Manual Practicas Citogenetica General 2016

Departamento de Biología Celular y Genética
Universidad Nacional Mayor de San Marcos

(Universidad del Perú, DECANA DE AMERICA)
Facultad de Ciencias Biológicas
Escuela Académico Profesional de Ciencias Biológicas
Escuela Académico Profesional de Genética y Biotecnología
Manual de Prácticas
CITOGENETICA GENERAL
“ the chromosomes do not obey

the laws of genetic: they make them”
(Darlington)
Blga. María Angélica Siles-Vallejos

Bach. Yajahaira Carbajal Gonzales
Universidad Nacional Mayor de San Marcos 2016 - I
INTRODUCCIÓN
La citogenética, tradicionalmente conocida como la fusión de dos disciplinas: la

genética y la citología, constituye en la actualidad una disciplina muy útil para la
comprensión de los fenómenos genéticos puesto va más allá de la simple
observación de los cromosomas.
La citogenética es hoy entendida como la disciplina que estudia las implicancias

genéticas de la estructura y el comportamiento de los cromosomas durante los
procesos de división celular. Permite también el estudio de la cromatina en el
núcleo interfásico aportando información sobre su organización y disposición en el
mismo.
Mucho se ha avanzado desde las primeras observaciones de los cromosomas con

técnicas simples, y en los últimos años el estudio de la citogenética se ha
concentrado en la estructura y evolución del genoma de diferentes especies, tanto
animales como vegetales, lo que posibilita el mapeo genético. Un mapa citogenético
permite posicionar genes, así como a los marcadores ligados a éstos con respecto a
los marcadores estructurales de regiones específicas del cromosoma.
La citogenética clásica nos permite conocer el conjunto de cromosomas de una

especie, determinando su morfología, su número, el contenido de ADN y
heterocromatina, la ubicación de las regiones organizadoras del nucléolo; en el
caso de los núcleos meióticos permite detectar homologías entre genomas
parentales en híbridos y poliploides, o el revelado de homologías crípticas, entre
otros.
Sin embargo, a pesar de su avance, la citogenética clásica no nos permite resolver

otro tipo de problemas como por ejemplo: el origen de los alopoliploides en
ausencia de marcadores visibles, o la presencia de reestructuraciones que no
alteren la morfología ni el número de cromosomas, la presencia de regiones
introgresantes o la distribución espacial de genomas o cromosomas, entre otros
muchos aspectos. Y una información citogenética detallada es indispensable para
combinar de forma coherente la información genética disponible con la estructura
física de los cromosomas, es así que, aprovechando el avance de las técnicas de
biología molecular, la citogenética se provee de herramientas que permiten el
estudio estructural y funcional detallado de los genomas, dando origen a lo que
llamamos citogenética molecular.
Actualmente la mayoría de las técnicas de la citogenética molecular se basan en la

tecnología de la hibridación in situ con fluorocromos o FISH, la cual abrió la
posibilidad de estudiar regiones específicas de la cromatina gracias a la
información derivada de la secuencia de ADN; esto a su vez es de suma utilidad en
la detección de alteraciones cromosómicas submicroscópicas numéricas o
Citogenética General | 2
estructurales, en el estudio detallado de segmentos cromosómicos específicos, las

regiones centroméricas y teloméricas, brindando la posibilidad de establecer
mapas de secuencias e identificación de cromatina extraña en nuevas líneas de
cultivo, en el caso de vegetales por ejemplo, así como de resolver muchas
preguntas, incluso a veces en ausencia de metafases, observando las señales de
núcleos interfásicos.
A esta tecnología se une la posibilidad técnica de aislar cromosomas enteros o

partes de éstos, para obtener librerías específicas de utilidad para el aislamiento
de secuencias y genes de interés presentes sobre un cromosoma particular. Es
decir, que en la actualidad el desarrollo de la citogenética va más allá de la
genómica descriptiva, puesto que las nuevas metodologías permiten combinar
técnicas de inmunocitogenética y de citogenética molecular para el estudio de la
arquitectura nuclear y de los procesos bioquímicos implicados en la transcripción
y la replicación del ADN.
OBJETIVOS GENERALES
1. Familiarizar al estudiante con las técnicas básicas de citogenética.

2. Familiarizar al estudiante en la observación y discriminación de
cromosomas vegetales y animales.
3. Familiarizar al estudiante en el análisis del comportamiento
cromosómico durante el ciclo celular.
Competencias y destrezas que deben ser desarrolladas:
A. Competencias Transversales:
1. Adquirir una actitud crítica ante la información recibida, a través de la

reflexión y discusión razonada de cuestiones genéticas y método
científico.
2. Desarrollar actitudes de colaboración y trabajo en equipo para el
buen ejercicio de su futura labor profesional.
B. Competencias Específicas:
a) Cognitivas
1. Adquirir los conocimientos básicos específicos de la Citogenética.

2. Integrar los conocimientos adquiridos, junto con los de otras
asignaturas, en el conjunto del saber científico.
b) Procedimentales / Experimentales
1. Manejar fuentes de información sobre temas relacionados con el

área.
2. Desarrollar capacidades de decisión y destreza en las técnicas
experimentales más usuales e importantes dentro del carácter
teórico-práctico de la citogenética.
3. Capacidad de sintetizar y relacionar aspectos de la Genética y la
Citogenética ya vistos con anterioridad.
4. Adquirir hábito y actitud para la resolución de problemas que puedan
ser trasladados en el futuro a problemas profesionales que se
planteen.
c) Actitudinales
1. Adquirir una actitud crítica ante la información recibida, a través de

la reflexión y discusión razonada de cuestiones genéticas y método
científico aplicado a la citogenética.
2. Coordinación con sus compañeros a través de un trabajo en equipo.
Capítulo I
Citogenética
Clásica
SESION 1
GENERALIDADES
Para la observación al microscopio, las muestras pueden ser preparadas en

forma temporal o directamente, en láminas permanentes. Para ello, se debe
seguir un procedimiento general que incluye varios momentos:
1.- SELECCIÓN DEL TEJIDO
En todos los casos, tanto en animales como en vegetales, ha de tenerse en

cuenta la disponibilidad tanto del espécimen como del tejido; igualmente
importante resulta el índice mitótico del tejido así como los reactivos
disponibles en el laboratorio. Lo más utilizado en citogenética animal es:
linfocitos de sangre periférica, células de médula ósea, cultivo de fibroblastos,
cultivo de líquido amniótico, hígado, bazo, orina, entre otros. En el caso de
vegetales, se utiliza las raíces primarias o secundarias germinadas a partir de
semillas, bulbos, o yemas.
2.- SEMBRADO DE MUESTRA
Cuando se trabaja con especímenes animales, la toma de muestra y la siembra

debe hacerse en condiciones estériles; igualmente, todo el material a utilizar
debe encontrarse esterilizado. Debe usarse guantes, mascarilla, bombas de
succión y flameo constantes durante el proceso de sembrado. En cada
sembrado deberá cambiarse de agujas y el material de vidrio utilizado así este
haya sido previamente esterilizado.
2.- PRE – TRATAMIENTO (PRE-FIJACION)
Para estudiar las características de los cromosomas, ya sea en tejidos

animales como en vegetales, se utilizan agentes que inhiben la formación del
huso acromático, lo que aumenta en forma significativa el número de
metafases. Otra consecuencia de la utilización de inhibidores es el
acortamiento y dispersión de los cromosomas lo que facilita su
individualización y conteo. Entre los inhibidores más utilizados tenemos:
Colchicina, Colcemid, para-Diclorobenceno, 8-hidroxiquinolina, entre otros.
4.- HIPOTONIZACION
Para obtener una buena dispersión de los cromosomas metafásicos, es

necesario romper la membrana celular. Para ello se utilizan las soluciones
hipotónicas como cloruro de potasio o citrato de sodio trisódico, a distintas
concentraciones. En el caso de tejidos vegetales, como se encuentra la pared
celular, la hipotonización suele ser un poco más difícil, generalmente se
mantiene el tejido en agua por tiempo más o menos prolongado.
5.- FIJACIÓN
La fijación tiene la finalidad preservar las estructuras celulares de interés. Los

fijadores pueden actuar de manera variable, pudiendo congelar las proteínas
sin combinarse con ellas o combinándose con ellas. Otros se reducen al
contacto con las sustancias orgánicas y forman un precipitado fino o pueden
actuar como oxidantes. El fijador a elegir depende de la muestra a estudiar,
pero el más utilizado es una solución de etanol (o metanol) y ácido acético
glacial, en una proporción de 3:1. El material debe permanecer por los menos
30 minutos en la solución fijadora. Si las muestras han sido fijadas
correctamente y son mantenidas en el congelador (-20ºC), pueden conservarse
durante años.
Es preferible preparar el fijador en el momento del trabajo y no conservar la
solución por mucho tiempo, puesto que se oxida y va perdiendo sus
propiedades.
6.- MONTAJE Y COLORACION
En el caso de utilizar la técnica de goteo de suspensión celular, hay que tener

en cuenta lo siguiente:
a) Las láminas deben estar limpias y desengrasadas; se ponen a

enfriar a 4°C en una mezcla de etanol: agua destilada 1:1, lo que
favorece la adherencia del tejido sobre la superficie.
b) El goteo de la suspensión celular se hace desde una distancia
aproximada de 40 a 50 cm, con la lámina ligeramente inclinada
en un ángulo de 30°, esto permite una mejor dispersión de las
células.
En el caso de tejidos vegetales, se utiliza la técnica del aplastado o “squash”;

previamente el tejido se ha macerado en el colorante por un tiempo
determinado, y el “squash” se realiza sobre la lámina portaobjeto agregando
gotas de colorante.
Los colorantes pueden ser ácidos, básicos o neutros. Estos términos se

refieren a los grupos funcionales coloreados. Consecuentemente, algunos tiñen
el núcleo, otros el citoplasma, o pueden ser específicos, pudiéndose emplear
dos o tres colorantes a la vez en un mismo corte.
La tinción puede ser:
a) Progresiva: en la cual, el tejido se deja permanecer en el colorante hasta

alcanzar la intensidad del color preciso.
b) Regresiva: en la cual, el tejido se deja sobre teñir para luego
diferenciarlo hasta conseguir la intensidad conveniente.
La tinción puede ser temporal o permanente y teñir toda la estructura o solo

sectores de la misma, dependiendo de la técnica empleada y del análisis
citogenética a seguir.
7.- APLASTADO O SQUASH
Consiste en presionar uniformemente el tejido con la finalidad de obtener una

sola capa de células (monocapa).
8.- MONTAJE
Es la etapa final de todo el proceso, consiste en preservar el preparado

citológico colocando el cubreobjeto de forma temporal (por días o semanas) o
permanente (por años). Para el montaje temporal se sella la laminilla con
parafina líquida o esmalte de uñas transparente. Para el montaje permanente
se utiliza Bálsamo de Canadá, o resinas sintéticas como Euparal, Entellan,
Merckoglass, entre otras, siendo la ventaja de estas últimas, de ser
transparentes.
SOLUCIONES
a) ADHESIVOS:
Se usan para impregnar las láminas portaobjetos con una cubierta que permita
la adherencia del material biológico.
Gelatina
Gelatina 5 grs
Alumbre de cromo y potasio 0,5 grs
Agua destilada 1000 cc
b) PRE - FIJADORES:
 8 - hidroxiquinolina 0,002M
8 - hidroxiquinolina 0,058 grs

 Colchicina 0,025%
Preparar solución de 0,025 gr de colchicina en 100 ml de agua destilada

o de una pastilla de 0,5 mg, se pulveriza y se disuelve en 5 ml de agua
destilada.
c) FIJADORES:
 Solución de Farmer (algunos autores le llaman Carnoy I)
Ácido acético glacial 25 cc

Etanol 75 cc
 Solución de Carnoy II
Alcohol etílico 60 cc
Ácido acético glacial 10 cc
Cloroformo 30 cc
d) COLORANTES
 Orceína Acética
Solución Madre:
Se calientan 55 cc de ácido acético glacial. Al iniciarse la ebullición, se
agregan 2 gr de Orceína; se agita la solución cuidadosamente y se
mantiene a fuego lento durante 10 minutos. Se deja enfriar y se filtra.
 Orceína Lacto Acética 1% (OLA)
Ácido láctico 50 cc
Ácido acético glacial 50 ml
Orceína 1 gr
Disolver la orceína en ácido láctico y luego adicionar ácido acético.

Filtrar.
 Orceína Acética 2%
Ácido acético 40% 70 cc

Orceína 1,5 – 2 gr
Se calienta el ácido en baño María y se junta con la orceína, enseguida

se adiciona el agua, cuidadosamente. Se deja enfriar y filtrar.
 Carmín Propiónico
Ácido propiónico 45 cc
Carmín 0,5 gr
 Giemsa
Solución Madre:
Disolver 1 gr de Giemsa en 84 cc de metanol y 50 cc de glicerina.
Colocar la solución en baño María a 60°C, agitar continuamente durante
10 minutos. Dejar enfriar y posteriormente, filtrar.
Solución de trabajo:
Diluir la solución madre en buffer Sorensen, de acuerdo a la
concentración que requiera el Giemsa.
e) VARIOS
 Solución Targa
Ácido acético 45 cc
Ácido láctico 25 cc
 Buffer Sorensen, pH 6,8
Preparar dos soluciones:
Solución A:
Disolver 16,0848 gr de fosfato dibásico de sodio en 1 litro de agua
destilada
Solución B.
Disolver 8,1654 gr de fosfato ácido de potasio en 1 litro de agua
destilada
Mezclar 9,0 ml de A con 10,5 ml de B para obtener un pH 6,8. ajustar el

pH, si es necesario. Guardar en frasco estéril y en refrigeración.
 KCl 0,075M
Diluir 5,592 gr de KCl en 1 litro de agua bidestilada.
 Solución Salina Citratada (2xSSC)
Disolver 17,55 gr de cloruro de sodio y 8,82 gr de citrato de sodio en 1

litro de agua destilada. Conservar en recipiente cerrado y mantener en
refrigeración.
 HANKS STOCK
Solución A:
KCl 8 gr
NaCl 160 gr
Disolver en 600 cc de agua destilada y llevar a 1000 cc. Agregar 2

cc de cloroformo.
Solución B:
Na2HPO4 .12 H2O 2,4 gr

KH2PO4 1,2 gr
Dextrosa 10 gr
Disolver en 600 cc de agua destilada, agregar 80 cc de rojo fenol 0,5%,

completar a 1000cc. Agregar 2 cc de cloroformo.
Tomar 50 cc de solución A y 50 cc de solución B, completar a 1000 cc.
 Hidróxido de Bario
Diluir 5 gr de hidróxido de bario en 100 cc de agua destilada. Preparar

en el momento de usar. Antes de usar, debe filtrarse la solución.
 Nitrato de Plata acuoso, 2%
Disolver 2 gr de plata en 100 cc de agua destilada.
 Tripsina, 0,5%
a) Medio Diluyente:
NaCl 8 gr
KCl 0,2 gr
Na2HPO4.12H2O 0,063 gr
Dextrosa 2 gr
Disolver en el mismo orden en 600 ml de agua destilada y luego

completar a 1 litro.
b) Solución Tripsina 0,5%
Disolver lentamente 5 gr tripsina en 1L de diluyente y filtrar. Para

disolver, se agrega el diluyente suavemente y al matraz se le agita en
círculo para evitar que se produzcan grumos. Luego, se sigue agregando
diluyente hasta completar 1 litro. Se agregan 2 cc de rojo fenol al 0,5% y
se deja a 37°C por dos horas.
 Solución para lavar láminas
3 partes de etanol
1 parte de HCl
SESION 2
OBSERVACION DE MICRONÚCLEOS EN CÉLULAS

EPITELIALES DE LA MUCOSA ORAL
I. INTRODUCCIÓN
Los micronúcleos (MN) son pequeños cuerpos

extra nucleares que se forman durante la
división celular por fragmentos cromosómicos
acéntricos o cromosomas completos que no
segregaron adecuadamente, quedando
varados en el citoplasma, para posteriormente
formar su propia membrana nuclear y
posicionarse dentro del citoplasma y guardando
propiedades similares a las del núcleo principal.
Su número aumenta ante un efecto genotóxico

por lo que son utilizados como una prueba de
monitoreo de daño genético en una amplia
gama de células y organismos. Se pueden
analizar a partir de mucosa bucal o nasal,
células epiteliales de vejiga, linfocitos de sangre.
La utilización de células epiteliales de la mucosa oral como biomarcador de

riesgo genético visualizando micronúcleos ha sido bien documentada desde los
años ochenta. Luego de varios estudios, los investigadores postularon que este
sistema puede utilizarse para el estudio de efectos genotóxicos.
En la actualidad y gracias a la implementación de diferentes técnicas, como el

uso de anticuerpos contra el cinetocoro, la hibridación in situ de sondas con
marcas fluorescentes (FISH) o la amplificación in situ de secuencias genéticas
(PRINS), se ha logrado la identificación de micronúcleos con cromosomas
específicos, además de obtener información del mecanismo de genotoxicidad,
distinguiendo entre un efecto clastogénico (fragmentos de cromosomas) y un
efecto aneugénico (pérdida de cromosomas). La diferencia entre un efecto u
otro se hace con respecto al centrómero, es decir, si en el MN se identifica la
presencia del centrómero, se interpreta como la pérdida de un cromosoma y,
por lo tanto, un efecto aneugénico; mientras que la falta de detección del
centrómero en un MN se explica como un fragmento cromosómico producto de
un evento clastogénico, aunque es mediante el uso combinado de sondas
específicas para el centrómero y los telómeros que se puede hacer una
interpretación más acertada del tipo de daño que dio origen a un MN (Fenech
et al., 2011b).
EJEMPLOS:
CÉLULAS ANIMALES
CÉLULAS ANIMALES
SESION 3
OBSERVACION DE CROMOSOMAS MITOTICOS EN

VEGETALES
i. INTRODUCCION
Usualmente los libros de texto, cuando se refieren al estudio de la mitosis y de

la meiosis, ponen énfasis en la diferenciación de los distintos estadios de la
división celular, más que en los hechos que ocurren y en el significado de éstos
en el proceso general de la mitosis y la meiosis.
La mitosis es el proceso de división celular que mantiene constante el número

de cromosomas. El cromosoma mitótico se observa durante este proceso,
siendo la metafase la etapa en la que alcanza su máxima condensación.
Cada cromosoma está compuesto por una larga fibra de cromatina condensada
que presenta un alto grado de heterogeneidad, conformando una serie de
estructuras, las cuales se mantienen a lo largo de todo el ciclo celular,
permitiendo la caracterización de la especie.
La primera estructura que salta a la vista se refiere a una estrangulación o

constricción primaria, que separa la fibra en dos porciones o brazos de los
cromosomas, esta constricción primaria recibe el nombre de centrómero. El
centrómero no se tiñe con colorantes básicos y de acuerdo a la posición que
ocupa a lo largo de la fibra, le confiere al cromosoma una morfología
determinada, la cual se mantiene constante de una generación a otra, y es la
misma para todos los individuos normales de la misma especie, por lo que
constituye un primer marcador citogenético.
En algunos cromosomas, existe una segunda estrangulación, llamada

constricción secundaria, separando un fragmento de cromosoma que recibe el
nombre de satélite, cuyo tamaño y posición son fijos cuando existe, por lo que
es considerado como un marcador citogenético. En esta constricción suele
ubicarse la región organizadora del nucléolo (NOR).
Los extremos de los cromosomas reciben el nombre de telómeros o regiones

teloméricas. Estas regiones confieren estabilidad al cromosoma y presentan
una relación con la membrana nuclear, la cual se evidencia con más claridad
durante la meiosis.
Para la obtención de cromosomas mitóticos de manera que puedan ser

adecuadamente observados e individualizados, las técnicas citogenéticas
utilizan un paso previo a la fijación, en el cual se trata el tejido, ya sea vegetal o
animal, con sustancias inhibidoras de la formación del huso mitótico,
permitiendo acumular un mayor número de metafases. Estos inhibidores del
huso ocasionan, también, el acortamiento de los cromosomas lo que facilita su
individualización y conteo.
En general, en el caso de los vegetales, se utilizan las raíces secundarias que
puedan originarse a partir del enraizamiento principal de un esqueje, bulbo,
tubérculo, semilla, etc. Hay que tener en cuenta que las raíces germinadas a
partir de semillas casi siempre se recubren de sustancias de reserva, lo que
dificulta la observación de los cromosomas.
El estudio de la mitosis en los diferentes organismos es interesante porque

permite la observación de forma directa de la base física de la herencia y la
forma de transmisión de los genes de una célula a otra. Además, es útil por su
aplicación en citotaxonomía y mejora genética de plantas y animales, debido a
que se puede observar la morfología cromosómica así como su número, lo que
proporciona más caracteres de clasificación de las especies.
En nuestro caso, observaremos el comportamiento de los cromosomas durante

la metafase mitótica identificando los diferentes sectores que los componen.
II. OBJETIVOS
 Individualizar los cromosomas e identificarlos.

 Recuento del número cromosómico
 Reconocimiento de la morfología cromosómica
III. MATERIALES
 Raíces de Vicia faba, Allium  Hoja de afeitar o de bisturí

cepa, Allium sativum, Lens  Lunas de reloj
culinaris, Pisum sativum.  Papel filtro
 Solución de Colchicina 0,5%  Pinzas y estiletes
 Carnoy  Papel lente
 Orceína lacto acética 2%
 Láminas y laminillas
IV. PROCEDIMIENTO.
a) Obtención de cromosomas mitóticos en vegetales
1. Coloque las raíces en solución de colchicina 0,5% durante 2

horas.
2. Enjuagar con agua destilada, 5 minutos
3. Fijar en carnoy, 30 minutos

4. Enjuagar con agua destilada, 5 minutos
5. Macerar en HCl 1N, 10 minutos a temperatura ambiente.
6. Agregar solución Targa, 15 minutos
7. Colorear las raíces con orceína acética 2%, 20 minutos
8. Pase la raíz a una lámina y corte el ápice
9. Añada 1 ó 2 gotas de OLA 2% fresca
10. Cubra con la laminilla y con la ayuda de un lápiz, golpee
suavemente sobre el tejido para que éste se disperse.
11. Realice el aplastado o “squash” en forma más o menos fuerte,
ayudándose del papel filtro.
12. Observe al microscopio.
Nota: Es importante establecer el tiempo de pre - fijación para

cada tipo de muestra utilizada.
b) Observación de metafases polares
Observe las metafases polares, identifique e individualice los

cromosomas ubicando las estructuras de los mismos.
V. ACTIVIDADES
1. Realice esquemas de sus observaciones.

2. Determine el número diploide de la especie con la cual está trabajando.
3. Determine si hay presencia de constricción secundaria en el
complemento; si ésta existiera, determine su número y en qué
cromosoma(s) está.
4. Fotografíe las mejores metafases, a 100x.
VI. EJEMPLOS
Figura 1. Cromosomas mitóticos de Vicia faba, “haba”; la flecha señala la

constricción secundaria
Figura 2. Cromosomas mitóticos de Vicia faba, “haba”; la flecha señala

la constricción secundaria seguida de la región SAT.
Figura 3. Cromosomas mitóticos de Allium cepa, “cebolla”; la flecha señala el

centrómero
SESION 3
OBSERVACION DE CROMOSOMAS MITOTICOS EN

MAMÍFEROS
I. INTRODUCCION
En mamíferos, la obtención de cromosomas mitóticos se da en aquellos tejidos
en los que las mitosis son más frecuentes. Estos tejidos pueden ser por
ejemplo: sangre periférica, médula ósea, orina, hígado, entre otros. Hay que
tener en cuenta que las técnicas citogenéticas difieren según el tejido utilizado.
En animales de fácil obtención y que pueden ser sacrificados, el tejido más

utilizado es la médula ósea, ya que es un tejido que renueva sus elementos
constantemente. En el caso de animales difíciles de colectar o que no deben
ser sacrificados, se utilizan las técnicas de cultivo de tejidos.
Para elevar el número de metafases a obtener, se inyecta Colchicina al animal

vivo, la cual interfiere en la formación del huso mitótico. En el caso de animales
viejos o mantenidos en cautiverio por largo tiempo, se les inyecta una
suspensión de levadura lo que induce la proliferación de leucocitos (Lu y Elder,
1980).
Es importante el uso de soluciones hipotónicas ya que permiten la separación

correcta de los cromosomas, evitando superposiciones. Estas soluciones
fueron utilizadas por primera vez por Hsu (1952) y su empleo fue decisivo para
determinar correctamente el número diploide en seres humanos por Tjio y
Levan (1956).
II. OBJETIVOS
 Observación de cromosomas mitóticos en mamíferos

 Recuento del número cromosómico
 Reconocimiento de la morfología cromosómica
III. MATERIALES
 Ratones blancos adultos (entre 5  Carnoy fresco

y 8 meses de edad), uno por  Giemsa 4%
cada sub grupo de trabajo  Láminas y laminillas
 Solución de colchicina 0,01% (1  Estuche y tabla de disección
ml/100 gr peso corporal)  Tubos de centrífuga de
 Jeringa hipodérmica de polietileno y con tapa rosca
tuberculina  Pipetas Pasteur, nuevas
 Cloroformo  Beakers
 Solución de KCl 0,075 M  Recipientes de vidrio
 Vasos de coloración de vidrio  Microscopio óptico

 Estufa regulada  Papel lente
 Refrigeradora
IV. PROCEDIMIENTO
A. Obtención de los cromosomas:
1. Inyectar la colchicina 0, 01% a los ratones, intraperitonealmente. Dejar

actuar por espacio de 1 hora. Cuide que el animal no sufra durante el
proceso.
2. Sacrificar al animal en forma rápida y cuidadosa, evitando en todo
momento sufrimiento por parte del animal.
3. Obtener los huesos largos completamente limpios.
4. Con una jeringa de tuberculina previamente cargada con solución
hipotónica, lavar la médula ósea presente en los huesos y depositarla en
un tubo de centrífuga con 5 ml de solución hipotónica. Completa hasta 8
ml de solución hipotónica. Homogenizar con pipeta Pasteur.
5. Incubar a 37°C por 40 minutos.
6. Centrifugar a 1200 rpm, por 10 minutos. Eliminar el sobrenadante.
7. Agregar 4 cc de solución fijadora fría. Homogenizar suavemente con
pipeta Pasteur.
8. Centrifugar a 1200 rpm por 10 minutos. Eliminar el sobrenadante.
9. Agregar 1 cc de solución fijadora fría, gota a gota sobre el sedimento.
Adicional 4 cc de solución fijadora. Homogenizar y dejar a temperatura
ambiente por 20 a 30 minutos.
10. Centrifugar a 1200 rpm por 10 minutos.
11. Lavar el material con solución fijadora fría, dos o tres veces.
12. Eliminar el sobrenadante hasta dejar un volumen pequeño de
sedimento. Agregar solución fijadora y homogenizar.
13. Dejar reposar la suspensión en el fijador como mínimo 1 media hora o
durante toda la noche en refrigeración.
Fig. 1: Ejemplo de
cómo inyectar a un
ratón por la vía
intraperitoneal.
B. Preparación de láminas:
Utilizar láminas nuevas y colocarlas en un recipiente con agua destilada y

etanol (1:1), refrigerarlas.
Las láminas preparadas serán coloreadas con el siguiente procedimiento:
1. Sacar las láminas y dejar caer 2 gotas de la suspensión, evitando la

sobreposición.
2. Dejar secar las láminas a temperatura ambiente
3. Colorear con Giemsa 4% por 8 a 12 minutos. Monitorear la coloración.
4. Enjuagar con buffer Sorensen o agua destilada y secar al ambiente
5. Observar al microscopio
6. Fotografiar las mejores placas.
V. ACTIVIDADES
1. Identifique las características del complemento cromosómico.
2. Fotografíe la mejor metafase, a 100x.
VI. EJEMPLOS
A B
Figura1(A – C): Cromosomas

mitóticos de Mus musculus.
Observe cómo va
modificándose la fibra,
conforme avanza el proceso
de condensación.
NOTA: Estas placas metafásicas corresponden al trabajo

realizado por tus compañeros de años mayores.
SESION 4
OBSERVACION DE CROMOSOMAS MEIOTICOS EN

VEGETALES Y ANIMALES
I. INTRODUCCIÓN
Las transformaciones que sufren los cromosomas a través de todo el proceso

meiótico son muy importantes para la comprensión de la genética. En el
transcurso de la meiosis, el aspecto de los cromosomas se modifica
notablemente, sufriendo espiralizaciones y acortamientos, se entrecruzan y
desespiralizan; éstos son los detalles que se analizarán en la presente práctica.
Para la obtención de cromosomas meióticos en vegetales se utilizan botones

florales muy tiernos y en el caso de animales es muy útil el tejido gonadal,
usualmente los testículos, en los que se puede encontrar todos los tipos
celulares que intervienen en la espermatogénesis.
La aplicación de las técnicas que aquí se presentan se dirige especialmente a

la obtención de microesporocitos o espermatocitos en los diversos estadios de
la Meiosis, a fin de permitir la observación y caracterización de los distintos
componentes del núcleo meiótico, así como sus interrelaciones a lo largo del
proceso de división.
II. OBJETIVOS
 Observación de las transformaciones sufridas por los cromosomas

durante el proceso meiótico.
 Analizar fenómenos de sobrecruzamiento, coorientación y segregación
en condiciones normales.
III. MATERIALES
 Botones florares tiernos de  Fijador metanol-ácido acético

Tradescantia virginiana (3:1)
 Testículos de Mus musculus,  Pinzas
adulto  Estiletes
 Testículos de Ortópteros  Placas petri
machos, adultos  Lunas de reloj
 Carnoy  Tubos de centrífuga de
 Carmín propiónico al 1% polietileno, con tapa rosca
 Giemsa 2%  Mechero de alcohol
 Citrato de sodio al 1%  Láminas y laminillas
IV. PROCEDIMIENTO
 TEJIDO VEGETAL (Darlington & La Cour, 1970 )

Modelo: Tradeschantia virginiana
1. Retire los botones más tiernos de Tradeschantia virginiana y con la ayuda

de un estilete, abra los botones y colóquelos en solución Carnoy durante 40
minutos.
2. Identifique las anteras de la flor y retírelas.
3. Coloque las anteras sobre una lámina portaobjeto que contenga carmín
propiónico.
4. Bajo un microscopio estereoscópico divida las anteras en dos partes y
extraiga la masa de esporocitos presionando las anteras con la punta del
estilete. Las paredes de las anteras deberán luego ser removidas y
desechadas. Espere a que el colorante penetre el material, cinco minutos
aproximadamente.
5. Colocar una laminilla cuidadosamente sobre la gota de carmín con los
esporocitos.
6. Calentar suavemente la preparación sobre la flama del mechero, evitando
que la muestra se seque.
7. Realice el squash.
8. Observe al microscopio. Si la lámina contiene granos de polen, descártela.
Si por el contrario, presenta los estados de meiosis, proceda a sellar la
lámina con esmalte de uñas transparente.
9. Observe el mayor número de fases de la meiosis y visualice los fenómenos
más representativos.
EJEMPLO:
Figura 1: Metafase I, lineal, Tradescantia sp. Fotografia

tomada por los estudiantes del curso 2008 – I.
 EN ORTOPTEROS:
Modelo: Gryllus assimilis, Acheta domesticus
1. Cortar en forma transversal la parte inferior del abdomen con una tijera de
disección. Después, cortar perpendicularmente al primer corte hasta
encontrar los testículos.
2. Seleccionar los testículos y se fijarlos en etanol - ácido acético 3:1 ó 2:1
por 0,5 a 2 horas como mínimo. El material fijado puede conservarse en
refrigerador.
3. Pasar los testículos fijados a una solución de alcohol 70%, 10 minutos. Con
cada testículo se pueden obtener unos 10 preparados.
4. Colocar en un portaobjetos, una pequeña porción de tejido y, sobre él, una
gota de carmín acético. Disgregar el material con una lanceta.
5. Cubrir con la laminilla siliconizada. Flamear suave e intemitentemente,
cuidando de no calentar demasiado.
6. Realizar el “squash”, suave, sobre una superficie plana. Retirar el exceso de
colorante con papel filtro.
7. Sellar el preparado con cera, parafina o esmalte transparente para uñas.
Después de 2 horas puede hacerse permanente.
8. Observar al microscopio y fotografiar.
EJEMPLO:
Figura 2: Cromosomas meióticos de Gryllus sp. Fotografías

tomadas por estudiantes durante las prácticas del curso.
…CUANDO LA MUESTRA HA ESTADO FIJADA UNA SEMANA O MÁS:
9. Colocamos los testículos en agua destilada para su hidratación durante 10

minutos. A partir de este momento realizar todo el proceso en el mismo
recipiente, preferiblemente plástico y no vidrio. No utilizar ningún material
metálico.
10. Hidrolizar los testículos en HCl 5N durante 30 min. Transcurrido este tiempo
se lavan en abundante agua destilada.
11. Posteriormente se introducen en reactivo de Schiff durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Este proceso es preferible realizarlo en oscuridad.
12. Se lavan los testículos, que tendrán un color violeta, en agua sulfurosa y
posteriormente en agua del caño, donde se almacenarán hasta la confección
de los aplastados.
13. Separamos un par de túbulos del testículo y los colocamos sobre un
portaobjetos. Sobre ellos se coloca inmediatamente una gota de ácido
acético al 50% en agua destilada y se deja un par de minutos. ¡Cuidado, no

dejar secar el material!.
14. Se coloca sobre el túbulo un cubreobjetos y utilizando la punta de un lápiz y
con presión muy suave se dispersa el material.
15. Con un trozo de papel de filtro se elimina el ácido acético que ha rebosado
por los costados del cubreobjetos y, con cuidado de no moverlo, se realiza
el squash.
16. Observar al microscopio y fotografiar a 100x.
 EN MAMÍFEROS (Evans,E.O.; 1964)

Modelo: Mus musculus
1. Separar y descartar la albugínea. Separar los túbulos seminíferos en gotas

de citrato de sodio al 1%
2. Homogenizar con bisturíes cruzados, cortando finamente repetidas veces.
3. Agregar más citrato y pipetear hasta obtener una suspensión celular de
color lechoso.
4. Transferir a un tubo de centrífuga. Agregar citrato de sodio hasta completar
de 3 a 5 ml. Homogenizar con la pipeta Pasteur.
5. Dejar decantar por 10 a 30 minutos (el tiempo varía según la especie).
Extraer el pellet grueso con una pipeta Pasteur, cuidando de no agitar el
sobrenadante.
6. Transferir a una placa petri y homogenizar nuevamente con bisturí y pipeta.
Transferir a otro tubo de centrífuga y agregar citrato de sodio al 1% hasta
completar 3 a 5 ml. Homogenizar.
7. Centrifugar ambos tubos a 650 rpm por 10 minutos.
8. Eliminar el sobrenadante y agregar solución fijadora sin remover el fondo.
Dejar 30 minutos a temperatura ambiente. Homogenizar y dejar por otros 5
minutos.
9. Centrifugar a 800 rpm por 10 minutos, lavar una vez más con fijador fresco.
10. Gotear la suspensión en una lámina limpia y fría. Dejar secar al aire.
11. Colorear con Giemsa al 2% de 20 a 30 minutos. Enjuagar con Sorensen o
agua destilada.
12. Observe al microscopio
13. Fotografiar las mejores placas a 100x.
EJEMPLO:
Figura 3: Cromosomas meióticos de Mus musculus.

Fotografías tomadas por los estudiantes durante las
prácticas del curso.
V. ACTIVIDADES
 Esquematice y describa las características más importantes de la meiosis.

 Identifique cromómeros, quiasmas.
 Dibuje un único bivalente e identifique las cromátides hermanas, los
cromosomas homólogos y los puntos de quiasmas.
 En las células en diploteno, diacinesis y metafase I, esquematice los
distintos tipos de bivalentes, señalando preferencialmente las distintas
cromátidas
 Marcar los quiasmas intersticiales y terminales con una pequeña flecha,
colocando las inciales qi y qt, en diploteno, diacinesis y metafase I. Señale
bivalentes abiertos y cerrados.
SESION 5
BANDAS G
I. INTRODUCCIÓN
La técnica de bandeo G es la más utilizada

dentro de los bandeos cromosómicos. En el
patrón de bandas se destacan las zonas de
secuencias repetitivas A-T, resultando un
patrón diferencial de bandas que se observa
en cada cromosoma.
La técnica de bandeo G implica el

tratamiento de los cromosomas con una
enzima proteolítica y su posterior tinción con
el colorante Giemsa. Las zonas de afinidad
por el colorante se tiñen fuertemente Foto: Morales & Fernández; 2004-I
formando las bandas, y las zonas que no presentan afinidad por el colorante
permanecen más claras formando las interbandas.
Actualmente existen muchos tipos de Bandeo G; en la presente práctica

utilizaremos la técnica GTC, es decir, bandas G por tratamiento enzimático con
tripsinas y utilizando Giemsa.
II. OBJETIVO
Conocer el patrón de bandas G en Mus musculus.
III. MATERIALES
IV. PROCEDIMIENTO
1. Láminas preparadas y previamente envejecidas de 5 a 7 días.

2. Sumergir las preparaciones en solución Hanks sin Ca++ y sin Mg++ por
10 minutos a 37°C.
3. Transferir a una solución de tripsina 0,5% (4-10°C) por 15 a 20
segundos.
4. Lavar nuevamente en agua destilada (4-10°C) por 15 a 20 segundos.
5. Teñir con Giemsa al 2% en buffer fosfato, pH 6,9 por 15 a 30 minutos.
6. Lavar con agua corriente – agua destilada – agua destilada
7. Dejar secar al ambiente.
8. Observar al microscopio y fotografiar las mejores placas.
V. ACTIVIDADES
 Identificar las bandas G y compararlas con el patrón.
VI. EJEMPLOS:
Figura 1(a, b): Bandas G (flechas) en cromosomas mitóticos de M.

musculus. Fotografías tomada por estudiantes del curso.
SESION 6
BANDAS C
I. INTRODUCCIÓN
Las Bandas C se visualizan como una tinción preferencial de algunas regiones

cromosómicas, como la región pericentromérica, región telomérica, la
constricción secundaria y el cromosoma y de algunas especies. La tinción de
las regiones mencionadas permite identificar la heterocromatina constitutiva,
que se caracteriza por la presencia de ADN altamente repetitivo.
El método se basa en un proceso de desnaturalización del ADN en un medio

alcalino seguido de una renaturalización del mismo en soluciones salinas, con
la posterior tinción con Giemsa. En las zonas de heterocromatina constitutiva,
el ADN renaturaliza más rápido lo que origina el bandeado.
Para analizar las láminas preparadas ha de tenerse en cuenta lo siguiente:
Tabla 1: Grado de denaturación
PLACAS METAFÁSICAS DENATURACION

a) Núcleos enteros y teñidos.
Cromosomas totalmente teñidos INSUFICIENTE
b) Núcleos vacíos y escasa tinción.

Cromosomas deformes y sin tinción. EXCESIVA
c) Núcleos parcialmente digeridos y teñidos.

Cromosomas con escasa tinción y fuerte tinción BUENA
en centrómero y telómero.
Para evaluar el rendimiento de la técnica se debe realizar un recuento de

placas con cromosomas bandeados en 10 campos diferentes:
Tabla 2: Evaluación de rendimiento
PLACAS METAFASICAS RENDIMIENTO

0 Malo
1–4 Regular
5 ó más Bueno
II. OBJETIVO
 Identificación de Bandas C en cromosomas mitóticos de A. cepa y V. faba
III. MATERIALES
 Láminas previamente  Giemsa 2%

envejecidas de V. faba y A. cepa  Buffer fosfato, pH 6,9
 Solución de colchicina 1%  Agua destilada
 Carnoy  Papel filtro
 Solución Targa  Hoja de afeitar, nueva
 Solución de HCl 1 N  Papel lente
 Hielo seco  Estufa regulada
 Etanol  Baño María
 Hidróxido de Bario 4%  Microscopio óptico
 Solución 2xSSC
IV. PROCEDIMIENTO
a) Obtención de cromosomas mitóticos:

1. Colocar las raíces en el pre – fijador durante el tiempo ya
establecido para cada especie.
2. Fijar en carnoy, 24 horas a 20°C, luego por una hora a 40°C.
3. Pasar a Carnoy fresco durante 5 minutos a temperatura ambiente.
4. Pasar las raíces a HCl 1N, a 37°C por 3 minutos
5. Colocar las raíces en solución Targa por 5 minutos.
6. Hacer el squash.
7. Sellar las láminas con esmalte transparente y mantenerlas en
refrigeración por 5 días, como mínimo. (envejecimiento)
b) Técnica de bandeo C:
1. Transcurrido el tiempo de envejecimiento de láminas, levantar la
laminilla con hielo seco.
2. Sumergir las láminas en etanol absoluto por 1 minuto.
3. Dejar secar al ambiente.
4. Coloque las láminas en solución de hidróxido de Bario a 50°C
durante 4 minutos.
5. Lavar las láminas cuidadosamente con agua destilada durante 10
minutos.
6. Coloque las láminas en solución 2x SSC a 60°C por 45 minutos.
7. Lavar con agua destiladA, tres veces.
8. Colorear con Giemsa 2% durante 60 minutos a temperatura
ambiente.
9. Enjuagar en buffer fosfato.
10. Secar al aire caliente
11. Observa al microscopio y fotografiar las mejores placas.
V. ACTIVIDADES
 Presente una tabla que muestre el rendimiento de la técnica.

 Identifique las bandas C a lo largo de los cromosomas.
 Fotografíe la mejor placa.
VI. EJEMPLOS
Figura 1. Obsérvese los cromómeros intensamente teñidos en los

núcleos profásicos (a). Presencia de bandas C (b). Fotografía tomada por
estudiantes durante las prácticas del curso.
Figura 2. Bandas C (b) en cromosomas mitóticos de A. cepa. La

flecha señala las bandas características, en la región telomérica.
Fotografía tomada por estudiantes durante las prácticas del curso.
SESION 7
CROMOSOMAS POLITÉNICOS
INTRODUCCIÓN
Drosophila melanogaster presenta cuatro

pares de cromosomas, tres autonómicos
(II, III y IV) y un par sexual.
Los cromosomas politénicos se originan
por la endorreplicación del ADN
genómico. Las células de las glándulas
salivares de Drosophila detienen sus
divisiones mitóticas después de 18 horas
de desarrollo larvario, sin embargo, la
replicación del ADN y el crecimiento
celular continúan por endorreplicación.
Esta replicación del ADN afecta
Foto: Morales & Fernández, 2004-I
principalmente a la eucromatina, debido a
que la heterocromatina no se politeniza. Los cromosomas homólogos se
aparean entre si, lo que se conoce como apareamiento somático. Asimismo,
se fusionan los centrómeros de todos los cromosomas dando lugar al
cromocentro, que es de naturaleza.
Entonces tenemos que en Drosophila, los cromosomas se reúnen en el

cromocentro, alrededor del cual se irradian 5 brazos muy largos y uno muy
corto (el par IV y el cromosoma Y del macho)
OBJETIVO
 Obtención de cromosomas politénicos en glándulas salivales de larvas de

tercer estadio de Drosophila melanogaster.
MATERIALES
 Larvas de D. melanogaster  Láminas gelatinizadas

 Solución Salina al 0,9%  Laminillas siliconizadas
 Fijador Carnoy  Placas petri
 Solución Targa  Papel filtro
 Orceína lacto acética  Papel lente
 Pinza de punta fina  Microscopio estereoscópico
 Estiletes entomológicos  Microscopio óptico
PROCEDIMIENTO
1. Disección de las larvas en solución salina: separar las glándulas

salivales con la ayuda de estiletes.
Fig. 2: A) Vista interna de la anatomía de una

larva de 3er estadío de D. melanogaster. B)
Proceso de extracción de glándulas salivales.
Es importante identificar la boca y el ano de la
larva.
2. Fijación de las glándulas salivales en una laminilla siliconizada que

contiene una gota de carnoy, durante 3 minutos.
Fig. 3: Glándulas salivales aisladas de D. melanogaster.

Fuente: http://ciber-genetica.blogspot.com/
2014/09/material-para-la-practica-de.html
3. Agregar solución Targa, durante 5 – 8 minutos.

4. Finalmente se adiciona una gota de orceína lacto acética (OLA), dejar
colorear por 10 a 15 minutos.
5. Colocar sobre la laminilla una lámina gelatinizada y virar de inmediato,
evitando perder la muestra.
6. Realizar el squash, suavemente. Sellar la lámina.
7. Observar al microscopio
8. Fotografiar las mejores placas.
ACTIVIDADES
Identifique:
1. El cromocentro y los brazos irradiando a su alrededor.
2. Detecte la posible existencia de puffs.
3. Observe la presencia de bandas, interbandas, posibles ligaciones,
número de brazos.
4. Fotografíe la mejor placa y esquematice señalando sus observaciones.
EJEMPLOS
Fig. 4: Cromosoma politénico de D. melanogaster. Se

observa la puff en el brazo 3L (a) y la formación de
asinapsis (b).
Fig. 5: Cromosoma politénico de D. melanogaster. Se

observa la presencia del cromocentro y los brazos del
cromosoma.
SESION 9
MORFOLOGÍA DE LOS CROMOSOMAS
I. INTRODUCCIÓN
El cariotipo es una herramienta citogenética que sirve para caracterizar a las

especies animales y vegetales, tomando como base el tamaño y forma de los
cromosomas. Constituye una valiosa herramienta como fuente de datos
importante para la citogenética comparada.
Para el estudio de la morfología de los cromosomas se tiene en cuenta,

tamaño, número y forma, que son todas características del complemento.
Estas características son siempre constantes, sea cual fuere la célula
considerada, mientras pertenezca a un determinado tejido, afirmación que es
válida para todos los individuos de la misma especie.
Para la identificación de los cromosomas y su posterior clasificación se tiene en

cuenta la posición del centrómero, la cual determina una longitud en los brazos
cromosómicos; estos datos permiten establecer índices en base a los cuales,
finalmente, se determina la morfología cromosómica y el cariotipo del
organismo en estudio.
a) Índice Centromérico (IPC):
b) Índice Braquial (IB)
c) Índice de Proporcionalidad de Brazos (IPB) o Índice

Cromosómico
La nomenclatura usada para la descripción de la morfología de los

cromosomas es la propuesta por Levan et al. (1964). De acuerdo con ello, los
cromosomas se asignan a cuatro categorías morfológicas diferentes según el
índice centromérico:
INDICE METACENTRICO SUBMETACENTRICO ACROCENTRICO TELOCENTRICO
IPC 0,50 – 0,38 0,38 – 0,25 0,25 – 0,12 - 0,12
1,0 – 1,70 1,70 -3,00 3,00 – 7,00 + 7,00

IB
IPB 1,0 – 0,59 0,59 – 0,33 0,33 – 0,14 0,01 – 0,13
Cuando los valores se hallan muy en el límite se indican ambas categorías,

separadas por un guión (ejemplo: m-sm).
Para realizar la identificación de los cromosomas debemos de analizar por lo

menos 10 placas metafásicas, las cuales deben presentar cromosomas
enteros, en un solo plano y dispersos.
II. MATERIALES
 Fotografías de placas metafásicas

 Regla de metal, 10 cm.
 Lápiz 2B
 Compás
 Papel Canson
 Cartulina negra
III. PROCEDIMIENTO
1. Copiar a lápiz el contorno de los cromosomas de la fotografía en papel

canson. Si los cromosomas están sobrepuestos, trate de copiarlos
separadamente. Numere los cromosomas al azar.
2. Fije lo mejor posible el punto medio que correspondería al centrómero de
cada cromosoma.
3. Con una regla, compás o curvímetro, mida la longitud de cada brazo, desde
el punto medio hasta el telómero.
4. En el caso de cromosomas que presentan satélite, las mediciones se
realizan sin considerar el satélite ni el filamento que lo une.
5. Consigne todas sus mediciones en una tabla.
6. Con los datos obtenidos, determine los índices de proporcionalidad.
7. Confeccione una tabla con los valores de los índices obtenidos.
8. Analice sus tablas y deduzca las características cromosómicas para cada
especie.
ANEXO 1
MODELO DE TABLA PARA MEDICIÓN DE CROMOSOMAS
Especie:
CROM p q C IPC IB IPB TIPO PARES p q C TIPO
SESION 10
ELABORACION DEL CARIOTIPO
INTRODUCCIÓN
El cariotipo es el ordenamiento sistematizado de los cromosomas de una célula

realizada por dibujo o fotografía, asumiéndose que los cromosomas de una
célula pueden tipificar los cromosomas de un individuo o, incluso de una
especie. A través del análisis del cariotipo podemos:
 Establecer relaciones evolutivas y taxonómicas entre especies de un mismo
grupo y entre los diferentes grupos.
 Establecer el mecanismo de determinación sexual.
 Establecer la presencia de cromosomas supernumerarios
 Detectar alteraciones cromosómicas y determinar su origen y naturaleza.
En la elaboración del cariotipo se considera:

 Número cromosómico
 Forma y tamaño relativo de los cromosomas
 Número, tamaño y posición de satélites y constricciones secundarias, en
especial las NOR.
 Longitud total de los cromosomas y contenido total del ADN.
 Posición, tamaño y distribución de los segmentos heterocromáticos de
tinción diferencial (bandas C, DAPI, CMA)
 Diferenciación longitudinal de los cromosomas (Bandas G, Q y R).
El cariotipo se obtiene después de analizar muchos cariogramas. El cariograma

es el complemento cromosómico de una sola célula, aunque muchos autores
utilizan el término cariotipo para denominar el ordenamiento de los
cromosomas de una sola célula.
IDIOGRAMA
Se denomina Idiograma (Navashin, 1922) a

la representación esquemática de la
morfología de los cromosomas y se utiliza
diagnósticamente en la comparación de los
cariotipos de diferentes individuos o
especies. La longitud de las barras está
determinada por la longitud media de los
homólogos. Fig. 1: Idiograma de Orestias
mossambicus (Pisces)
MATERIALES
 Fotografías de placas metafásicas

 Tablas de datos
 Tijeras
 Papel blanco o cartulina
 Lápiz 2B
 Goma en pasta
 Cinta adhesiva
 Papel milimetrado
PROCEDIMIENTO
1. Con la ayuda de los datos obtenidos por la morfometría de los cromosomas,

se procede a elaborar el cariotipo
2. Con los datos del esquema y la fotografía, separe los cromosomas por
pares homólogos. De una de las fotografías, recorte los cromosomas de tal
forma que quede un borde de 1 – 2 mm por todo su perímetro a fin de
conservar su morfología.
3. Sobre la plantilla realizada en la hoja de papel blanco o cartulina, ordene los
pares homólogos según su tamaño, empezando por el de mayor tamaño y
terminando por el de menor tamaño.
4. Cuando sea posible, indique el sexo del individuo estudiado estableciendo
la presencia o ausencia del cromosoma Y.
5. En el caso de los cromosomas sexuales, separarlos del grupo de los
autosomas.
6. Una vez que estén bien identificados los pares homólogos, pegue los
cromosomas utilizando la cinta adhesiva o goma. Adjunte la fotografía de la
metafase a la cual corresponde el cariotipo analizado e indique la escala.
7. Con los datos de la tabla, proceda a la representación gráfica del set
haploide del cariotipo, mediante un diagrama de barras.
PATRONES CARIOTIPICOS:
Considerando el complemento cromosómico en

su conjunto puede haber dos clases de
cariotipos: simétrico y asimétrico: Esta
diferenciación es de gran importancia cuando se
hacen estudios de filogenia y evolución de las
especies.
A. Simétrico: presenta todos los

cromosomas aproximadamente del mismo
tamaño y centrómero de posición media y
submedia.
B. Asimétrico: hay marcadas diferencias en

el tamaño relativo de los cromosomas del
complemento, como consecuencia de
reordenamientos cromosómicos
estructural.
C. Bimodal: es la forma más extrema de asimetría, en la cual los

cromosomas largos son 50 veces más largos que los pequeños.
CALCULO DE SIMETRIA – ASIMETRIA DEL CARIOTIPO
Utilizando estos índices y su representación gráfica simultánea en dos

coordenadas, se puede realizar una comparación de variaciones numéricas de
los diferentes cariotipos.
A. ASIMETRIA INTRACROMOSOMICA (A1):
A1 = 1 – 3bi // Bi
_________
n
bi y Bi , longitudes promedio de p y q respectivamente para cada para de

homólogos.
n, número de pares o grupos de homólogos
A1 varía entre 0 y 1; su valor disminuye cuando los cromosomas

tienden a ser metacéntricos.
B. ASIMETRIA INTERCROMOSOMICA (A2):

Estimador de asimetría del cariotipo.
A2 = S / X
S, desviación estándar
X, la media de la longitud cromosómica de cada muestra
A2 adopta valores más grandes cuanto mayor es la variación en la

longitud cromosómica entre los pares o grupos de homólogos.
ACTIVIDADES
 Elabore el cariotipo de la especie en estudio, anotando el código de

lámina de la cual proviene la fotografía utilizada.
 Calcule índice de simetría – asimetría.
 Esquematice el idiograma del espécimen trabajado.
ANEXO 2
MODELO PARA ELABORACIÓN DE CARIOTIPO
ESPECIE: ____________________________
---------- ---------- ---------- ----------

1 2 3 4
---------- ---------- ---------- ----------

5 6 7 8
---------- ---------- ---------- ----------

9 10 11 12
---------- ---------- ---------- ----------

13 14 15 16
Capítulo II
Citogenética
MOLECULAR
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
 Cella, O y Ferreira, A. (1983). Estudios cromosómicos de Cephalocoema

siga (Orthoptera, Proscopiidae) a través de técnicas de coloración
diferencial (Bandas C e impregnación argéntica). Naturalia, 8:169-176
 Comings, D.E. (1978) Mechanism of chromosome banding and

implications for chromosome structutre. Ann. Rev. Genet. 12:25
 Comings, D.E., Avelino E., Okada, T.A. y Wyanott, H.E. (1973) The
mechanism of C and G banding of chromosomes. Exp. Cell. Res. 77:469
 Córdova Santa-Gadea, J (1990) Estudios cariotípicos y problemas

taxonómicos en el grupo Bufo spinolosus (amphibia: Anura). Informe de
prácticas pre-profesionales para optar el título profesional de Biólogo.
UNMSM. Lima, Perú.
 Dalington & La Cour (1970). The Handling of Chromosomes, 5ª Edición,

George Allen & Unwin Ltd., London.
 Fernández–Donoso R. y Berríos M. (1985) La arquitectura nuclear y su

injerencia en la variabilidad del cariotipo. En: El Núcleo, los cromosomas y
la Evolución. UNESCO.
 Goodpasture C. y Bloom, S. (1975) Visualización de regiones

organizadoras del nucleolo en mamíferos usando coloración con plata.
Cromosoma, 53:37-50.
 Gonzáles Santander. (1976) Introducción a la Citogenética Humana.
 Greilhuber J. (1977). Why Plant Chromosomes Do Not Show G-bands?.

Ther. Appl. Genet. 50, 121-124.
 Lacadena, J.R. (1996). Citogenética. 1ª Edición, Editorial Complutense,

S.A. España.
 Lewin, B. (2001). Genes VII. Editorial Marbán, S.L. España.
 Moscone, E. (1990). Chormosome studies on Capsicum (Solanaceae) I.

Karyotipe analysis in C. Chacoense. Brittania, 42 (2), 147-154.
 Moscone, E. (1999) Análisis cariotípico en Capsicum baccatunm var.

Umbilicatum (Solanaceae) mediante bandeos AgNOR y de florescencia.
Kurtzinana, Tomo 27 (1): 225-232.
 Poggio, Mudry, Papeschi y Mola (2006). Guía de Trabajos Prácticos –

Citogenética, Departamento de Ecología, Genética y Evolución, Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires.
 Vosa, C.G. (1989) Chromosome Banding: plants. Genome, Vol. 31, Nº 1.

Manual Practicas Citogenetica General 2016

Загружено:

Сведения о документе

Оригинальное название

Авторское право

Поделиться этим документом

Поделиться или встроить документ

Параметры публикации

Этот документ был вам полезен?

Это неприемлемый материал?

Авторское право:

Manual Practicas Citogenetica General 2016

Загружено:

Авторское право:

Departamento de Biología Celular y Genética

Universidad Nacional Mayor de San Marcos

“ the chromosomes do not obey

Blga. María Angélica Siles-Vallejos

La citogenética, tradicionalmente conocida como la fusión de dos disciplinas: la

La citogenética es hoy entendida como la disciplina que estudia las implicancias

Mucho se ha avanzado desde las primeras observaciones de los cromosomas con

La citogenética clásica nos permite conocer el conjunto de cromosomas de una

Sin embargo, a pesar de su avance, la citogenética clásica no nos permite resolver

Actualmente la mayoría de las técnicas de la citogenética molecular se basan en la

estructurales, en el estudio detallado de segmentos cromosómicos específicos, las

A esta tecnología se une la posibilidad técnica de aislar cromosomas enteros o

1. Familiarizar al estudiante con las técnicas básicas de citogenética.

Competencias y destrezas que deben ser desarrolladas:

1. Adquirir una actitud crítica ante la información recibida, a través de la

1. Adquirir los conocimientos básicos específicos de la Citogenética.

1. Manejar fuentes de información sobre temas relacionados con el

1. Adquirir una actitud crítica ante la información recibida, a través de

Para la observación al microscopio, las muestras pueden ser preparadas en

1.- SELECCIÓN DEL TEJIDO

En todos los casos, tanto en animales como en vegetales, ha de tenerse en

2.- SEMBRADO DE MUESTRA

Cuando se trabaja con especímenes animales, la toma de muestra y la siembra

2.- PRE – TRATAMIENTO (PRE-FIJACION)

Para estudiar las características de los cromosomas, ya sea en tejidos

Para obtener una buena dispersión de los cromosomas metafásicos, es

La fijación tiene la finalidad preservar las estructuras celulares de interés. Los

6.- MONTAJE Y COLORACION

En el caso de utilizar la técnica de goteo de suspensión celular, hay que tener

a) Las láminas deben estar limpias y desengrasadas; se ponen a

En el caso de tejidos vegetales, se utiliza la técnica del aplastado o “squash”;

Los colorantes pueden ser ácidos, básicos o neutros. Estos términos se

La tinción puede ser:

a) Progresiva: en la cual, el tejido se deja permanecer en el colorante hasta

La tinción puede ser temporal o permanente y teñir toda la estructura o solo

7.- APLASTADO O SQUASH

Consiste en presionar uniformemente el tejido con la finalidad de obtener una

Es la etapa final de todo el proceso, consiste en preservar el preparado

8 - hidroxiquinolina 0,058 grs

Preparar solución de 0,025 gr de colchicina en 100 ml de agua destilada

 Solución de Farmer (algunos autores le llaman Carnoy I)

Ácido acético glacial 25 cc

 Orceína Lacto Acética 1% (OLA)

Disolver la orceína en ácido láctico y luego adicionar ácido acético.

Ácido acético 40% 70 cc

Se calienta el ácido en baño María y se junta con la orceína, enseguida

 Buffer Sorensen, pH 6,8

Preparar dos soluciones:

Mezclar 9,0 ml de A con 10,5 ml de B para obtener un pH 6,8. ajustar el

Diluir 5,592 gr de KCl en 1 litro de agua bidestilada.

 Solución Salina Citratada (2xSSC)

Disolver 17,55 gr de cloruro de sodio y 8,82 gr de citrato de sodio en 1

Disolver en 600 cc de agua destilada y llevar a 1000 cc. Agregar 2

Na2HPO4 .12 H2O 2,4 gr

Disolver en 600 cc de agua destilada, agregar 80 cc de rojo fenol 0,5%,

Tomar 50 cc de solución A y 50 cc de solución B, completar a 1000 cc.

Diluir 5 gr de hidróxido de bario en 100 cc de agua destilada. Preparar

 Nitrato de Plata acuoso, 2%

Disolver 2 gr de plata en 100 cc de agua destilada.

Disolver en el mismo orden en 600 ml de agua destilada y luego

b) Solución Tripsina 0,5%

Disolver lentamente 5 gr tripsina en 1L de diluyente y filtrar. Para

 Solución para lavar láminas

OBSERVACION DE MICRONÚCLEOS EN CÉLULAS

Los micronúcleos (MN) son pequeños cuerpos

Su número aumenta ante un efecto genotóxico