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2. MÉTODO EXPERIMENTAL
 58

Introdução

Nesta parte do trabalho, serão apresentadas as matérias primas e suas características

químicas, morfológicas e físicas. Para desenvolvimento deste projeto de pesquisa;
utilizou-se o método via úmida, pela reação de dissolução-precipitação, envolvendo fase
sólida/líquida de CaO e ácido fosfórico, numa razão molar Ca/P = 1,6 para obtenção da
fase fosfato tricálcio-beta e a razão Ca/P = 1,7 molar para a fase hidroxiapatita. Foram
elaboradas composições bifásicas HA/TCP- 60/40% em volume das fases na forma
nano/nano, micro/micro, micro/nano e nano/micro. Para obtenção das diferentes
composições bifásicas, utilizou-se o processo de fragmentação mecânica em moinho
atritor de alta energia com tempo de mistura de 2h.
Todos os pós biocerâmicos obtidos foram submetidos aos estudos de caracterização
morfológica, térmica, físico-química, microestrutural e nanoestrutural.

2.1 MATÉRIAS-PRIMAS UTILIZADAS

2.1.1. Carbonato de Cálcio

O carbonato de cálcio (CaCO3) foi fornecido pelo laboratório CINÉTICA

Reagentes e Soluções, apresentando 99% de pureza, com número de lote 14.918.
O difratograma de Raios X, ilustrado pela figura 32, mostra os principais picos
de difração do carbonato de cálcio, observando o pico de maior intensidade para o plano
principal de difração [104], indicando a fase calcita.
 59

2000 [1 0 4]

CaCO3

1500

Intensidade
1000

500

0
10 20 30 40 50 60 70 80
Ângulo (2 theta)

Figura 32. Espectro de Raios X do CaCO3 (picos/segundo/em função de 2θ).

A morfologia do carbonato de cálcio apresenta-se sob a forma de aglomerados

como ilustrado pela figura 33. Observa-se uma morfologia típica do carbonato de cálcio
com forma semi-hidratada, indicando haver certa quantidade de água absorvida sobre a
superfície das partículas, fenômeno típico para o caso dos carbonatos de cálcio quando
expostos ao meio ambiente. [KARVAT, 2005].

Figura 33. Morfologia do pó de carbonato de cálcio (MEV).

 60

2.1.2. Óxido de Cálcio

A morfologia do pó de óxido de cálcio, apresentou-se sob a forma de finas

partículas aglomeradas, com tamanho inferiores a 500nm, condição favorável para uma
boa dissolução do CaO durante o processo de síntese de fosfato de cálcio hidratados
pelo processo via úmida. A figura 34 ilustra a morfologia típica do pó de CaO, obtida
pelo processo de calcinação de carbonatos de cálcio, caso já observado por outros
autores [SOARES, 2006; DELIMA, 2008; SANTOS, 2009; SOUZA, 2009].

Figura 34. Morfologia do óxido de cálcio obtido.

O difratograma de raios X obtido sobre o pó de CaO, mostrou os picos bem

definidos da fase óxido de cálcio (ficha n°. 75-0264), apresentando plano principal de
difração [2 0 0] (Figura 35).
 61

2000 [200]
CaO

1500

Intensidade
1000

500

0
10 20 30 40 50 60 70 80
Ângulo (2 theta)

Figura 35. Difratograma de raios X obtido sobre o pó de óxido de cálcio.

A figura 36 ilustra o espectrograma de FTIR obtido sobre o pó de óxido de

cálcio revelou à banda (3.642) indicando à presença de pontes de hidrogênio causada
pela hidratação superficial das partículas.

100

80
% Transmitância

60

40

20

3642,12
0
4000 3800 3600 3400 3200 3000
cm -1

Figura 36. Mostrando o espectrograma obtido pela técnica FTIR do óxido de cálcio
(CaO).

2.1.3. Pentóxido de Fósforo

O pó de óxido de fósforo (P2O5) utilizado foi fornecido pelo laboratório Vetec,

apresentando pureza de 98%, com lote número 0801335.
 62

2.1.4. Água Destilada

Utilizou-se água destilada obtida de um destilador da marca MILLIPORE

modelo- MILLI-DI 1M, que se encontra no laboratório de polímeros da UDESC.

2.1.5. Solução Ácida de Pentóxido de Fósforo

A solução ácida foi preparada, utilizando-se água destilada e pentóxido de

fósforo (P2O5) na concentração molar necessário para produção das composições na
razão Ca/P = 1,6molar, para obtenção do fosfato de cálcio- e Ca/P = 1,7molar para
obtenção da hidroxiapatita. Para elaboração da solução reagente, primeiramente se
introduziu o pó de pentóxido de fósforo dentro de um balão volumétrico de 500mL,
posteriormente adicionou-se água destilada de forma lenta havendo a mistura através de
uma agitação manual.

2.2. PROCESSO DE SÍNTESE DO PÓ NANOESTRUTURADO DE

FOSFATO DE CÁLCIO

Para sintetização do pó biocerâmico de fosfato de cálcio, utilizou-se o método

via úmida, pela reação de dissolução-precipitação, envolvendo fase sólida/líquida de
CaO e ácido fosfórico, numa razão Ca/P = 1,6molar para obtenção da fase fosfato de
tricálcio, e Ca/P = 1,7molar para obtenção da fase hidroxiapatita. A figura 37 mostra o
fluxograma representativo do processo de síntese e caracterização dos pós
nanoestruturados de HA e TCP-.
Para síntese das composições utilizou-se 28,04g de pó de óxido de cálcio (CaO),
este foi adicionado lentamente dentro de um Becker contendo 500mL de água destilada
sob agitação mecânica de aproximadamente 240rpm. Depois da incorporação o pó de
óxido de cálcio na solução aquosa, mantendo-se o processo de agitação mecânica.
Após duas horas de agitação mecânica e de medidas do valor do pH da
suspensão coloidal a cada 15min., adicionou-se gota a gota a solução de ácido fosfórico
com uma taxa de gotejamento de aproximadamente 2ml/min, mantendo-se as medidas
do valor do pH da suspensão coloidal a cada 15min, conforme a metodologia já
empregada por [GILAPA, 2001].
 63

A partir do momento que se iniciou a incorporação da solução ácida, a suspensão

coloidal, observou-se a formação de precipitados de fosfato de cálcio hidratados. O
processo de agitação mecânica da suspensão coloidal e as medidas de pH foram mantida
durante todo o processo de síntese. Depois de 24h de agitação mecânica da suspensão
coloidal, o colóide formado por precipitados de fosfato de cálcio hidratado foi
introduzido dentro de um balão tipo pêra e acoplado a um evaporador rotativo, para
eliminação do solvente.

CaCO3

Calcinação 900°C/2h

CaO + H2O

Agitação
Mecânica - 2h

Adição de Adição de Solução

Solução H3PO4 H3PO4
Ca/P = 1,6 molar Ca/P = 1,7 molar

Monitoramento
Agitação Agitação
de pH
Mecânica por 22h Mecânica por 22h

Secagem Moagem Secagem Moagem

Peneiramento Peneiramento

Calcinação 900°C/2h Calcinação 900°C/2h

Obtenção de Obtenção de
TCP- HA
Raios-X
FTIR
MEV
DSC
TG

Figura 37. Fluxograma representativo do processo de síntese e caracterização dos

pós e biomateriais.
 64

2.2.1. Secagem do colóide

O balão tipo pêra contendo a suspensão coloidal, foi acoplado a um evaporador

rotativo, o balão foi parcialmente imerso em um banho de óleo de silicone a temperatura
inferior a 70oC e submetido à rotação a 8rpm. Decorrido 6h obteve-se o pó
nanoestruturado de fosfato de cálcio hidratado, que se apresentou sob a forma de
aglomerados, com coloração branca. A figura 38 representa um esquema do evaporador
rotativo utilizado para secagem dos pós biocerâmicos.

Figura 38. Esquema do evaporador rotativo utilizado para secagem do pó

biocerâmico.

2.2.2. Moagem e peneiramento

O pó biocerâmico nanoestruturado recuperado do balão tipo pêra, passou pelo

processo de moagem e peneiramento na malha # 100m ABNT, através de
almofariz/pistilo.
 65

2.2.3. Calcinação

O pó nanoestruturado de fosfato de cálcio, recuperado do processo de moagem e

peneiramento na malha 100µm ABNT foi submetido à calcinação a temperatura de
900°C/2h, dentro da câmera de um forno tipo mufla, marca HERAEUS - Instruments,
com uma taxa de aquecimento de 100C/min. A calcinação teve como objetivo a
eliminação do material orgânico remanescente do processo de síntese e a obtenção da
fase hidroxiapatita nanométrica, para a composição na razão Ca/P= 1,67molar e a fase
fosfato tricálcio-, para a composição Ca/P= 1,6molar.

2.2.4. Tratamento Térmico

Realizou-se tratamento térmico a temperatura de 1100ºC/2h, sobre os pós de

hidroxiapatita, fosfato de cálcio- e para as composições bifásicas. Para realização do
tratamento térmico utilizou-se um forno tipo mufla da LINN HIGH THERM
HOCHTEMPERATURFEN HIGH TEMPERATURE FURNACE HT 1700/120. A taxa
de aquecimento da câmera do forno foi de 10ºC/min, sob uma atmosfera oxidante, ou
seja, atmosfera natural. O objetivo do tratamento foi o de se obter pós com morfologia
microestruturada.

2.2.5. Elaboração das Composições Bifásicas

Existem diversos compostos de fosfatos de cálcio, pertencentes à família das

apatitas, dentre estes se destacam a hidroxiapatita (HA), estequiométrica
Ca10(PO4)6(OH)2 e o fosfato tricálcio- na composição Ca3(PO4)2, isto se deve por estas
composições apresentarem semelhança mineralógica com as da estrutura dos tecidos
ossos e dentes. As biocerâmicas bifásicas de HA/TCP-, vem se apresentando
promissor como elemento matricial nos processos de reconstituição e formação de
tecidos ósseos, por apresentarem boas características de biocompatíbilidade,
bioatividade, facilidade de dissolução de íons Ca++ e P para o meio biológico e pela
adsorção destes elementos na formação de tecido ósseo. Neste trabalho foram
elaboradas quatro composições bifásicas de HA/TCP- 60/40% em volume. Sendo que
 66

as composições foram elaboradas com diferentes características morfológicas, conforme

apresentado na tabela 11.

Tabela 11. Mostrando as características das composições bifásicas HA/TCP-.

Morfologia e fase Morfologia e fase Morfologia dos Nomeclatura
HA TCP- Bifásicos numa relação dos Bifásicos
(60%/40%)
HA nanoestruturada TCP-nanoestruturado HAnano/TCP-nano Bifásico 1 (BCP1)
HA microestruturada TCP-microestruturado HAmicro/TCP-micro Bifásico 2 (BCP2)
HA nanoestruturada TCP-microestruturado HAnano/TCP-micro Bifásico 3 (BCP3)
HA microestruturada TCP-nanoestruturado HAmicro/TCP-nano Bifásico 4 (BCP4)

Para obtenção das composições bifásicas, utilizou-se o método de fragmentação

mecânica por moinho atritor de alta energia marca NETZSCH, com ajuda de esferas de
zircônia com diâmetro de 2,0mm e álcool etílico. O processo de mistura das fases
ocorreu com uma concentração em volume sólido/liquido de 50%. A mistura das fases
hidroxiapatita/fosfato tricálcio-, foram realizadas em moinho atritor por 1h com uma
rotação da haste do atritor de 540rpm.
O material recuperado do moinho atritor foi seco em evaporador rotativo,
conforme processo já descrito anteriormente, para secagem dos pós obtidos da síntese.
Para produção do biomaterial na forma de grânulos utilizou-se o processo de
peneiramento na malha ABNT de 500µm e 200mm, obtendo-se grânulos com tamanho
entre 500m > d > 200m conforme se observa na figura 39.

Figura 39. Grânulo de cerâmica nanoestruturada.

 67

A figura 40 apresenta o fluxograma geral de elaboração dos bifásicos; BCP1,

BCP2, BCP3 e BCP4.

TCP- HA
nano nano

Trat. Térm. Trat. Térm.

1100°C/2h. Moinho Atritor 1100°C/2h.
Obtenção de Obtenção de Bifásico Obtenção de
TCP- micro 60%HA nano/40%TCP- nano HA micro
(BCP1)

Tratamento Térmico 1100°C/2h.

Obtenção de Bifásico
60%HA micro/40%TCP- micro
(BCP2)

Moinho Atritor
Obtenção de Bifásico
60%HA nano/ Moinho Atritor.
40%TCP- micro Obtenção de Bifásico
(BCP 3)
60%HA nano/
40%TCP- micro
(BCP4)

Figura 40. Fluxograma representativo do processo de elaboração das composições

bifásicas.
 68

2.3. CARACTERIZAÇÃO

Os estudos de caracterização foram realizados, sobre as diferentes composições

de pós nanoestruturados (Ca/P = 1,6) e (Ca/P =1,7), obtidos do processo de síntese, e
sobre os bifásicos elaborados numa relação de 60%HA e 40%TCP- Para realização
deste trabalho utilizaram-se diferentes técnicas caracterização: difratometria de raios X
(DRX), calorimetria exploratória diferencial (DSC), dilatometria, infravermelho por
transformada de Fourier (FTIR), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e estudos
preliminares in vivo.

2.3.1. Caracterização Física

2.3.1.1. Análise por difração de raios X.

A técnica de difratometria de raios X foi empregada neste trabalho com objetivo

de identificação das fases presentes no pó obtido após calcinação a 900°C/2h, e após
tratamento térmico a 1100ºC/2h. Assim como também para identificação das fases
presentes nos bifásicos com estrutura micro e nanoestruturada. A difratometria de raios
X serviu de apoio para caracterização mineralógica, sendo o equipamento SHIMADZU
modelo XRD_6000, com anticatodo tudo de cobre, o utilizado para obtenção dos
difratogramas. Utilizou-se uma tensão de 40 kv, intensidade de corrente de 30mA e
intervalo angular de varredura de 5° a 80°, com velocidade do goniômetro de 2º/min em
função de 2θ para todas as amostras recolhidas durante o processo.

2.3.1.2. Infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)

Os estudos de caracterização utilizando a técnica de FTIR foram realizados em

um equipamento Perkin Elmer Spectrum 100 com refletância atenuada. O ensaio foi
conduzido no intervalo de 4000 a 520 cm-1 com precisão de 4,00 cm-1 para os pós
obtidos da secagem em evaporador rotativo, calcinados, tratados termicamente e para os
quatro bifásicos.
 69

2.3.2. Caracterização Térmica

2.3.2.1. Análise por TG e DSC

O estudo do comportamento térmico para as composições molar de 1,6 e 1,7 do

fosfato de cálcio, e para os bifásicos de hidroxiapatita e fosfato tricálcio- foi realizado
pelo método de calorimetria exploratória diferencial (DSC) e termogravimétrica (TG).
Foram realizados em um equipamento da marca NETZSCH modelo Júpiter STA 449 C,
com sensibilidade de 1,00000 µV/mW. Os ensaios foram realizados utilizando-se
aproximadamente 23mg de pó para cada ensaio. As condições de ensaio para estes
métodos de DSC e TG foram às seguintes: velocidade de aquecimento das amostras de
10ºC/min até a temperatura de 1400ºC, e atmosfera inerte de gás nitrogênio com fluxo
de 70ml/min.

2.3.3. Caracterização Morfológica Microestrutural e Nanoestrutural

2.3.3.1 Preparação das Amostras

Foi utilizada a técnica de microscopia eletrônica de varredura, através do sistema

de elétrons secundários (SE), para identificação morfológica dos pós nanoestruturados
obtidos da síntese, dos pós submetidos ao tratamentos térmicos e dos bifásicos. As
amostras foram preparadas cuidadosamente, utilizou-se um porta amostra na forma de
disco em liga de alumínio com superfície lisa, uma fita de carbono dupla face foi fixada
na superfície lisa do disco, onde foi realizada a deposição da amostra em forma de pó,
sendo esta quantidade de pó depositada muito pequena, com o intuito de evitar os
efeitos de carga gerados pelo feixe eletrônico durante as observações. Para evitar os
efeitos de carga dentro da câmara do microscópio, todas as amostras forma submetidas
ao processo de metalização por um sistema sputering, com deposição de um filme de
ouro sobre a superfície do pó cerâmico. Para realização desta deposição utilizou-se um
metalizador marca Bal-Tec modelo SCD 050 Sputter Coater, sendo os parâmetros de
deposição iônica estabelecidos da seguinte forma, temperatura na câmara de
 70

metalização de 23°C, corrente de 40mA, tensão de 2KV e tempo de deposição de 120

segundos, fornecendo um filme de ouro na superfície das partículas da ordem de 32nm.

2.3.3.2. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

A caracterização morfológica microestrutural e nanoestrutural foram realizadas

com ajuda do microscópio eletrônico de varredura ZEISS DSM 940 A, utilizou-se o
método de elétrons secundários (SE), com uma distância de câmara de 10 mm, e tensão
de trabalho do feixe eletrônico de 20kV. Os estudos de caracterização referem-se aos
pós cerâmicos obtidos da síntese, retirados do balão tipo pêra após secagem, moagem e
peneiramento, dos pós obtidos da calcinação e do tratamento térmico a 1100ºC/2h e dos
quatros bifásicos HA/TCP-.

2.4. TESTE IN VIVO EM HUMANOS

Este trabalho foi realizado em a colaboração com a clínica Instituto de

Implantodontia e Cirurgia Maxilofacial (IMAXI), com a participação do Mestre
cirurgião dentista, Nelson Levandowski Junior, o qual apresenta grande experiência e
competência em implantodontia e em estudos avançados em odontologia.
Para desenvolvimento dos testes in vivo, o projeto de pesquisa foi aprovado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade da Região de Joinville (parecer n°
110/10) após terem sido analisados e verificados que atendem plenamente aos
parâmetros descritos na Res. CNS 196/96 e complementares, e Res. 19/07
CEP/UNIVILLE para realização de pesquisas com seres humanos. Os testes foram
realizados mediante os princípios éticos de experimentação para humanos.
Os estudos preliminares in vivo em humanos foram realizados, utilizando a
composição bifásica hidroxiapatita/fosfato tricálcio- microestruturada, na concentração
HA/TCP- 60/40% em volume das fases. O acompanhamento deste trabalho foi
realizado através de micrografias obtidas por raios X durante três meses.