitrat) dan divisualisasikan dengan epifluoresensi
mikroskop untuk analisis jumlah spermatozoa
terikat ke ZP. Kelompok lain dari 15 zigot yang diduga
per ulangan diperbaiki (asam alkohol-kloroform-asetat,
80:10:10; v / v), diwarnai dengan lacmoid 1% (b / v), dan
diperiksa pada 400 perbesaran untuk bukti sperma
penetrasi dan pembentukan pronuklear dalam fase
mikroskop kontras.
Desain eksperimental
Dalam percobaan 1 (Gbr. 1), efek inkubasi oosit
dengan porcine OF sebelum IVF atau penambahan OF selama IVF,
pada hasil IVF dan pengembangan in vitro (IVD), diselidiki. Setelah
pematangan in vitro (IVM), COC secara acak
dialokasikan ke salah satu dari tiga kelompok: (1) controldIVF dalam medium
Trisbuffered (TBM); (2) DARI 300 sebelum inkubasi
oosit dalam OF murni selama 30 menit, diikuti oleh tiga
Cuci di media TBM, kemudian transfer ke pemupukan
baik; dan (3) 10% OFdIVF dalam media TBM ditambahkan
dengan 10% DARI. Untuk setiap ulangan, sekitar 450 oosit
dialokasikan secara merata ke dalam salah satu dari tiga perawatan. Untuk
IVF, oosit dari setiap kelompok eksperimen dialokasikan
menjadi tiga sumur (sekitar 50 oosit per sumur) dan dikulturkan dengan 0,5,
1,5, atau 4,5 105 sel sperma / mL
(berjumlah sembilan kelompok) untuk jangka waktu 20 jam. Setelah IVF,
sampel dari 20 zigot dugaan dari masing-masing kelompok
diperbaiki dan diwarnai untuk analisis jumlah spermatozoa
terikat pada ZP, jumlah pronuklei per oosit, dan efisiensi IVF (persentase
monospermic dari total yang diinseminasi). Zigot dugaan yang tersisa adalah
dipindahkan ke IVD, di mana pembelahan embrio dan blastokista
formasi dievaluasi: pada Hari 2 dan 7 setelah fertilisasi, masing-masing.
Pada Hari 8, semua blastokista telah diperbaiki
menghitung jumlah sel mereka. Lima ulangan
dilakukan.
Dalam percobaan 2 (Gbr. 2), efek dari asosiasi
OF dengan heparin (10 mg / mL; Calbiochem 375 095) pada IVF
parameter dievaluasi. Setelah IVM, COC digunduli
dan secara acak dialokasikan ke salah satu dari empat perawatan
berdasarkan medium IVM TBM: (1) TBM þ 10% OF þ heparin
(n ¼ 150); (2) TBM þ 10% OF (n ¼ 136); (3) TBM þ heparin
(n ¼ 146), dan (4) TBM saja, kontrol (n ¼ 145). Coculture dengan
spermatozoa (4,5 105 sel / mL) dilakukan selama 20 jam. Zigot anggapan dari
masing-masing
kelompok diperbaiki dan diwarnai untuk analisis jumlah
spermatozoa terikat pada ZP, jumlah pronuklei per
efisiensi oosit, dan IVF (persentase monospermia
zigot dari total oosit diinseminasi). Parameter IVD
tidak dievaluasi dalam percobaan ini. Lima ulangan
dilakukan

Ribrio Ivan Tavares, and et al. 2016. Combination of oviduct fluid and
heparin to improve monospermic zygotes production during porcine in vitro
fertilization. Vol. 86. Page 495–502. Theriogenology. Elsevier Inc
Indikator baru, pembelahan awal di
tahap dua sel, telah disarankan untuk menilai kualitas embrio preimplantasi
manusia selama fertilisasi in vitro (IVF)
[4,5]. Pembelahan zigotik paling awal terjadi 20e27 jam setelahnya
inseminasi atau injeksi sperma intracytoplasmic (ICSI) [5e7];
karenanya, waktu yang disarankan untuk mengamati pembelahan dini adalah
25e27 jam [4,8]. Pada 24 dan 27 jam setelah inseminasi, 5% dan
38% dari zigot yang dibuahi menunjukkan pembelahan awal, masing-masing
[6,9]. Embrio pembelahan awal memiliki pembentukan blastokista yang lebih
tinggi
tingkat, morfologi superior, dan tingkat implantasi yang lebih tinggi
dibandingkan
dengan embrio tanpa pembelahan awal [4,10,11]. Namun, hubungan antara
karakteristik morfologi pembelahan awal pada tahap dua sel dan kualitas
embrio sebelum transfer.
menjamin diskusi lebih lanjut. Meski penilaian gelar
fragmentasi dan jumlah dan ukuran blastomer berguna dalam
menentukan kualitas embrio sebelum transfer pada Hari 3, the
kegunaan penilaian tersebut untuk menentukan hasil
embrio pembelahan awal hari ke 3 dengan morfologi yang berbeda
tetap tidak dikenal. Penilaian kualitas embrio Hari 3 dan
pembelahan dini adalah kriteria yang berguna untuk mengevaluasi embrio Hari
3
transfer. Untuk memilih embrio yang dapat dipindahkan, morfologisnya
karakteristik embrio pembelahan awal mungkin sama pentingnya dengan itu
dari Hari 2, 3, 4, atau 5 embrio. Misalnya, tingkat fragmentasi adalah
indikator utama kualitas embrio pada Hari 2e5 sebelumnya
transfer. Selanjutnya, pola fragmentasi tertentu terjadi
selama tahap satu atau dua sel, mengakibatkan hilangnya tertentu
protein standar dari blastomer [12], yang terkait
dengan apoptosis [13]. Dengan demikian, penilaian morfologis
karakteristik pembelahan awal pada tahap dua sel harus a
kriteria untuk prediksi kualitas embrio.
Evaluasi tunggal nomor sel dan morfologi pada Hari ke 3 dari
kultur tidak berkorelasi dengan tingkat kehamilan atau pembentukan
blastokista [7,8]. Penilaian penampilan belahan dada dini, Hari 2 dan
3 embrio morfologi, atau perkembangan tidak teratur adalah indikator utama
untuk memilih embrio untuk transfer pada Hari 3; namun demikian
protokol seleksi harus dipersingkat dan disederhanakan secara efisien
mengurangi kisaran embrio Hari 3 yang layak dan efisien yang dipilih
transfer. Dalam penelitian ini, dua faktor morfologi pembelahan awal
dan kualitas embrio Hari 3 dinilai sebelum transfer.
Studi ini menetapkan kriteria seleksi yang sederhana dan efisien untuk
Hari ketiga transfer embrio dan memperkirakan kualitas embrio yang optimal
dan hasil setelah transfer
Setelah inseminasi, perkembangan embrio termasuk
penampilan pronukleus embrionik (18e20 jam), tahap dua sel atau
pembelahan awal (26e27 jam), tahap empat sel (45e46 jam), dan
tahap delapan sel (69e70 jam) diamati. Atas dasar itu
morfologi pembelahan awal, embrio tahap dua sel diklasifikasikan
sebagai berikut: (1) ECA grade, embrio dengan dua blastomer berukuran sama
dan fragmentasi 10%; (2) kelas ECB, embrio dengan
dua blastomer berukuran tidak sama, lebih dari dua blastomer, atau
> 10% fragmentasi; dan (3) tidak ada kelas pembelahan dini (NEC); embrio
tanpa pembagian pada saat penilaian didefinisikan sebagai
NEC. Di kelas ECB, semua embrio dibagi lagi menjadi ECP
(> 10% fragmentasi), EC> 2 (> 2 blastomer), dan ECC (tidak sama
ukuran blastomer) sesuai dengan stadium dua selnya
morfologi (Gambar 1). Embrio hari 3 dengan 8 blastomer berukuran sama dan
fragmentasi 20% dianggap sudah lanjut atau belum
embrio yang hidup. Sebaliknya, embrio dengan <8 sama dengan atau
blastomer berukuran tidak sama atau fragmentasi> 20% dipertimbangkan
embrio yang buruk.
Penilaian hubungan antara kualitas embrio Hari 3 dan
morfologi pembelahan awal pada tahap dua sel
Chun-I Lee., and et al. 2016. Detection of early cleavage embryos improves
pregnancy and delivery rates of Day 3 embryo transfer during in vitro
fertilization. Vol 55 Page 558-562. Taiwanese Journal of Obstetrics &
Gynecology. Elsevier Taiwan LLC