LA UTILIZACIÓN DE HIERRO HEMO POR LEPTOSPIRA INTERROGANS REQUIERE UNA HEMOOXIGENASA Y

UNA FERREDOXINA DE TIPO PLASTÍDICO-NADP + REDUCTASA

Antecedentes: la hemooxigenasa cataliza la conversión de hemo en hierro, monóxido de carbono y biliverdina
empleando oxígeno y equivalentes reductores. Esta enzima es esencial para la utilización de hierro heme y
contribuye a la virulencia en Leptospira interrogans
Métodos: se realizó un análisis filogenético utilizando secuencias de hemoxigenasas de diferentes
organismos, incluidas las especies saprofitas y patógenas de Leptospira. L. interrogans hemo oxigenasa
(LepHO) fue clonado, sobreexpresado y purificado. Las propiedades estructurales y enzimáticas de LepHO
se analizaron mediante espectrofotometría UV-vis y RMN 1H. La actividad de degradación del hemo, la
liberación de hierro ferroso y la producción de biliverdina se estudiaron con diferentes parejas redox.
Resultados: Un tipo plastídico, de alta eficiencia ferredoxina-NADP + reductasa (LepFNR) proporciona los
electrones para el recambio de hemo por hemooxigenasa en L. interrogans. Esta reacción catalítica no
requiere una ferredoxina. Además, LepFNR conduce la degradación del hemo a la integridad produciendo
hierro libre y α-biliverdina como productos finales. La divergencia filogenética entre hemogenasas hemo de
especies saprofitas y patógenas apoya el papel funcional de esta enzima en la patogénesis de L. interrogans.
Conclusiones: el barrido de hemo-hierro por LepHO en L. interrogans solo requiere a LepFNR como socio
redox. Por lo tanto, informamos sobre un nuevo sustrato de ferredoxina-NADP + reductasas diferentes a la
ferredoxina y la flavodoxina, la única proteína reconocida en sustratos de esta flavoenzima hasta la fecha. Los
resultados presentados aquí descubren un paso fundamental de la degradación del hemo en L. interrogans.
Importancia general: nuestros hallazgos contribuyen a comprender la vía de utilización del hierro hemo en
Leptospira. Dado que el hierro es necesario para la supervivencia y la infectividad del patógeno, la vía de
hemedegradación puede ser relevante para aplicaciones terapéuticas.

1. Introducción
El hierro es un nutriente esencial para la mayoría de los organismos. Los microorganismos patógenos
requieren hierro hospedador para los procesos metabólicos que les permiten colonizar sus hospedadores y
causar enfermedades. Dado que el hierro libre no está disponible y el hemo representa la fuente más
abundante de hierro en los mamíferos, muchos patógenos han desarrollado diferentes mecanismos para
adquirir y utilizar esta molécula como fuente de hierro. Una familia de monooxigenasas conocidas como
hemogenasas (HO; EC 1.14.99.3) lleva a cabo la degradación del hemo y permite que los microbios utilicen
el hemo-hierro.HO, que emplea hemo como sustrato y un grupo protésico cataliza la conversión de hemo a
biliverdina IX, monóxido de carbono (CO) y hierro libre (Fe2 +) utilizando oxígeno y equivalentes
reductores.Las HO están presentes en una amplia gama de organismos que incluyen mamíferos, plantas
superiores, algas, cianobacterias, hongos y diversos microorganismos patógenos. Las HO desempeñan
funciones importantes en diferentes procesos fisiológicos como la homeostasis del hierro, la defensa contra
el estrés oxidativo y celular, la neurotransmisión por la generación de CO como una molécula mensajera
fisiológica y la biosíntesis de pigmentos fotoreceptivos en organismos fotosintéticos. En microorganismos
patógenos, la función principal de las HO se ha atribuido a la adquisición de hierro del hemo hospedador
durante la infección, aunque algunos de ellos se han identificado para proteger contra la toxicidad del hemo.
Varias estructuras de HO están disponibles. Las HO se clasifican como proteínas "todas alfa". Se pliegan en
dominios multihélicos compactos únicos que contienen dos repeticiones estructurales de motivo 3-helicoidal.
El hemo se encuentra entre dos hélices llamadas proximal y distal, y está coordinado por una cadena lateral
de His en el lado proximal y por una molécula de agua en el lado distal. La actividad de la hemoxigenasa de
plantas, cianobacterias y bacterias puede depender de la ferredoxina, ya que se ha sugerido que el sistema
NADPH / ferredoxina-NADP (H) reductasa / ferredoxina puede funcionar para suministrar electrones a estas
enzimas. En algunos casos, se ha propuesto el requisito de un segundo reductor (auxiliar), como el ascorbato
o el trolox. Sin embargo, se informó que la actividad catalítica de la pseudomonas aeruginosa hemo oxigenasa
requiere solo una ferredoxina-NADP + reductasa
Dado que el hierro es necesario para la supervivencia e infecciosidad de los patógenos, la absorción y
utilización del hierro es un objetivo atractivo para el desarrollo de fármacos antimicrobianos . En consecuencia,
la HO puede ser un objetivo potencial para los nuevos antimicrobianos que obstaculizan la utilización
bacteriana del hemo-hierro. Una anulación del gen de la hemooxigenasa en P. aeruginosa (pigA) muestra
defectos de crecimiento severos . Se han realizado observaciones similares con el patógeno Leptospira
interrogans . Un mutante que carece del gen de la hemooxigenasa (LB186) se ve afectado por el crecimiento
cuando la hemoglobina es la única fuente de hierro en el medio, lo que sugiere que la HO es esencial para la
utilización de heme-hierro en la espiroqueta. También se ha demostrado que L. interrogans HO contribuye
significativamente a la virulencia en el modelo de infección de hámster.
L. interrogans es una bacteria parasitaria que infecta a los humanos y causa la leptospirosis, también conocida
como enfermedad de Weil. En los últimos años, esta enfermedad zoonótica se ha convertido en un importante
problema de salud pública en gran parte del mundo en desarrollo. La leptospira también infecta otros
mamíferos, como ratas, vacas, caballos, cerdos y perros, y algunos animales salvajes que son huéspedes
reservorios de este patógeno. La leptospirosis se adquiere a través de abrasiones en la piel o membranas
mucosas a través del contacto con suelo, agua u orina contaminados. L. interrogans coloniza los tejidos del
huésped dando como resultado síndromes de enfermedades que van desde una enfermedad leve parecida a
la gripe hasta una enfermedad hemorrágica grave.
La reacción catalizada por la hemooxigenasa depende de la reducción de los equivalentes, ya que requiere
NADPH y una reductasa. Anteriormente, hemos propuesto que esta función crucial podría ser desempeñada
por la ferredoxina-NADP (H) reductasa (FNR; EC 1.18.1.2) en L. interrogans, como ya se observó para la
enzima FPR de P. aeruginosa. En este trabajo, estudiamos la hemooxigenasa de L. interrogans (LepHO). La
ubicación del gen LepHO y los marcos de lectura abiertos (ORF) cercanos en el genoma de la serovar Lai
56601 de L. interrogans indica que este locus participa en la adquisición y utilización del hemo y
probablemente en la virulencia. También realizamos un análisis filogenético para investigar cómo esta enzima
está relacionada con otras HO. Para inferir el papel metabólico de LepHO, estudiamos sus propiedades
funcionales y estructurales. Encontramos que la ferredoxina-NADP + reductasa de tipo plastídico es capaz de
soportar de manera eficiente la actividad catalítica de LepHO in vitro. Además, la reacción procede a la
finalización de la producción de biliverdina y hierro libre, sin la necesidad de una ferredoxina. Estos resultados
sugieren que la flavoenzima es el socio redox de L. interrogans hemo oxigenasa in vivo.
2. Materiales y métodos
2.1. Alineación de secuencias y filogenia.
La secuencia de aminoácidos HO de L. interrogans NP_714730.1 (GI: 24217247) se usó como secuencia de
consulta para realizar tBLASTn estándar a través de la proteína completa y la base de datos traducida NCBI
(Versión 195, abril de 2013). El análisis filogenético se realizó utilizando 107 secuencias. Después de la
alineación de secuencias utilizando ClustlX (2.0), las posiciones mal alineadas y las regiones divergentes de
la alineación se eliminaron utilizando las configuraciones más conservadoras del programa Gblocks [37]. Los
bloques de alineación múltiple extraídos se utilizaron para obtener un árbol mediante el método de inferencia
bayesiano utilizando el paquete MrBayes. Se utilizó un modelo preestablecido de Welan-Goldman de
sustitución de aminoácidos [39]. El método de Markov Chain Monte Carlo se ejecutó con las siguientes
configuraciones: 4 cadenas; temperatura 0,25; 4.000.000 generaciones, muestreando cada 200 generaciones;
y "burn-in" para descartar los primeros 5,000 árboles. Finalmente, se obtuvo un árbol de consenso (regla de
mayoría del 50%) y se graficó utilizando Dendroscope V 3.2.5
2.2. Construcción del vector de expresión LepHO.
El gen que codifica LepHO (LB186) se amplificó mediante PCR utilizando el ADN genómico de L. interrogans
serovar Lai 56601, proporcionado amablemente por el Dr. Xiao-Kui Guo del Departamento de Microbiología
de la Universidad Médica de Shanghai en Shanghai, China. Las secuencias de oligonucleótidos 5'-
cgcggatccatgagtttagcaactattttacg-3 'y 5'-cccaagcttttaaccttttccaagaacggaatc-3' se diseñaron para introducir
sitios de enzimas de restricción BamHI e HindIII en los extremos 5´ y 3´, respectivamente. El plásmido de
expresión se construyó insertando el producto de amplificación, previamente cortado con las enzimas
indicadas, en el vector pET-TEV restringido de manera similar, un vector pET28a modificado que contiene un
sitio de escisión de la proteasa del Virus del Grabado del Tabaco (TEV) entre la hexahistidina N-terminal (
His6) etiqueta y el sitio de clonación múltiple.
2.3. Expresión y purificación de proteínas.
El vector pET-TEV que alberga los genes de LepHO se transformó en E. coli BL21 (DE3) para la expresión
de proteínas. Una sola colonia se cultivó durante la noche en 10 ml de medio LB suplementado con kanamicina
(50 μg / ml); la suspensión celular se transfirió posteriormente a 1 L de LB-kanamicina media y se cultivó a 37
° C hasta que la OD600 alcanzó 0.7-0.8. La expresión de la proteína se indujo mediante la adición de isopropil
1-tiol-D-galactopiranosa (IPTG) a una concentración final de 0,5 mM, y el cultivo se mantuvo durante 16 horas
a 20 ° C con agitación suave. Las células de E. coli se recogieron por centrifugación y se rompieron por
sonicación en Tris-HCl 50 mM (pH 8), NaCl 100 mM, benzamidina 1 mM. El lisado se centrifugó y el
sobrenadante resultante se cargó en una columna de cromatografía de afinidad TALON-cobalto (Clonthech
Laboratories) previamente equilibrada con Tris-HCl 50 mM (pH 8), NaCl 100 mM. Después de una etapa de
lavado, la proteína recombinante se eluyó con el mismo tampón que contenía imidazol 150 mM. La etiqueta
His6 se eliminó de apo-LepHO mediante la adición de la proteasa TEV recombinante durante la diálisis, y las
proteínas se separaron adicionalmente mediante un posterior procedimiento de cromatografía de afinidad
TALON-cobalto. La proteasa TEV se obtuvo como se describe. La concentración de Apo-LepHO se determinó
utilizando el método del ácido bicinconínico suministrado en un kit de ensayo de proteínas Pierce BCA®
(Thermo Scientific). La proteína purificada se almacenó a -80 ° C hasta su uso. La ferredoxina-NADP +
reductasa (LepFNR) y la ferredoxina LB107 (LFd2) de L. interrogans se expresaron y purificaron como se
describe anteriormente [35]. Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante espectroscopia
utilizando el coeficiente de extinción publicado para LepFNR (ε459 nm = 9.5 mM − 1 cm − 1) o empleando el
método del ácido bicincinínico mencionado anteriormente, en el caso de LFd2.
2.4. Reconstitución del complejo de LepHO-hemo y afinidad de unión del hemo

El complejo LepHO-hemo se preparó agregando pequeños incrementos de hemina (Fluka, preparada en

NaOH 5 mM) al apo-LepHO purificado y siguiendo la relación de absorbancia óptica a 280/403 nm. Una vez
que se logró la saturación, se eliminó la hemina no unida por cromatografía de exclusión por tamaño utilizando
columnas Sephadex G50 y SuperdexTM 75 10/300 GL previamente equilibradas con Tris-HCl 50 mM (pH 8),
NaCl 100 mM. La incorporación de hemo a apo-LepHO se monitorizó espectrofotométricamente. Una vez que
se forma el complejo de hemo férrico, se obtiene un espectro característico con un pico de absorbancia de
Soret a 403 nm que es altamente distinguible del espectro de hemo libre (banda de Soret a 385nm). El ensayo
de unión de hemo a apo-LepHO se realizó mediante la adición de concentraciones crecientes de hemina (0,01
a 0,15 µM) mientras se mantenía la concentración de enzima a 0,13 µM en 1 ml de Tris-HCl 50 mM (pH 8),
NaCl 100 mM. Después de cada adición, se registró el espectro entre 300 y 800 nm, y se calculó la
absorbancia compleja a 403 nm. Se aplicó una deconvolución matemática de la siguiente manera: las
absorbancias de hemina libre y el complejo LepHO-heme a 403 nm son proporcionales a sus absorbancias
en 385 nm punto isosbestic multiplicado por un factor xey respectivamente (ecuaciones (1) y (2)) . Estos
valores se calcularon a partir de un conjunto de mediciones a diferentes concentraciones de hemina libre o
complejo de LepHO como x = 0,85 e y = 1,94.

3. Resultados
3.1. Localización del genoma, análisis de secuencia primaria y filogenia molecular de LepHO
Las ubicaciones del gen LepHO y los ORF cercanos en el genoma Lai 56601 serovar serovar de L. interrogans
[44] se muestran en la Fig. 1. La LepHO (LB186) está codificada en la cadena directa de una región entre la
posición ~ 176,600 y ~ 187,800 del cromosoma II . La superposición del extremo 3´ del gen LepHO es ORF
LB187, que codifica una proteína putativa similar a las de la superfamilia de transportadores facilitadores
principales. Estas proteínas constituyen uno de los grupos más grandes de transportadores de membrana que
se encuentran en muchas especies bacterianas . Los otros seis ORF en la región están codificados en la
cadena inversa (menos). ORF LB191 codifica una proteína de unión a hemo regulada por hierro conocida
como HbpA. Esta proteína funciona como un receptor dependiente de TonB responsable de mediar la
adquisición de moléculas que contienen hemo y se encontró solo en algunos serovares patógenos de
Leptospira . El ORF LB183 codifica para uno de los cuatro homólogos de FUR, proteínas reguladoras
responsables de modular la expresión de genes involucrados en la adquisición de hierro . En la misma región,
encontramos ORF LB181 que codifica una proteína de membrana putativa relacionada con la dolosilfosfato-
manosa-proteína-manostransferasa. Si bien se pensaba que la O-mannosilación estaba restringida a los
hongos, en los últimos años ha quedado claro que la actividad se conserva en todos los reinos y que en
bacterias puede contribuir a evadir los mecanismos de defensa del huésped infectado . LB190 codifica un
homólogo a las proteínas de la familia de unión al ADN YbaB / EbfC. Esta familia puede desempeñar un papel
en la recuperación de la replicación del ADN después del daño en el ADN, pero la función o funciones de
estas proteínas aún no se han determinado. Finalmente, el ORF LB192 está relacionado con la proteína
HmuY, una proteína de unión a hemo que recupera el hemo del huésped y luego lo envía a los transportadores
de membrana externa, el receptor dependiente de TonB . Claramente, LepHO se encuentra en un locus del
genoma que participa en la adquisición y utilización de hemo, que probablemente esté relacionado con la
infección y la persistencia del huésped.
Para buscar miembros de la familia HO, BLAST examinó las proteínas y las bases de datos traducidas
disponibles en NCBI. Usando la secuencia de aminoácidos de L. interrogans HO como consulta, las
secuencias se recuperaron y se seleccionaron manualmente (Tabla S1). Las secuencias se alinearon
utilizando ClustalX2 como se describe en los procedimientos experimentales, y los bloques relevantes se
extrajeron de la alineación de secuencias múltiples para la filogenia (Fig. S1). La secuencia de LepHO contiene
un His homólogo relevante para la coordinación del hemo-hierro en la posición 15, como se observa en
muchas HOs . Otros aminoácidos reportados como involucrados en las interacciones de hemoproteínas están
completamente conservados; estos incluyen Tyr 124, Gly 128 y 133, Lys 167 y Arg 171. La región rica en Gly
del residuo 127 a 134, que es importante para la entrada de sustrato (hemo) y la liberación de producto
(biliverdina), también se conserva totalmente en el LepHO ( Los números como en LepHO, los residuos
conservados se resaltan en rojo en la Fig. S1).
Se realizó una inferencia bayesiana de un árbol para las secuencias de 107 HO utilizando un método de
Monteov Chain Monte Carlo, con probabilidades bayesianas posteriores del 60% o más. Los resultados se
muestran en la Fig. 2 en forma de un árbol sin raíz. Nuestro análisis muestra claramente grupos bien definidos
de eucariotas y procariotas. Los principales grupos bacterianos se agruparon adecuadamente en linajes
monofiléticos. Las dos secuencias de Firmicutes incluidas en el análisis se agruparon juntas a distancia de
todas las demás secuencias. Otros Firmicutes fueron altamente divergentes y, por lo tanto, no se incluyeron
en el análisis. Del mismo modo, durante la inferencia de árboles, encontramos que las isoformas de las plantas
terrestres estaban bastante alejadas de todas las otras HO analizadas, como se observó anteriormente
[53,54]. Por lo tanto, no fue posible obtener convergencia en nuestra inferencia de árboles filogenéticos
cuando se incluyeron las secuencias de HO de plantas. En consecuencia, estas HOs fueron omitidas de
nuestro estudio. Como se descubrió anteriormente para otras proteínas de Leptospira [35], las espiroquetas
HO comparten un ancestro común con sus homólogos de las cianobacterias. Sin embargo, es evidente que
ambos grupos se diversificaron muy temprano. Curiosamente, los Eucariotas están más cerca de las
cianobacterias que de otras secuencias bacterianas, lo que sugiere un origen monofilético de un ancestro
único. Las HO de cianobacterias y eucariotas que contienen dos isoformas de HO se segregaron
diferencialmente. Las espiroquetas están todas incluidas en un grupo bien definido de un ancestro común.
Los saprófitos Leptospira biflexa y Leptospira meyeri están más estrechamente relacionados entre sí que con
Leptospira patógeno. Curiosamente, todas las secuencias de HO de saprófitos tienen una inserción de tres
residuos (Q86K87K88) no observada en otras HO. Todas las HO de Leptospira patógenas se agruparon en
un grupo estrechamente relacionado. Leptospira liceraseace, que ha sido definida como oportunista o
intermedia, se ubica aparte entre los saprófitos y los espiroquetos patógenos. Esta separación distintiva de
los diferentes ortólogos de Leptospira HO puede sugerir un posible papel funcional en la patogénesis.
3.2. Sobreexpresión y purificación de LepHO.
La sobreexpresión de LepHO en E. coli BL21 (DE3) causa una pigmentación de color verde brillante de las
células debido a la acumulación de biliverdina (datos no mostrados), como se ha observado en la
sobreexpresión de otras HO. La forma apo de LepHO se recuperó completamente de la fracción soluble del
lisado celular. La proteína se purificó utilizando cromatografía de afinidad con cobalto y luego se escindió de
la etiqueta His6 mediante digestión con una proteasa TEV recombinante. La apo-LepHO se obtuvo en formas
homogéneas juzgadas por una sola banda en SDS PAGE, que corresponde a ~ 26 kDa, un valor cercano a
la masa molecular predicha de la secuencia de aminoácidos (Fig. 3A). El análisis de espectrometría de masas
confirmó que el peso molecular de LepHO era de 26,3 kDa. Las purificaciones típicas produjeron ~ 80 mg de
proteína por litro de cultivo.
3.3. Reconstitución del complejo LepHO-hemo.
Las HO utilizan el hemo como sustrato y como grupo protésico, y pueden formar un complejo estable con el
hemo. Para averiguar si LepHO podría formar tal complejo, la apoproteína purificada se incubó con hemina y
se registró el espectro de absorción después de la eliminación de la hemina no unida por filtración en
Sephadex G50. El espectro de absorción electrónica del complejo LepHO-heme difiere del de la apo-LepHO
purificada (Fig. 3B). El complejo de hemo férrico proporciona el espectro característico de las oxigenasas del
hemo, con una banda de Soret a 403 nm y picos en los visibles a 500 y 630 nm, que son comparables con los
informados para los complejos bacterianos de HO-hemo. El coeficiente de extinción milimolar de LepHO a
403 nm se calculó en 111.13 mM − 1 cm − 1, un valor cercano a los reportados para otras HOs
La apo-LepHO purificada y su complejo hemo férrico se sometieron a cromatografía de permeación de gel en
una columna Superdex ™ 75. El monitoreo de la absorbancia a 280 nm (proteína) confirmó que ambas
muestras se eluyen principalmente como picos individuales correspondientes a 28 kDa, lo que indica que la
apoproteína y su complejo hemo son monoméricos (Fig. 3C). La incorporación de hemo a apo-LepHO se
determinó mediante espectrofotometría de absorción. La adición incremental de hemina a apo LepHO permite
la visualización del complejo estequiométrico como se informó para otras HO [57]. Debido a que los espectros
del hemecomplejo de LepHO y hemo se solapaban, era necesario descontrolar los datos como se detalla en
Materiales y métodos. La adición de hemina a una solución de apo-LepHO 0.13 μM reveló una relación
estequiométrica 1: 1 entre la proteína y el hemo (Fig. 4). A partir de estos datos, se estimó una Kd de 0.017 ±
0.002 μM, un valor inferior a los determinados previamente para todas las HO conocidas.
3.4. Caracterización espectroscópica RMN de LepHO.
Se ha demostrado que el espectro 1H NMR de hemooxidasa (HO-CN) inhibida por cianuro es una herramienta
diagnóstica de la orientación en el plano del hemo y, por lo tanto, de la regioselectividad de la oxidación meso-
carbonada. Las enzimas CN son casi idénticas y muestran solo una resonancia de metilo hemo (3 metilo, o
3Me) ca. 20 ppm en la parte del espectro de campo desplazado paramagnéticamente. En consecuencia, el
hecho de que el espectro 1H NMR de LepHO-CN exhibe solo la resonancia 3Me ca. 20 ppm indica que LepHO
oxida el hemo a α-biliverdina (Fig. 5A). La presencia de dos resonancias de metilo que se originan en el grupo
3-metilo en LepHO-CN (3Meand 3me) indica que el hemo se une en dos orientaciones que difieren por rotación
alrededor del eje α-γ-meso, como se ha observado con humanos y Corynebacterium difteriae HO [61,62]. La
producción de α-biliverdina por LepHO fue confirmada por el análisis de HPLC (Fig. 5B). El producto extraído
al completar la reacción de la hemooxigenasa mediada por LepFNR mostró un pico con un tiempo de retención
de 15,1 minutos correspondiente al isómero α de la biliverdina estándar.
3.5. Actividad degradante del hemo de LepHO
El ascorbato puede servir como donador de electrones en la degradación oxidativa del hemo por HO. Por lo
tanto, la actividad de degradación del hemo de LepHO se monitorizó mediante espectroscopia UV visible
después de la adición de ácido ascórbico 5 mM (datos no mostrados). A medida que avanzaba la reacción, el
pico de LepHO Soret a 403 nm disminuyó, y apareció una amplia banda de absorción centrada cerca de 680
nm, lo que indica que LepHO fue capaz de dividir el hemo para producir biliverdina. Como control, el mismo
experimento en ausencia de reductor no mostró ningún cambio espectral. Se cree que las HO
cianobacterianas y eubacterianas son dependientes de la desintoxicación. Sin embargo, se afirmó que la
actividad de HO en extractos celulares que contienen ferredoxina reducida también requiere la presencia de
un segundo reductor, como trolox o ascorbato. De hecho, en ausencia de tales agentes reductores auxiliares,
la actividad de la HO es muy lenta o se detiene en la etapa del hemiferroso hemo. Más recientemente, se ha
observado que en P. aeruginosa una ferredoxina reductasa dependiente de NADP + apoya eficazmente la
actividad catalítica de HO in vitro, sin la necesidad de una ferredoxina mediadora [30]. En nuestro caso, la
incubación de LepHO con LepFNR y NADPH resultó en una disminución de la intensidad de la banda Soret,
con un cambio concomitante a 410 nm y la aparición de dos picos con la máxima en 538 y 575 nm (Fig. 6A).
Estos cambios espectrales son consistentes con la formación de un complejo de dioxiheme ferroso [Heme
(Fe2 +) - O2] como se ha observado anteriormente.
La Conversión de este último a biliverdina es evidente en el decaimiento dependiente del tiempo de los picos
de 538 y 575 nm y el crecimiento de una banda ancha a 680 nm. Para establecer que la biliverdina estaba
presente en la mezcla de reacción, se realizó un análisis de modo de ion positivo de espectrometría de masas.
Los pigmentos extraídos en la reacción de LepHO mostraron un solo pico de alta abundancia con una relación
de masa a carga de (1+) 583.25. Además, se predijo que la fórmula química de la molécula era
[C33H35N4O6]. Estos datos fueron idénticos al ión positivo del estándar de biliverdina auténtico. Tomados en
conjunto, los resultados obtenidos indican que LepFNR apoya la oxidación del hemo catalizada por LepHO a
biliverdina y hierro libre. Por el contrario, la liberación de hierro y biliverdina libres en el sistema FPR / HO de
P. aeruginosa requiere la adición de ácido o un agente quelante como la desferroxiamina. Para caracterizar
mejor la reacción de LepFNR / LepHO, las mediciones de actividad se realizaron utilizando LepFNR 0,25 μM
y concentraciones crecientes de LepHO (0.7–11.5 μM), controlando la disminución de la absorbancia a 403
nm. Debido a que la disminución de la intensidad de la banda de Soret es el resultado de varias reacciones
en el proceso de degradación del hemo, se estimaron las constantes de Michaelis. Bajo las condiciones
mencionadas anteriormente, un valor de aplicación Vmax de 0.177 ± 0.007 μmol LepHO redujo − 1 mg
LepFNR − 1 con una aplicación Km para LepHO de 1.77 ± 0.21 μM.Se obtuvieron resultados. Para investigar
la liberación de hierro ferroso mediante el sistema NADPH / LepFNR / LepHO La formación de un complejo
de hierro-ferrozina fue supervisada. Las reacciones se realizaron como se describió anteriormente, excepto
que se añadió ferrozina 250 µM, un quelante de hierro ferroso, al medio de reacción, y se siguieron los cambios
espectrales durante 45 min. Como control, se realizó la misma reacción sin LepFNR. Los resultados de estos
experimentos mostraron que la adición de 0.5 μM de LepFNR a la mezcla de reacción produjo la desaparición
típica de la banda Soret a 403 nm y la formación simultánea de un pico a 562 nm (Fig. 6B), demostrando que
bajo estas condiciones puede liberarse LepHO hierro heme. La producción de 0,75 moles de hierro ferroso
por mol de hemo después de 45 minutos de reacción se determinó utilizando el coeficiente de extinción del
complejo hierro-ferrozina (27,9 mM − 1 cm-1) (Fig. 7C).
La actividad de degradación de hemo de LepHO también se ensayó con el sistema L. interrogans FNR / Fd.
L. interrogans contiene dos ferredoxinas diferentes pero solo una de ellas, una 2 [4Fe-4S] Fd (LFd2), puede
intercambiar electrones con LepFNR [35]. Las mediciones iniciales con LepFNR 0,5 μM mostraron una tasa
detectable de aumento de la degradación del hemo por LepHO cuando se agregó LFd2 1 μM (Fig. 7A). Aunque
estos resultados parecen sugerir la participación de LFd2 y LepFNR en la transmisión de electrones de
NADPH a LepHO, la dependencia de LepFNR y la concentración de LFd2 en la degradación del hemo se
analizó en diferentes proporciones de LepFNR / LFd2. Los resultados de estos experimentos mostraron que
cuando la concentración molar de LepFNR es equivalente a la del sistema LepFNR / LFd2, la tasa de
degradación del hemo por LepHO es similar (Fig. 7A). Lo mismo se observó cuando la reacción se monitorizó
siguiendo la formación de biliverdina (Fig. 7B). El aumento de la concentración de LepFNR en el medio de
reacción superó el efecto causado por la adición de LFd2 (compare los triángulos invertidos de relleno, que
representan la condición LepFNR de 1.5 μM, con cuadrados abiertos correspondientes a 1 μMLepFNR / 0.5
μMLFd2, inFig. 7). Además, cuando se analizaron varias concentraciones de LepFNR y LepFNR / LFd2, se
obtuvieron diferentes tasas de conversión de hemo / Fe2 +. Sin embargo, las cantidades finales de hierro
ferroso producidas fueron las mismas en todos los casos (Fig. 7C). Estos hallazgos sugieren que LepFNR
apoya eficazmente la actividad catalítica de LepHO in vitro, sin la necesidad de una ferredoxina, lo que indica
que esta flavoenzima es el socio redox de LepHO in vivo.
4. Discusión

La adquisición de hierro por bacterias patógenas es un paso crítico en el proceso de infección y un mecanismo
central para la colonización del huésped. Esto crea una confrontación entre los mecanismos de defensa de
los vertebrados destinados a secuestrar el hierro disponible y las estrategias de patógenos para eliminar el
metal. Estos incluyen la secreción de moléculas específicas, la participación de transportadores de membrana,
sensores y reguladores, y la participación de los sistemas metabólicos para la extracción de hierro de las
biomoléculas. Una de las fuentes más importantes de hierro en los vertebrados está unida a proteínas como
la hemoglobina. o mioglobina. Se ha informado que la HO en Leptospira es esencial para la utilización del
heme-hierro del huésped y para la virulencia. La reacción de degradación del hemo catalizada por HO requiere
un sistema redox eficiente para proporcionar los electrones necesarios. Por lo tanto, los principales objetivos
de este trabajo fueron caracterizar bioquímicamente la LepHO, analizar en profundidad la actividad catalítica
de la degradación del hemo y dilucidar la proteína asociada que proporciona los equivalentes reductores
necesarios.
4.1. La filogenia indica que tanto LepHO como LepFNR llegaron de un ancestro común

A partir de nuestro análisis filogenético, llegamos a la conclusión de que se observan divergencias importantes
entre diferentes HO, en contraste con informes anteriores. Las HO bacterianas se agrupan claramente de
acuerdo con su filo, y las enzimas cianobacterianas están estrechamente relacionadas con las HO eucariotas,
como se informó anteriormente. El HO de Leptospira parece haberse separado de sus antepasados en un
evento antiguo. Anteriormente, estudiamos las relaciones filogenéticas de LepFNR y también observamos en
este caso que la reductasa puede haber llegado de un antiguo ancestro común. Estas observaciones son
coherentes con la hipótesis de que los cambios evolutivos importantes dentro de los procariotas pueden haber
ocurrido de manera direccional, siendo las espiroquetas más antiguas que las proteobacterias. El hecho de
que la HO se agrupara de manera diferencial entre las leptospiras patógenas y no patógenas podría
interpretarse como evidencia de alguna especialización de la función. Probablemente, ambas proteínas
(LepHO y LepFNR) han mejorado su relación funcional y su papel en la patogénesis en paralelo. Se observa
una similitud evidente cuando se compararon las filogenias de LepHO y LepFNR (datos no mostrados).
Anteriormente, hemos sugerido que LepFNR puede haber llegado desde un evento de transferencia de genes
lateral. Sin embargo, la evidencia proporcionada aquí indica que tanto LepFNR como LepHO ya han estado
presentes en el proto espiroqueta, de donde provienen todas las leptospiras.
4.2. LepHO muestra características distintivas no observadas previamente en otras HOs
Con el objetivo de estudiar las propiedades estructurales y funcionales de L. interrogans HO, primero
analizamos la interacción entre la enzima y su grupo protésico / sustrato hemo. Anteriormente, mediante la
titulación de la hemina en 10 μML, se estimó una Kd de 4 μM para el proceso de unión. Observamos que la
reducción de las concentraciones de LepHO y heminfinales durante los experimentos de titulación permite
obtener datos que se ajustan mejor a una curva hiperbólica. Realizamos simulaciones de condiciones de
equilibrio que establecieron que 0,13 µMapo-LepHO era la concentración de proteína más adecuada para
lograr condiciones de saturación y medibles espectrofotométricamente. Usando esta configuración,
estimamos una Kd de 17 nM, significativamente más baja que todos los demás valores de Kd informados. Por
lo tanto, es posible que si muchas de las constantes de disociación publicadas previamente para HO se
recalculan usando condiciones más apropiadas, se obtengan valores más bajos de las mismas.
Recientemente, Koga et al. a través del desarrollo de un sensor de hemo que utiliza hemo oxigenasa marcada
con fluorescencia, se estimó una Kd de ~ 1.5 nM para el complejo HO-1-hemo de rata. En este caso, los
autores emplearon una concentración de proteína de 50 nM [70]. En un estudio previo que utilizó la titulación
de absorbancia de HO-1 de tipo salvaje 3 µM, determinaron una Kd de 0,35 µM [71]. La diferencia de los
valores de Kd entre la titulación de fluorescencia y la titulación de absorción se atribuyó a los cambios en las
concentraciones de proteína y hemina utilizados en los dos experimentos. Sin embargo, un posible efecto
introducido por el etiquetado fluorescente no puede ser ignorado.
Se han propuesto varias fuentes diferentes de equivalentes reductores para la degradación del hemo
catalizada por las HO. La enzima de los mamíferos utiliza la reductasa del citocromo P450 de NADPH como
su única fuente de electrones [26,72], mientras que las HO vegetales, bacterianas, algas y cianobacterianas
utilizan ferredoxina reducida. Se cree que estas HO dependientes de ferredoxina reciben electrones del
NADPH a través de la ferredoxina reductasa y la ferredoxina. Sin embargo, se sugirió que además de la
ferredoxina, es necesario un donante de electrones auxiliar para llevar a cabo la actividad catalítica de las HO.
Un tercer compañero redox, la putidaredoxina, se ha identificado a partir de estudios in vitro de la hemogenasa
Corynebacterium diphtherae heme. Más recientemente, Rivera et al. demostró que en P. aeruginosa una
ferredoxina reductasa dependiente de NADP + entrega directamente los electrones a la HO para la escisión
del hemo, sin la necesidad de una ferredoxina mediadora. En este trabajo, encontramos que L. interrogans
FNR es el compañero redox de LepHO y la degradación del hemo ocurre de manera eficiente en ausencia de
un donante de electrones auxiliar (ascorbato o trolox). Además, observamos que la división in vitro del hemo
se convierte en hierro y α-biliverdina como productos finales de la reacción LepFNR-LepHO; la liberación de
Fe2 + no requiere la adición de ácido o un agente quelante, como la desferroxiamina, como se informó
anteriormente para el sistema de P. aeruginosa FPR-HO y otras HO. Nuestros hallazgos indican que LepFNR
es capaz de conducir la degradación del hemo a la integridad. En consecuencia, se puede proponer que el
sistema LepFNR / LepHO sea suficiente para sostener la liberación de hemo-hierro en Leptospira.

5. Conclusiones
En este trabajo, hemos demostrado que la HO de Leptospira interrogans es capaz de unirse y catalizar
eficazmente la escisión del hemo a hierro libre y biliverdina, utilizando LepFNR como única fuente de
electrones. Debido a la evidencia existente de la participación de LepHO en la patogénesis, la comprensión
de este paso metabólico puede ser relevante para el desarrollo de futuras intervenciones terapéuticas. En la
actualidad, los únicos sustratos proteicos reconocidos de los FNR son ferredoxina y flavodoxina. Nuestros
resultados, además de los que ya se han publicado para la P. aeruginosa HO, agregan un nuevo argumento
a esta lista, alentando la búsqueda de nuevos socios redox de FNR. Además, este hallazgo puede extender
el rango de posibles vías metabólicas donde podría estar implicada la flavoenzima