ELECTROFORESIS
agarosa o de poder y la medida los ácidos nucleicos ya disponen de
la electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según
la movilidad de éstas en un campo eléctrico 1 la separación puede
realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido peev
electroforesis en papel o en acetato de celulosa o bien a través de una
matriz porosa electroforesis en gel o bien en disolución electroforesis
libre dependiendo de la técnica que se use la separación obedece en
distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa la
electroforesis se usa en una gran mayoría en la materia de lan
recombinante ya que nos permite saber la carga que poseen los polis
péptidos y separar los diferentes polipéptidos resultantes de las
variaciones del experimento de las recombinante la variante de uso
más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos
nucleicos utiliza como soporte un gel habitualmente de agarosa de
poli acrilamida los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica
negativa que los dirigirá al polo positivo mientras que las proteínas se
cargan al unirse con sustancias como el sds detergente que incorpora
cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular
de la proteína al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo
eléctrico estas moverán y deberán ir pasando por la malla del gel una
red tridimensional de fibras cruzadas por lo que las pequeñas
moverán mejor más rápidamente así las más pequeñas avanzarán
más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.
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electroforesis la electroforesis es una técnica para la separación de
moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico la
separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un
soporte sólido por ejemplo electroforesis en papel o en acetato de
celulosa a través de una matriz porosa electroforesis ángel ódena
disolución electroforesis libre dependiendo de la técnica que se use la
separación obedece en distinta medida la carga eléctrica de las
moléculas y a su masa la electroforesis egüés a en una gran mayoría
en la materia de lan recombinante ya que nos permite saber la carga
que poseen los competitivos y separar los diferentes colectivos
resultantes de las variaciones del experimento de lan recombinante la
variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas
o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel habitualmente de
una carga eléctrica negativa que los dirigirá al polo positivo mientras
que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el sds
detergente que incorpora cargas negativas de una manera
dependiente de la masa molecular de la proteína al poner la mezcla
de moléculas y aplicar un campo eléctrico ésta se moverán y deberán
ir pasando por la malla de gel una red tridimensional de fibras
cruzadas por lo que las pequeñas se moverán mejor y más
rápidamente así las más pequeñas avanzarán más y las más grandes
quedarán cerca del lugar de partida historia los primeros trabajos con
el principio básico de la electroforesis datan de principios del siglo 19
basados en las leyes de faraday de la electrólisis propuestas en el
siglo 18 y la temprana electroquímica los experimentos de juan will
smith George walker de justicia agricole rauch para medir las
propiedades y el comportamiento de pequeños leones en movimiento
a través de soluciones acuosas bajo la influencia de un campo
eléctrico llevaron a descripciones matemáticas generales de la
electroquímica de las soluciones acuosas con rauch creó las
ecuaciones para diferentes concentraciones de partículas cargadas
en movimiento incluyendo los límites de movimiento fila desde las
partículas que migran a principios del siglo 20 los electroquímicos se
habían encontrado que tales límites del movimiento de partículas
cargadas se podrían crear con tubo de vidrio en
forma de u los métodos de detección óptica de los límites en
movimiento en líquidos fueron elaborados en la década de 1860 por
augusto y claire perry dio la sien sombras o ligeras variaciones en las
propiedades ópticas en soluciones no homogéneas este método
combinado con los métodos teóricos y experimentales para la
creación y el análisis de los límites en movimiento cargados sería la
base del método de electroforesis limita el movimiento de ti serious la
electroforesis comenzó en serio con el trabajo de arnet y salió en 1931
y los nuevos procesos de separación y técnicas de análisis químicos
basados en la electroforesis continúan siendo desarrollados en el siglo
xxi y serious con el apoyo de la fundación rockefeller desarrolló el
aparato de diseño austral electroforesis límite de movimiento que fue
descrito en 1937 en el conocido artículo año apparatus ford
electroforética análisis o coidar mixture es el método se extendió
lentamente hasta el advenimiento de los métodos de la electroforesis
de forma efectiva en los años 1940 y 1950 utilizan papel de filtro geles
como apoyo a los medios de soporte en la década de 1960 los
métodos de electroforesis engel se volvieron cada vez más
sofisticados haciendo posible separar moléculas biológicas basadas
en diminutas diferencias físicas y químicas ayudando a impulsar el
auge de la biología molecular la electroforesis en gel y las técnicas
relacionadas se convirtieron en la base para una amplia gama de
métodos bioquímicos tales como las huellas digitales de proteínas
lahibridación sauce ni procedimientos de transferencias similares
secuenciación de la y muchos más electroforesis la gran mayoría de
macromoléculas están cargadas eléctricamente y al igual que los
electrolitos se pueden clasificar en fuertes y débiles dependiendo de
la constante de ionización de grupos ácidos básicos por ejemplo los
ácidos nucleicos son colegios fuertes por lo general para caracterizar
la molécula se determina la velocidad que ésta se mueve en un campo
eléctrico y se utiliza para determinar en el caso de proteínas la masa
molecular para detectar cambios de aminoácidos y separar
cuantitativamente distintas especies moleculares en el caso de ácidos
nucleicos se determina su tamaño medio en pares de bases velocidad
de una molécula para separar distintas especies se crea un campo
eléctrico para la molécula colocada en el líquido portador al generar
este campo existirá una intensidad pasando constantemente del polo
positivo al polo negativo por lo tanto actuará una fuerza sobre la
molécula y está experimentará una aceleración hasta obtener una
velocidad en la que la resistencia por viscosidad del medio no realiza
la fuerza impulsora es decir la molécula se desplaza con una
velocidad constante ante comenta y se escribe para obtener más
consejos sobre salud
FACTORES QUE AFECTAN LA ELECTROFORESIS
factores que afectan a la electrólisis en general la electroforesis
depende directamente del campo eléctrico y éste depende de distintos
parámetros basándose en la ley de ohm se tiene que hubo igual ir
diferencia de potencial v define el campo eléctrico la velocidad de
avance es directamente proporcional a ella resistencia rr la movilidad
de las moléculas es inversamente proporcional a ella intensidad
primero cuantifica el flujo de carga eléctrica se relaciona directamente
con la distancia recorrida por las moléculas por último otro factor que
afecta significativamente la electroforesis es la temperatura está es
importante puesto que por el efecto jul el paso de una corriente
eléctrica va a producir calor y éste es directamente proporcional a la
diferencia de potencial ya la resistencia por lo tanto es necesario
controlar de manera estricta la temperatura para que ésta no afecte a
la muestra desnaturalizando
ELECTROFORESIS DE ADN
electroforesis de dna engel de agarosa, la electroforesis es un método
de separación frecuentemente utilizado para analizar fragmentos de
adn generados por enzimas de restricción psr etcétera y es un método
analítico conveniente para determinar su tamaño en un rango de 500
a 30 mil pares de bases el tamaño de los fragmentos de adn se puede
estimar comparándolos con el patrón de bandas que se obtiene de
marcadores comerciales de peso molecular conocido la electroforesis
de adn es útil para comparar patrones de bandas de diferentes
muestras biológicas así por ejemplo se puede usar para comparar
muestras de individuos sanos frente a individuo enfermo para la
identificación de ácidos nucleicos de agentes infecciosos o para la
obtención de un fragmento determinado de adn que una vez
localizado en el gel puede ser extraído para análisis posteriores la
electroforesis engel es una técnica muy utilizada especialmente para
separar moléculas o fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos los
materiales más comunes para estos son polímeros como la olla que
la medida hola agarosa el medio de separación para esta práctica es
un gel de agro sa un polisacárido derivado del lagar y originario de las
algas es altamente purificado se extrae de la misma alga que se utiliza
para obtener el lagar utilizado en microbiología y alimentación es una
sustancia no tóxica pero no debe ser ingerida lo primero será disolver
el gel en un buffer tv3 boratto etea qué función tiene este buffer sus
dos primeros componentes trees y borat o mantienen el ph el dt a
captura el magnesio evitando que las nuclea se destruyan el dna de
que muchas de ellas lo manejan como cofactor enzimático ahora
homogeneiza moss la solución con agitación e incremento de
temperatura es necesario el uso de marcadores para poder detectar
a partir de tinción por fluorescencia y observación bajo la luz
ultravioleta como es la migración y es importante
además la utilización de marcadores año conocido porque nos
permitirán calcular los pesos moleculares de las muestras de dna
problema el bromuro de estudio es un reactivo y agente intercalan te
que nos permite esto cómo se intercala entre las bases del adn tiene
un poderoso efecto mut ajeno y por tanto es vital manejarlo con
precaución lo agregamos a la solución preparada lograremos la
gelificación cuando la temperatura se disminuya y el resultado será un
polímero o gelatina cuyos poros tendrán un tamaño dependiente de la
concentración agarosa presente este asunto de los foros es bastante
importante ya que los geles se comportan como un tamiz que permite
separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma así
molécula de dna de diferente tamaño van a migrar de forma distinta
ésta se denomina la cámara de electroforesis el sitio donde deberá
justificarse la solución de agarosa mientras se encuentra en estado
líquido ubicamos el peine para que nos proporcionen los huecos que
serán los puntos donde colocaremos la muestra tras calificar es
retirado junto con los soportes laterales los pozos serán el punto de
partida de cada una de las distintas muestras y guiarán los carriles por
donde viajarán gracias al paso de corriente hemos culminado la etapa
de preparación el buffer de carga contiene glicerol lo cual da peso a
la muestra para que el dna se precipite al fondo de los pozos de
siembra y color que permite identificar el frente de corrido tendremos
una relación de diez microlitros demuestra con 3 microlitros de buffer
de carga para cada gota con ayuda de la micro pipeta re suspendemos
la muestra aspirando y depositando varias veces para después llevar
al poso cerramos la cámara y por 10 minutos conectamos las
terminales con 100 voltios lograremos ver cómo la banda se va
moviendo a través del help aquí son sometidas a un campo eléctrico
y atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta el dna está compuesto
por cuatro nucleótidos que tienen carga negativa y peso molecular
similar por lo anto la aceleración impuesta por la fuerza eléctrica es
igual para cualquier molécula de ácido nucleico le dice en velocidad
de migración estará dada por la forma y tamaño de la molécula de dna
las proteínas también pueden ser separadas por electroforesis a partir
de su electro negatividad para este caso sí tenemos carga
diferenciadas por lo que aplicando esta técnica las moléculas que
tienen una carga negativa migrarán hacia el polo positivo mientras que
las moléculas cargadas positivamente lo harán hacia el polo negativo
es importante tener en cuenta el punto hizo eléctrico ya que a ese ph
como la partícula es neutra su movilidad electroforética es nula la
metodología permite separar aquellas presentes en sangre aplicando
una corriente eléctrica para desplazar las proteínas sobre una capa
fina de gel la distancia que recorre cada tipo de proteína depende de
su tamaño su forma y su carga eléctrica las proteínas y separadas
pueden detectarse mediante un colorante que se fija y tenía las
distintas proteínas y pone de manifiesto un patrón de bandas
característico cada banda indica la presencia de una proteína
mientras que el tamaño de la banda aporta una aproximación de la
cantidad de proteína este patrón de bandas se convierte
posteriormente en un gráfico que muestra picos verticales donde
existe mucha cantidad de una determinada proteína y unos picos más
pequeños o valles donde existe menos pasados los diez minutos
observamos cómo ha migrado la banda naranja y observamos la
luminosidad con luz ultravioleta la relación de bromuro de tibio con
adn nos permite apreciar la fluorescencia la intensidad está
relacionada con la cantidad de ácidos nucleicos en la práctica anterior
extrajimos muestras de banano y de sangre el genoma de los bananos
es relativamente pequeño su código genético tiene apenas de 500 a
600 millones de pares de bases de longitud su adn gira alrededor de
11 cromosomas el humano en cambio tiene una longitud total
aproximada de 3 mil 200 millones de pares de bases en 23 pares de
cromosomas las pruebas correspondientes al banano migraron más
esto debido a que es por su menor tamaño pudieron atravesar más
por los de Gmail la cuantificación análisis por espectrofotometría el
espectrofotómetro tiene la capacidad de proyectar un haz de luz
monocromática de longitud de onda particular a través de una muestra
medir la cantidad de luz que es absorbida por ella esto permite obtener
información sobre la naturaleza de la sustancia midiendo la absorban
cja a distintos largos de onda y graficando estos valores en función
del largo de onda formando un espectrograma con un micro litro
demuestra bastará para realizar el análisis en el equipo la absorban
cja está asociada a una concentración por una relación de 50
nanogramos por microlitro de dna en cada unidad de absorban hacia
nuestro blanco es el buffer t é la sustancia en la que se encuentran
disueltas nuestras muestras de adn la idea es que sus niveles de
absorban tsja no interfieran con la medición para el material genético
a 260 nanómetros es más o menos de 1,39 a 230 kilómetros se
detecta la máxima absorban ziadeh sales presentes en la solución
carbohidratos fenol u otros posibles contaminantes la relación entre la
absorban ca-260 y 230 debe ser aproximadamente igual a 2 si es
menor sugiere contaminación con proteínas y si es mayor con fenol
cloroformo o carbohidratos en nuestra muestra del banano la relación
fue de 0,62 lo que sugiere una contaminación con proteínas lo anterior
puede deberse a que durante el proceso no fue posible extraer todos
los trozos del banano también por posibles impurezas dadas por los
reactivos que eran caseros
VIDEO_
Cuando era un chico joven que estaba muy interesados en la
genética. Así que no lo hice realmente entender la genética. Yo como
que pensado que cuando dos organismos tenían una bebé, el bebé
fue precisamente esta mezcla de lo dos. Si, eso es un error. Pero yo
realmente vio la genética en la acción con mi guppies. Guppies son
muy fáciles de agua dulce peces para mantener en un acuario, pero
tener dos cosas que creo que son especialmente fresco. Tienen
nacido vivo lo que significa que no hay huevos al igual que muchos
otros peces, y en segundo lugar, tienen una gran cantidad de
criaturas. También se alimentan a sus bebés, pero no creo que eso
es especialmente frío, así como se puede ver, no es parte de mi Lista
de hecho fresco. De todos modos, cuando mi sobreviviente Guppies
bebé creció tendrían todo tipos de rasgos interesantes. Estos rasgos
fueron llevado por su ADN, su composición genética el material, que
se encuentra en su cuerpo Células. Pero a veces me olvide de lo que
madre era la madre del bebé guppy, porque había varios peces madre
en el tanque, y quería hacer un seguimiento de la herencia en mi
cuaderno guppy. Asi que lo que hubiera sido muy bueno tener ¿En
ese tiempo? Algunos biotecnología!
¡La biotecnología es la fusión de la biología y la tecnología, y está en
constante cambio! Eso incluye temas tales como PCR, la clonación y
Ingeniería genética. Es también un impresionante campo. Vamos a
hablar de una de las bio tecnologías que podrían tener, así
potencialmente, ayudó a determinar las relaciones genéticas de mis
guppies ... SI usted sabe que un chico joven que tenía acceso a la
eso. A pesar de que cada vez es mucho más común en las aulas
ahora. ¡Y eso la biotecnología es la electroforesis en gel! Gel
electroforesis se puede usar para separar moléculas en base a lo
grandes que son (Su tamaño) y es especialmente útil con el ADN.
Veamos ADN muy rápido. Asi que aquí es una célula guppy. Aquí está
el núcleo en la célula guppy. Aquí está el ADN en el núcleo de la célula
guppy, y si eran para hacer zoom en el ADN, aquí es una de
nucleótidos que es un bloque de construcción de MDNA. Ver los
fosfatos en la nucleótidos? Son un poco negativo. Así que aportan una
carga negativa de todos modos para el ADN. Así que si nos fijamos
en todo este ADN aquí se da que el ADN una carga negativa. Eso es
un gran problema, porque el gel electroforesis que separa de nuevo
moléculas basándose en el tamaño se basa en el hecho de que las
moléculas de ADN tienen una negativa cargar. Bien, aquí es una
electroforesis en gel máquina. El punto de la máquina es de ser capaz
de tener una carga eléctrica corriendo a través de un gel así que aquí
está el gel típicamente hecho de agarosa. La agarosa es una polímero
de polisacárido, que si recordar de nuestro video biomolécula,
polisacáridos son carbohidratos. Sí, por lo general viene de agarosa a
partir de algas. Los gel de agarosa en sí permite que el DNA moléculas
viajan dentro de ella. Un extremo de el gel tiene estos agujeros
llamados pocillos. Los pozos son donde se coloca el ADN en La zona
del gel donde los pozos son está cargada negativamente, y el área de
el gel aquí está cargado positivamente. Asi que supongo que donde
el ADN se desplazará hacia? Bueno, ya que está cargado
negativamente, es que va a viajar hacia el lado positivo. Asi que
normalmente cuando se está analizando el ADN de electroforesis
utiliza estos las enzimas de restricción para cortar el ADN hasta en
pequeños pedazos. Enzimas de restricción tienen la capacidad de
cortar el ADN en muy áreas específicas, a menudo se refieren a la
bases de ADN específicas, haciendo restricción enzimas de gran
utilidad en la biotecnología. Hay muchos tipos diferentes de enzimas
de restricción y que le animan para aprender acerca de la forma en
que cortan el ADN y cómo difiere con diferentes tipos de enzimas de
restricción. Este video no lo hace ir a las diferentes maneras en que
enzimas de restricción cortan el ADN. Así que si tuviera ADN guppy
guppy bebé y la madre de adultos ADN, y quiero compararlos,
entonces yo se desea utilizar los mismos tipos de las enzimas de
restricción en ambas muestras de ADN. Si usara el mismo tipo de
restricción enzima, se debe cortar el ADN en los mismos puntos de
identificación de la muestras de ADN. Sin embargo, a menos que la
madre y el bebé guppy son clones (y que están no), aquellas piezas
que resultará después de la enzima de restricción se realiza con ellos
puede ser de diferentes tamaños debido a que el DNA de el guppy
bebé y la madre tenía algún las diferencias en la secuencia de su DNA
bases. Así que las muestras de ADN tanto se cortan en varias piezas
del mismo tipo de enzima de restricción y, a continuación aquellos
muestras se cargan en el gel sample1 y sample2. Si nos fijamos en la
máquina y dejar que el ADN dirigido a través del gel, la ADN se mueve
hacia el lado positivo. Pero algunas piezas de que el ADN cortado se
moverán más rápido o más lento que otras piezas. Más largos trozos
de ADN tienden a tener una mayor peso molecular y se toman más
tiempo para que sea a través del gel cuando se compararlo con piezas
de ADN más cortas que avanzar a un ritmo más rápido. Así que lo que
termina con es que estos fragmentos de ADN se extienden con las
piezas más largas más cerca de la pocillos y las piezas más cortas
más cerca de este lado opuesto del gel. Estos son llamado bandas de
ADN, pero que se ven, por lo general necesitan para teñir el gel en sí
y ver bajo una luz ultravioleta. Ahora vamos a comparar las bandas
de ADN en este hipotética situación guppy simplificado.
Las bandas no van a ser idénticos, debido a que estos peces no son
clones, pero Puede comparar la similitud de las bandas son y
compararlo con otra guppy madre muestras para buscar relaciones.
Vamos decir que tenemos tres guppy madre muestras para ver y estos
son el único posibles madres de la pecera. ¿Cuál parece ser la más
relacionada a la descendencia en este caso, y tiene una alta
probabilidad de ser madre? Bien éste. Pero no podemos estar 100%
seguro con esto, sería útil para mí saber la muestra padre guppy
también porque esto le dará una visión más clara. Pero si estos son
los únicos peces en el tanque, que es una probabilidad muy alta con
este caso.
Además, se puede usar algo que se llama un ADN ¡escalera! Se
pueden comprar de varios ciencia distribuidores de materiales, pero
un ADN escalera no es lo que suena. Sus básicamente, una muestra
que ha conocido tamaños de los fragmentos de modo que si se
ejecuta en el máquina de electroforesis, que ya conoce las longitudes
de los fragmentos. Digamos que este ADN escalera sólo tenía tres
bandas, que no es suele ser el caso. Puesto que es un escalera de
ADN, se conocen las longitudes de pares de bases. Son 500 pares de
bases, 1.000 pares de bases, y 1.500 pares de bases. ¿Piense
minutos foros ... dónde iban a encajar? Se vería como esto! Se puede
utilizar esta ahora como referencia para dar estimaciones de el
tamaño de los otros fragmentos son cuando que están corren junto a
él, y si quieres a estar más cerca del valor, puede utilizar una soportar
mi gráfico de amor algo para mirar hacia arriba. Entonces, ¿por qué
nos importa en gel electroforesis? No es probable que estaré utilizar
realmente esto con mis guppies de todos modos, ¿verdad? Bueno, tal
vez. pero en gel
¡La electroforesis es a menudo un paso utilizado en la determinación
de la relación con diferentes especies, que ayudan a unos mejores
científicos clasificar los organismos! También se usa como parte de la
huella de ADN. DNA toma de huellas dactilares es una manera que
uno puede identificar el ADN de alguien que puede ser muy útil si
usted está tratando de resolver un misterio que involucra una escena
del crimen. Si tu tiene una muestra de ADN de la escena del crimen,
puede ir a través de los pasos de gel electroforesis para compararlo
con el ADN sospechoso para ver la probabilidad de un partido. De
hecho, puede tomar los resultados de electroforesis en gel y aislados
genes de interés por algo llamado transferencia de Southern.
definitivamente algo mirar hacia arriba si tienes curiosidad. Gel
electroforesis es uno de los muchos impresionantes herramientas de
la biotecnología. Bueno, eso es todo para las hermanas de la ameba,
y le recordamos a permanecer curiosos
ELECTROFORESIS EN GEL AGAROSA
el objetivo de este vídeo consiste en explicar la base teórica de la
separación de fragmentos de adn en gel de agarosa así como
visualizar el proceso completo desde la preparación del gel hasta el
análisis de los resultados en primer lugar se explicará en qué se basa
la técnica posteriormente se detallarán los materiales necesarios para
llevar a cabo el proceso para a continuación desarrollar la metodología
por último se indicará cómo interpretar los resultados obtenidos la
electroforesis ángel de agarosa es uno de los métodos más
empleados para separar fragmentos de adn esta técnica se basa en
el hecho de que el adn se encuentra cargado negativamente debido a
los grupos fosfato como consecuencia cuando se aplica un campo
eléctrico el adn se desplaza desde el polo negativo hacia el polo
positivo esta separación se llevará a cabo en una matriz sólida el gel
de agarosa existen distintos factores que afectan a la velocidad con
que el adn migra en el gel entre estos factores podemos citar el
tamaño de lamolécula la concentración de agarosa o la conformación
del adn para llevar a cabo el proceso necesitaremos guantes y juego
de micro pipetas y puntas microondas cubeta de electroforesis fuente
de alimentación captador de imágenes los reactivos empleados son
tampón tv compuesto por trees ácido bórico y eta tampón de carga
compuesto por sacarosa azul bramó fenol y eta agarosa y bromuro de
pidió a una concentración de 0,5 microgramos por mililitro por último
emplearemos un marcador de pesos moleculares para poder
determinar el tamaño de los fragmentos obtenidos describiremos a
continuación el proceso completo en primer lugar es necesario pesarla
arosa y disolverla en el volumen apropiado de tampón tv de forma que
el gel tenga la concentración adecuada en función del tamaño de
fragmentos que se pretenda separa para ello se calienta la mezcla en
microondas hasta hacerla hervir a continuación se vierte la solución
en un porta geles que servirá como molde para el gel para formar los
pocillos en los que se depositará la muestra se coloca un peine
mientras el gel solidifica se preparan las muestras para cargarlas en
el Gmail para ello se añade a cada muestra el tampón de carga cuál
es el objetivo de añadir este tampón a la muestra el tampón de carga
tiene una doble función por una parte aumenta la densidad de la
muestra de forma que ésta permanezca en el pocillo una vez
depositado esto se consigue debido a la sacarosa que incluye el
tampón por otra parte el tampón de carga permite ver el frente de
avance del gel gracias al colorante azul que contienen esto permite
determinar el momento en que podemos detener la corriente y finalizar
el proceso de separación una vez solidificado el gel se retira el peine
y se introducen en la cubeta de electroforesis dentro de la cubeta el
gel debe quedar cubierto por tampón tv cuya sales son las que
permitirán el establecimiento de la corriente cada muestra se coloca
en uno de los pocillos formados en el gel una vez cargadas todas las
muestras se establece la corriente en la cubeta de electroforesis de
manera que el adn se desplazará del polo negativo al polo positivo el
voltaje empleado para llevar a cabo la separación depende
fundamentalmente del tamaño del gel una vez se ha completado la
separación es necesario tener el gel con un colorante que se una al
adn de manera que se puedan visualizar los fragmentos separados
una de las sustancias posibles que se puede emplear es el bromuro
de ti se trata de un agente intercalan t debido a esta característica es
un agente mutagénico de manera que debe manejarse con
precaución y siempre con guantes tras quince o veinte minutos de
tinción es necesario iluminar el gel con luz ultravioleta para que el
bromuro de tijd yo emita florescencia y sea posible detectar los
fragmentos de adn separados si la fuente de luz ultravioleta lleva
acoplada a una cámara fotográfica es posible ver la imagen en un
monitor y grabarla en algún soporte informático lo que facilita el
análisis posterior de los resultados como determinamos el tamaño de
los fragmentos separados en el g por comparación con un patrón de
tamaños conocidos podremos conocer el tamaño de los fragmentos
de nuestra muestra ya que fragmentos del mismo tamaño migrarán a
una misma distancia en el Helm existen distintas técnicas que
permiten la separación de fragmentos de adn pero para muchas de
las aplicaciones la separación en gel de agarosa es la más emplea
sus principales ventajas son que es rápida y sencilla y que permite
determinar mediante tinción con bajas concentraciones de color ante solución y potonik a y por diferencias de la concentración molar del
el tamaño de los fragmentos separados soluto las células e hincha hasta romperse y liberar su contenido
también se utilizan tratamientos químicos como detergentes o agentes
ko trópicos por ejemplo la acetona tolueno o como la rifa toxo dijo que
EXTRACCION DE ADN sólo utiliza lo limpio de la gama pragmática claro así como también
desnaturalizar las proteínas que las soluciones del isi contienen
os puntos que voy a tocar es fundamento teórico organelos con adn
además un agente quelante de katyn equivalentes llamado a eta de
algunos método de extracción y finalmente un esquema genera la
que inactiva las cadenas por interacción con sus factores matiko el
extracción de adn antes de dar un poco de los fundamentos y las
magnesio o también podemos considerar el tratamiento enzimático
bases moleculares del proceso de extracción es necesario entender
aquí pues algunos ejemplos como la lisozima qué ropa enlaces 14
que estamos en un contexto de etapa analítica es decir en la
entrenarse timón amico y en eso y lujosa mina del
investigación existe una tapa para analítica que involucra a la elección
peptidoglicano era para el celular de las bacterias políticas que rompe
demuestra su manejo su transporte hasta una etapa post analítica que
la ces 13 lucano de las levaduras y proteasas que rompen las
engloba a la interpretación y documentación de resultados entonces
especificó de proteínas de pared y membrana plasmática en la
depende del material que se va a procesar y su medio de
interacción 0 la célula el siguiente paso sería eliminación de proteínas
conservación se debe realizar para tratamientos es decir por ejemplo
entonces liza las células en la primera fase en el medio tubo nos
yo tengo una muestra de tejido muy bien parafina y hoy Solbes a
quedan las proteínas y además de otros contaminantes por tanto es
parafina con siglo nuevo eliminarla con etanol absoluto para poder
necesario utilizar enzimas proteolíticas que son activas ante un amplio
procesar la muestra pago método de extracción no puedo pretender
espectro de proteínas para desintegrar las e inactivar las en algunos
extraer adn de manera directa de una muestra cuyo medio de
protocolos optimizan el primer y el segundo paso agregando enzimas
conservación podría contaminar una cierta reacción por lo tanto es
como la proteína saca en presencia de el abra y sulfato sódico por
necesario tomar en cuenta todos los factores en relación a la muestra
ejemplo también se puede utilizar pero nazas pero debido a que éstas
en la etapa pre analítica también tenemos que darnos cuenta que la
poseen contaminantes como las nuclea sas es necesario auto digerir
extracción de adn es un punto crítico dado que en este proceso no
a 37 grados unas horas antes de su uso y pues seguimos eliminando
determina la obtención exitosa de pureza y calidad de adn es decir
los contaminantes y parte de ello es el a rené eliminación de rehenes
librede contaminantes que nada segunda etapa podría inhibir una pcr
importante puesto que al momento de la jubilación con sondas se
o en si la aplicación de marcadores moleculares entonces la elección
puede cometer errores de reconocimiento de la secuencia
adecuada un protocolo de extracción es asegurar la confiabilidad de
contaminada con a rené entonces se utiliza a rené asas como la
los datos que pretendemos obtener vamos a comenzar con marco
revolucón lasa ha aislado y purifica a partir del páncreas de bovino
teórico y vos como sabemos las células una estructura de muchos
está arriba 1 plaza nos da la capacidad para aislar adn libre de a rené
componentes como lípidos proteínas carbohidratos oligoelementos a
está encima hidroliza lrm en los recibos de citocinas y Brasil o
rené en fin que nos separan el material genético analizar y observan
cortando entre los grupos fosfato 3 prima del núcleo tvpy mina el grupo
que la primera barrera es una membrana que está constituida por
5 prima hidroxil de nucleótido haya center lo siguiente es eliminación
lípidos y proteínas además que también están los componentes de su
de contaminantes ya tenemos al adn en micro tuvo mezclado con las
plasma y la membrana nuclear entonces primer paso es liz y celular
trazas de las proteínas y lípidos y los demás contaminantes residuales
en el cual vamos a desintegrar los componentes celulares que implica
que pues pueden tergiversar los resultados es ahora descartarlos y
cierto tipo de tratamiento que puede ser rotura mecánica o sometiendo
preservar el adn y pues el adn es una molécula polar a causa de la
la célula análisis osmótica tienen para hacerlo se suspende una
carga negativa que le confiere su grupo fosfato eso nos permite
aprovechar la característica es decir la tendencia hidrofílica del adn
agregando un solo ente orgánico que separa dos fases una orgánica
donde precipite todas las proteínas y otra fase que mantiene inmersa
la dn una solución acuosa y típicamente se utiliza algunos solventes
orgánicos tales como el fenol cloroformo y la cual hizo a méxico los
cuales también tienen la propiedad es natural proteínas quedando las
proteínas en la interfase y el adn en la fase acuosa la proporción de
volúmenes óptimas en muchos casos es la de 25 24 1 ahora
precipitación del adn por centrifugación separamos el adn la fase
acuosa de la orgánica y al haber agregado solventes orgánicos se
rompe la capa hidratante y los grupos fosfatos quedan libres para la
unión cationes monovalentes como el sodio o amonio que reduce la
fuerza repulsivas entre las cadenas de los nucleótidos y permite que
el adn se pliega sobre sí mismo haciendo lo que precipite en resumen
para precipitar el adn se recomienda usar etanol en presencia de altas
concentraciones de acetato de amonio acetato de sodio o acetato de
potasio el etanol permitirá que el adn permanezca en el fondo detuvo
y mediante la centrifugación también removeremos los recibos de
fenoll y el cloroformo del paso anterior y al final los restos del poeta
no se elimina con un lavado con este nuevo 70% y el remanente se
elimina por evaporación y ya el último paso es re disolución del adn
en esta final es para hidratar y eludir el adn y para ello se utilizó una
solución amortiguadora es preferible utilizar una solución trees base o
eta un ph de 8 hay que tener sumo cuidado al momento de manejar
volúmenes para no degradar el adn y poder conservar la temperatura
óptima hasta que nosotros precisamos utilizarlo sé que los pasos son
pocos superficiales pero al final la fortaleceremos en tus
conocimientos con el protocolo de extracción vamos a ver ahora
organelos con adn que nosotros entendemos que el adn nuclear es
ampliamente estudiado así que o me tiré subvención y me enfocaré
un poco el adn mitocondrial y del cloroplasto que por cierto tiene una
organización muy parecida vamos a comenzar con el adn mitocondrial
es importante para determinar variaciones evolutivas es mucho más
sensible a las mutaciones que nada en el cromosoma además que
también posee regiones que conservadas a causa de la transmisión
materna otra diferencia es que está excluido de mecanismos
sofisticados de regulación de la expresión de genes porque no están
involucrados en los procesos de mitosis o medios y conjuntamente
con el adn nuclear entonces este adn mitocondrial posee muchas
características que vale la pena mencionada por ejemplo es heredable
pero no sigue la leyenda le han asignado una herencia un y parental
es decir que se transmite por uno de los progenitores que
generalmente es la madre aunque raras veces se ha reportado
también transmisión paterna ocasional también está la poliplaza línea
es decir que cada célula posee cientos de miles de copias de adn
mitocondrial que varía de 1.000 a 10.000 copias por célula y es lógico
porque se va a multiplicar el número de copias por mitocondrias que
va de dos a 10 moléculas y el número de mitocondrias por cada célula
por cierto si alguna de esas copias sufre algunas anomalías de
secuencia en la segregación réplica tiba se le denomina hetero
plasma es decir células con copias de adn mutado y normal y qué
sucede cuando el número de copias de adn mutado excede al
porcentaje establecido pues simple no se va a modificar algunas
proteínas implicadas en la producción del pp y acuérdense que la atp
es la moneda energética de la célula entonces estará debajo de los
mínimos necesarios para un buen funcionamiento de los tejidos por
tanto a causa de este hecho se producirá algunas patologías producto
de las votaciones me tocó en conclusión el adn mitocondrial bar y en
todos los organismos que va desde los 15 mil a 65 mil pares de bases
aproximadamente y aquí tenemos un esquema del adn mitocondrial
del ser humano que 16 mil 507 9 pares de bases y este adn contiene
información para 37 genes que frecuentemente están solapados y
codifican a rené ribosomal arremete transferencia algunos
componentes de los ribosomas y polipéptidos involucrados en los
procesos propios de la mitocondria en cuanto a su organización es
una molécula circular doble cadena posee una cadena pesada una
cadena ligera que difieren en cuanto al contenido de una institución a
como mencioné antes existen algunos casos clínicos debida a
mutaciones puntuales y estas patologías tienen la característica
común de estar causados por un defecto en cuanto a la producción
de atp que es esencial para el desarrollo de diversos procesos
biológicos ec y les puse algunos ejemplos que lo puedan revisar si les
genera algún interés vamos a ver ahora adn del cloroplasto similar a
la mitocondria este órgano lo posee su propio adn el cual es circular
doble cadena varía entre 80 mil a 600 mil pares de bases
aproximadamente las plantas también se transfiere por herencia un y
parental o también algunos autores le llama herencia citoplasmática y
bueno en sí este adn posee muchas características análogas ante las
mitocondrias en cuanto a su tamaño a su falta de asociación con
histonas en cuanto a su mecanismo de replicación que por cierto
todas estas características respalda más la teoría en 2 simbiótica que
postula que tanto las mitocondrias como cloroplasto tiene origen
bacteriano y vale creo que revisa más sobre este tema porque tiempo
en hablar para tanta en cuanto a su organización posee secuencias
repetidas que dependen de acuerdo a los organismos algunas
repeticiones engloban la mayor parte del genoma y otros organismos
están ausentes aunque la mayoría de las especies vegetales se ha
demostrado la presencia de una duplicación invertida que incluyen
genes de a rené transferencia la secuenciación del adn es decir el
plato ma ha revelado que existe alrededor de aproximadamente 150
genes
que se distribuyen en genes de transcripción y traducción incluye a los
genes de arne transferencia a rené ribosomal y proteínas rivasómicas
quienes del aparato fotosintético es decir polipéptidos de membrana
genes de biosíntesis algunas modificaciones en la secuenciación de
plazas toma genera gran interés en cuanto a estudios fisiológicos
moleculares genéticos y bioquímicos de cloro plast debido a que
desde un enfoque económico son de relevancia para mejorar algunas
características de importancia económica como la resistencia a
herbicidas o eficacia fotosintética vamos a mencionar algunos
métodos de extracción y bueno vamos a comenzar con gradiente
cloruro de cesio este método es necesario cuando nosotros
pretendemos aislar y purificar adn en base a sus características de
densidad por ejemplo cuando queremos aislar adn mitocondrial del
adn nuclear nosotros podemos aprovechar esta diferencia de
densidad es la cual están relacionadas a la proporción de contenido
de one in situ sin a entonces en centrifugación el adn se someterá a
un mecanismo de gradiente de cloruro de cesio formando gradiente
lineal estable con la más baja densidad arriba y la densidad más
pesada en el fondo el adn se separa en diferentes capas en las que
se agrupan los ácidos nucleicos según su densidad y como vemos en
la imagen también se utiliza un colorante fluorescente como el
bromuro de tibio enamoro de ti es un colorado y mercal ante que se
inserta entre las bases públicas ipp y médicas y hace que el adn se
vuelva boyante o también se utiliza el hoyts que interactúa en los
puentes de hidrógeno y tiene mayor afinidad por los nucleótidos de
adenina timina y finalmente se utilice dicho propanol para eliminar el
muro decidió otro método para extraer adn es mediante setup si
queremos aislar adn de una planta o alguna muestra de origen vegetal
se puede utilizar este método que incluye algunas variantes y
modificaciones en base al material a procesar es bastante útil por su
eficacia al eliminar compuestos fenólicos carbohidratos y una serie de
trazas que son contaminantes e inhibidores para una buena pcr por
ejemplo si quiere extraer adn de las hojas de alguna planta lo primero
es congelar lo controló geno líquido una prueba esterilización con
hipoclorito luego la pulverización y a los pasos siguientes el proceso
mediante mahfouz por ejemplo primero hacer es el bazar de lisis de
extracción y contiene todos estos restantes quedan acá y ya usted lo
revisan con detalle otro paso fundamental sería la remoción de
proteínas y lípidos inmersos en el set up y para ello se suele usar el
cloroformo canola en proporción de 24 1 o también se va a utilizar el
fin del cloroformo alcohol islámico en 25 24 1 en este paso se forma
la fase acuosa de la base orgánica la cual se descarta mente la
centrifugación luego de separar la fase acuosa es necesario precipitar
el adn con isopropanol y luego el huir el adn para conservar la
temperatura estable también se puede extraer adn mediante kipps
existen varios kits de extracción están disponibles en el mercado que
son cada vez más accesibles de fácil uso y viables al momento de
obtener una buena calidad de adn los fabricantes de estos kits no
facilitaron la extracción en cuanto al tiempo para procesar una
muestra además que un kit alcanza para una gran cantidad de
muestras y la facilidad de hacerlo uno mismo también es importante
los protocolos son fáciles de seguir sólo es cuestión de revisar las
indicaciones de los más feroces el modo de conservarlo el modo de
aplicar la cantidad de muestra utilizar la aplicación de volúmenes
exactos y así seguir las recomendaciones del fabricante por supuesto
que jamás olvidar las bases teóricas y los fundamentos al momento
de la aplicación y pues aquí les deje algunos ejemplos que ya usted
revisa detenidamente y ya en la parte final ese video les mostraré
cómo extraer adn utilizando gira extracción que omitir el nombre
comercial o el fabricante porque realmente no es importante y no
estoy haciendo publicidad de alguna en especial todos tienen sus
virtudes en cuanto a obtener una buena calidad de adn y antes que
se me olvide es importante tener en cuenta que el protocolo de
extracción de algonquin en especial nos va a servir para extraer adn
distintas muestras pero los pasos no son los mismos así que deben
revisar bien las indicaciones para cada tipo de muestra y cag y tiene
sus limitaciones por ejemplo no pretendamos extraer adn de una
planta y el quinto es el indicado acuérdese que la gran barrera de
extraer adn de una célula vegetal es la pared celular entonces
elegimos otro método de extracción que por ejemplo podría ser el
antes ya mencionados etap entonces dichas aclaraciones
correspondientes quiero mostrarles una tabla de los reactivos que se
van a emplear en el esquema extracción ustedes pueden causar el
video y revisar detalladamente el contenido y la función de cada uno
de ellos por cierto algunos reactivos necesita una previa preparación
así que le a las especificaciones del kit que ustedes utilizan por
ejemplo en este índice se necesita preparar previamente
producciones que he hecho y muba fra igual lo afro jajajjaa one del
inglés porque sólo nombres comerciales vale el momento del
esquema extracción y en principio es tener la muestra que para este
caso es tejido entre epitelial que el peso es aproximadamente de 25 a
50 miligramos este tejido está inmersa en un medio de conservación
que puede ser un va a hacer como el psc aún determinada ph y
empezamos por centrifugar para quedarnos con aproximadamente un
mililitro del ps y esto agregamos a un micro tuvo de 1.5bm l centrífuga
vamos de nuevo para concentrar la muestra descartamos el
sobrenadante en el pellet de células que nos queda agregaremos 200
microlitros del primer reactivo de servicios la esb afa que contiene las
sales que banalizar las células además que él va a hacer nos va a
permitir regular las ideas y la osmolaridad del izado también
agregamos 40 microlitros de protones que que nos va a permitir
desnaturalizar las proteínas mezclamos un poco el contenido e incuba
moza 55° por un determinado tiempo y si ustedes me preguntan
cuánto tiempo pues depende de su muestra si vencen las libres pues
necesitará más o menos de 30 ó 40 minutos pero pues si tiene un
tejido compacto pues déle una hora o una hora y media hasta que
ustedes puedan percibir que todo el tejido este digerido
completamente nada el tiempo establecido retiramos en micro tuvo
íbamos a llegar ahora 200 microlitros de buy-in bafa y luego
incubamos aumentando la temperatura hasta 70 grados por 10
minutos en esta etapa optimizamos la lisis con una saca otro pica
propia de este kit que es el hidrocloruro de juan y bina retiramos el
micro tuvo concluirá la etapa de lis celular ahora llegamos 100
microlitros de isopropanol y el momento de mezclar ligeramente
veremos unas pequeñas fibras blanquecinas que revelan la
precipitación del adn este mix agregamos en un tubo filtro que posee
una membrana tipo sílica entonces los ácidos nucleicos se van a unir
selectivamente a la cíclica y esto nos va a ayudar a retener el adn en
el proceso de absorción y desorción llevamos a centrifugación a 6.000
rpp por cinco minutos no descartamos el líquido filtrado y cambiamos
de tubo colector ahora agregaremos 500 microlitros del siniestro y
move afro que phelps tiene technology ya ustedes recuerdan el
fundamento teórico no pierdan de vista la adn que todavía si en el filtro
y por si acaso cuando estrenan adn es no se confundan de tu voz y
descarten el incorrecto que arruinan todo el trabajo de una mañana
por lo menos sí pues peor aún si acaso es poco común del mismo
modo centrífuga moss descartamos el líquido filtrado y cambiamos de
tubo colector ahora es momento para eliminar todo tipo de
contaminante y para ello agregaremos 500 microlitros de oas va fer y
el propósito es que no quede ningún contaminante que imita a una
siguiente reacción como la reacción en cadena de la polimerasa
vamos a centrifugar ahora a 8.000 rpm por cinco minutos descartamos
el líquido de filtrado y cambiamos de tubo colector esto vamos a repetir
dos veces para asegurar la calidad del adn y una doble explicación de
este bajar nos ayudará a la purificación del adn es decir a remover
aquellas moléculas residuales que todavía quedan inmersas en la
membrana del filtro conjuntamente con los ácidos nucleicos y ahora
les digo algo importante sigan siempre las recomendaciones del
fabricante y no utilicen alcohol desnaturalizado o etanol
desnaturalizado llegue contiene isopropanol metanol u otro
disolventes que puede interferir con el objetivo de la extracción que es
obtener el adn de buena calidad finalmente agregamos 50 mililitros de
'lucho' baf vamos a esperar de 5 a 10 minutos para que el adn pueda
hidratarse centrífuga moza 10.000 rpm por un minuto luego
agregamos 100 microlitros finales de los omvs first esperamos cinco
minutos más y para terminar centrífuga moza 10.000 rpm por dos
minutos tenga mucho cuidado en no descartar el último filtrado que
realmente es el adn puro ahora trasladamos el volumen total que
serían 150 microlitros en un micro tuvo de 500 mililitros y ya podemos
preservar y conservar el adn a baja temperatura cuidado con
manipular bruscamente la micro pipeta o dejar a medio ambiente que
el adn puede degradarse echaríamos a perder todo el proceso
¿CUÁL ES LA FUNCIÓN DE UNA SOLUCIÓN BUFFER TRIS EN LA
EXTRACCIÓN DE ADN?
La solución Tris, o tri (hidroximetil) aminometano, es una solución
buffer biológica común que se utiliza en todo el proceso de extracción
de ADN ya que este es sensible al pH de cualquier tipo de fuente
durante dicho proceso. La solución Tris se utiliza durante la lisis
celular, la eliminación y la precipitación de componentes celulares no
deseados para mantener un pH estable. Además, desempeña un
papel particularmente importante en la lisis celular.
La solución Tris como buffer
Como el pH puede influir y ser influido por un número de factores
celulares, mantener un pH estable es esencial para la ciencia
experimental. Los buffers biológicos, como la solución Tris, son
importantes porque pueden mantener un pH estable a pesar de las
influencias que podrían modificar el pH. El Tri (hidroximetil)
aminometano, con un pKa de 8,1, es una solución buffer eficaz con
un pH de entre 7 y 9. Debido a su rango neutro, la solución Tris es una
solución buffer comúnmente utilizada en los laboratorios biológicos.
Sin embargo, la solución reguladora Tris es sensible a la temperatura
y debe ser utilizada en la temperatura a la cual se logró el pH original
para evitar inexactitudes.
Lisis de las células
La lisis, o ruptura de las células, es el primer paso para la extracción
del ADN. Esto se logra mediante el uso de una solución buffer que
contenga solución Tris y EDTA (Ácido Etilendiaminotetraacético). El
EDTA se une a cationes divalentes tales como el calcio y el magnesio.
Dado que estos iones ayudan a mantener la integridad de la
membrana celular, la eliminación de estos con EDTA desestabiliza la
membrana. La solución Tris es el principal componente buffer; su
función principal es la de mantener el pH del buffer en un punto
estable, por lo general 8,0. Además, la solución Tris interactúa con el
LPS (lipopolisacárido) de la membrana, lo cual sirve para
desestabilizar la membrana aún más.
La solución Tris Protege al ADN de los cambios en el pH
Cuando las células se rompen, su ADN y contenido se vierten en el
buffer. A menudo se incluyen además, la ARNasa (destruye el ARN),
las proteasas (destruye las proteínas), y el SDS (dodecilsulfato sódico,
solubiliza los fragmentos de membrana). En conjunto, este caldo de
contenido celular y fragmentos de ARN y proteínas puede tener un
gran impacto en el pH de la solución. Debido a que el ADN es sensible
al pH, es importante que la solución Tris regule el caldo y mantenga
el pH en un valor fijo.
Precipitación del ADN
En la etapa final de la extracción de ADN, se extrae el propio ADN de
la solución. En este punto, el ADN es soluble en el buffer. Para extraer
el ADN de la solución, este se hace insoluble mediante la adición de
etanol o isopropanol (alcohol isopropílico). Al hacer esto, el ADN se
hace visible en la solución como una sustancia blanca filiforme. A
pesar de que cuando el ADN es insoluble se lo puede aislar de los
componentes celulares restantes, no es "utilizable". Después de
aislarlo, se elimina el alcohol, y el ADN debe ser devuelto a una
solución buffer biológica, tal como la solución Tris, para ser utilizado.
Hazlo tú mismo
Aunque la extracción de ADN se hace comúnmente en los laboratorios
de investigación, utilizando generalmente uno de los kits disponibles
en el mercado, cualquier persona puede hacer la extracción de ADN
en casa utilizando elementos comunes del hogar y guisantes o
espinaca. En este caso, ni la solución Tris ni ninguna otra solución
buffer biológica, está presente para proteger al ADN de los cambios
en el pH. Sin embargo, es una forma visual de ayudar a los
estudiantes a conectarse con el ADN celular.
¿Por qué se utiliza sodio en la extracción de ADN?
El ADN no flota libremente dentro del núcleo de una célula. Está
asociado con un gran variedad de proteínas y está revestido en una
membrana celular. En las células animales, el ADN también está
contenido en una membrana nuclear. Para poder extraer el ADN de
una célula, primero deben retirarse las membranas y proteínas
asociadas, y después separarse de manera física del ADN. El sodio
puede estar dentro de muchos de los pasos para lograr esta meta.
Características y preparación del Buffer TBE (Tris, Borato, EDTA) y
TAE (Tris, Ácido Acético, EDTA)
Publicado el 8 marzo, 2012por Antonio Gómez
Hay dos soluciones tampón muy usadas para separación de
fragmentos de ADN mediante electroforesis, son el buffer TBE y buffer
TAE, que sólo se diferencian en un compuesto, ácido bórico y ácido
acético respectivamente.
Componentes:
– Tris (Tris-(hidroximetil)-aminometano): Molécula responsable del
tamponamiento. Regulación del pH.
– Ácido Bórico/Ácido Acético : contribuye a ajustar el pH deseado
e igual que el anterior, a mantenerlo.
– EDTA (Ácido Etilendiaminotetraacético): quelante de cationes
divalentes, cuya función es secuestrar Mg2+, con lo que se evita que
las posibles nucleasas presentes degraden el ADN de la muestra, ya
que la mayoría de las nucleasas requieren de Mg2+ como cofactor.
EXTRACCION DE ADN
Facultad de Ciencias Agropecuarias16Vol 3 No.1 Marzo 2005
polimerasas, ligasas y endonucleasas de restricción; la base para la
separación de los polisacáridos de los ácidos nucleicos, es su
solubilidad diferencial en presencia de las altas concentraciones de
NaCl los polisacáridos precipitan bajo la acción de fuerzas centrifugas.
A la mezcla anterior se agrega un detergente aniónico como el SDS
(sodio dedecil sulfato), que solubiliza proteínas, tejidos y membranas,
evitando que una cantidad significativa de ADN quede atrapada en los
desechos o restos celulares. Para prevenir que el ADN extraído
presente coloración gris o parda, la cual se debe a la actividad de
polifenoloxidadas presentes en algunos tejidos, se incluye en el buffer
de extracción P.V.P (polivinil pirrolidona)(6). Para separar las
proteínas, se lleva la mezcla de tejido con el tampón a incubación a
65ºC con lo cual se desnaturalizan las proteínas. Para retirar las
proteínas denaturadas y la mayoría de los polisacáridos, se agrega
una sal como el acetato de potasio frío. Por centrifugación se separan
tejidos, membranas, polisacáridos y proteínas de los ácidos nucleicos,
los cuales quedan en el sobrenadante. Finalmente hay que separar el
ADN de la fase acuosa, para lo cual se debe precipitar el mismo,
usando un alcohol como el isopropanol, el cual es selectivo en la
precipitación del ADN en presencia de ARN. Después de precipitado
el ADN se disuelve en una solución tampón (TE de pH 8.0) o en agua
bidestilada. El ARN se remueve adicionando enzima RNAasa a la
solución. A continuación se detallan los pasos que se siguieron en la
extracción de ADN de Heliconias, en el laboratorio de Biología
Molecular de la Universidad Nacional sede Palmira.
Preparación de Soluciones Madre
Se indica para qué se utiliza cada reactivo y la forma de prepararlo.
TRIS (Hidroximetil amino metano). Es un tampón bioló- gico, cuya
función es mantener el pH de la solución constante (pH 7.0 pH 8.0).
Se prepara a pH 8.0. El peso molecular del TRIS es 121.14 gr. / grmol.
Se van a preparar 100 ml de solución madre de tris de concentración
1M Cálculos: 100 ml x 121.14 gr. / mol x 1 mol/1000 ml = 12.114 gr.
de TRIS Se pesan 12.114 gr. de TRIS y se agregan poco a poco a 70
ml de agua bidestilada, previamente colocados en un frasco de
autoclavado limpio. Se coloca la solución en el pHmetro y se ajusta el
pH a 8.0 con HCl. Luego se completa el volumen a 100 ml. Se
autoclava la solución y se guarda a 4°C.
EDTA (Ácido etilen diamino tetra acético). Es un agente quelante de
iones metálicos como Ca++ y Mg++. Inhibe la acción de las nucleasas
al no haber cofactores libres para su actividad y así protege al ADN.
Se prepara a pH 8.0. El peso molecular del EDTA es 372.24 gr. /
grmol. Se van a preparar 100 ml de solución madre de EDTA de
concentración 0.5 M Cálculos: 100 ml x 372.24 gr. / mol x 0.5 mol/1000
ml = 18.612 gr. de EDTA Se pesan 18.612 gr. de EDTA y se agregan
poco a poco a 70 ml de agua bidestilada, previamente colocados en
un frasco autoclavado limpio. Se coloca la solución en el pHmetro y
se ajusta el pH a 8.0 con perlas de Hidróxido de sodio. Si se pasa el
pH se agrega HCl en la cámara de extracción de gases. Luego se
completa el volumen a 100 ml. Se autoclava la solución y se guarda a
4°C
NaCl (Cloruro de sodio). Las sales aumentan el poder iónico de la
solución y ocasionan la precipitación del ADN. El peso molecular del
NaCl es 58.44 gr. / mol. Se van a preparar 100 ml de solución madre
de NaCl de concentración 5 M. Cálculos: 100 ml x 58.44 gr. /mol x 5
mol/1000 ml = 29.22 gr. de NaCl Se pesan 18.612 gr. de NaCl y se
agregan poco a poco a 70 ml de agua bidestilada, previamente
colocados en un frasco de autoclavado limpio. Luego se completa el
volumen a 100 ml. Se autoclava la solución y se guarda a 4°C
DETERGENTE CTAB
Es un surfactante catiónico. Sus usos incluyen la utilización como
solución tamponante para la extracción de ADN. Y es uno de los
compuestos del antiséptico tópico Cetrimide. El catión
cetiltrimetilamonio es un agente antiséptico efectivo contra bacterias y
hongos. El CTAB es un detergente catiónico que tiene la propiedad
de precipitar ácidos nucléicos y polisacaridos ácidos en soluciones de
baja concentración iónica. Bajo estas condiciones las proteínas y los
polisacáridos neutros permanecen en solución. En soluciones de alta
concentración iónica el CTAB forma complejos con las proteínas y
polisacáridos pero no precipita ácidos nucleicos. Por esta razón es
especialmente útil para precipitar ADN genómico de organismos que
producen grandes cantidades de polisacáridos como las plantas y
algunas bacterias Gram negativas (incluyendo algunas cepas de E.
coli). Bio Basic Inc. lo ofrece en presentaciones de 100 y 500 gramos,
en grado analítico.
 Alta pureza
 Efectivo como buffer en extracción de DNA, detergente o
antiséptico.
El Bromuro de hexadeciltrimetilamonio o Bromuro de
cetiltrimetilamonio ((C16H33)N(CH3)3Br) es una sal
de amonio cuaternario, uno de cuyos grupos alquilo es de gran
longitud, con actividad detergente. Se le conoce también por las
siglas CTAB, del inglés Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide.
Es un surfactante catiónico. Sus usos incluyen la utilización como
solución tamponante para la extracción de ADN. Y es uno de los
compuestos del antiséptico tópico Cetrimide.
El catión cetiltrimetilamonio es un agente antiséptico efectivo
contra bacterias y hongos.
Como cualquier otro surfactante forma micelas en solución acuosa. A
303 K (30 °C) forma micelas con un número de agregación de 75-120
(según el método de determinación, normalmente con una media de
~95) y un grado de ionización α (carga fracional) de 0,2 - 0,1 (de baja
a alta concentración).
Otros compuestos relacionados químicamente, como el cloruro de
cetiltrimetilamonio y el estearato de cetiltrimetilamonio se usan,
además, como antiséptico tópico y se pueden encontrar en diversos
productos de uso doméstico como champús y cosméticos.
El CTAB es un detergente catiónico que tiene la propiedad de
precipitar ácidos nucléicos y polisacaridos ácidos en soluciones de
baja concentración iónica. Bajo estas condiciones las proteínas y los
polisacáridos neutros permanecen en solución. En soluciones de alta
concentración iónica el CTAB forma complejos con las proteínas y
polisacáridos pero no precipita ácidos nucleicos. Por esta razón es
especialmente útil para precipitar ADN genómico de organismos que
producen grandes cantidades de polisacáridos como las plantas y
algunas bacterias Gram negativas (incluyendo algunas cepas de E.
coli).