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TRABAJO DE GRADO
FACULTAD DE CIENCIAS
BOGOTA D.C
MAYO DE 2013
Nota de advertencia:
“la Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo
velara porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
VALIDACION DEL PROCESO DE LIMPIEZA Y SANITIZACION DE UN AREA DE ENVASE DE
PRODUCCION DE VACUNAS BIOLOGICAS
APROBADO
_______________________ ________________________
Directora Codirector
_____________________________
Bacterióloga M.Sc.- M ed
Jurado
VALIDACION DEL PROCESO DE LIMPIEZA Y SANITIZACION DE UN AREA DE ENVASE DE
PRODUCCION DE VACUNAS BIOLOGICAS
APROBADO
________________________ _______________________
Quiero agradecer primero a Dios por darme la vida, la salud y la oportunidad de poder culminar mis estudios, a mis
padres y hermanos por su gran apoyo en la realización de este trabajo de grado, a la empresa colombiana de
productos veterinarios VECOL S.A por darme la oportunidad de colaborarles, Diana Moreno por su amistad y
ayuda en el cumplimiento de este objetivo, Fabio Gonzales por su confianza en mí para este trabajo.
Y para terminar a todo el personal de Vecol, que de una u otra forma aportó su experiencia en mi carrera para
haber alcanzado esta meta, de todo corazón muchas gracias.
TABLA DE CONTENIDO PAG.
1. INTRODUCCION…………………………………………………………………1
2. MARCO TEÓRICO……………………………………………………………….2
2.2.3 SANIVEC…………………………………………………………………………….3
2.2.4 DESINFLOR…………………………………………………………………………3
2.9 VALIDACION………………………………………………………………………......12
2.9.1.3.1 REPRODUCIBILIDAD…………………………………………………………….13
2.9.1.3.2 REPETIBILIDAD………………………………………………………………......13
4. OBJETIVO GENERAL……………………………………………………………………16
5. METODOLOGIA………………………………………………………………………….17
8. PRUEBA DE ESTERILIDAD…………………………………………………………..22
9. RESULTADOS OBTENIDOS…………………………………………………………..24
10. DISCUSION…………………………………………………………………………….32
11. CONCLUSIONES………………………………………………………………………39
12. RECOMENDACIONES………………………………………………………………..40
15. ANEXOS………………………………………………………………………………...47
RESUMEN
La limpieza y la sanitizacion de áreas de envasado de productos farmacéuticos son fundamentales para reducir los
riesgos de contaminación en el producto terminado y de esta manera asegurar su inocuidad, confiabilidad y
seguridad, manteniendo un control en los índices microbiológicos los cuales pueden llegar a afectar la calidad del
producto terminado.
En el presente trabajo se realizo la validación de los procesos de limpieza y sanitizacion del área de envase de
vacunas biológicas de la empresa colombiana de productos veterinarios VECOL S.A, para esto se realizaron
muestreos del área y de las superficies de envase de productos biológicos durante tres (3) semanas, antes de las
actividades de llenado, el volumen de muestreo para el área de flujo laminar con el equipo MAS-100 es de 500L y
para las áreas circundantes al flujo laminar es de 700L, las superficies fueron muestreadas con la metodología de
petrifilm, estos muestreos se realizaron para bacterias mesofilas y hongos-levaduras. Con los datos obtenidos se
determinó límites de acción, esperando que los procedimientos de limpieza y sanitizacion sean adecuados para el
envasado de vacunas estérilmente.
ABSTRACT
The cleanliness and the sanitizacion of areas of packaging of pharmaceutical products are fundamental to reduce the
risks of pollution in the finished product and hereby to assure its innocuousness, reliability and safety, supporting a
control in the microbiological indexes which can manage to affect the quality of the finished product.
In the present work I realize the validation of the processes of cleanliness and sanitizacion of the area of
packing(package) of biological vaccines of the Colombian company of veterinary products VECOL S.A, for this
there were realized samplings of the area and of the surfaces of packing(package) of biological products for three (3)
weeks, before the activities of filling, the volume of sampling for the area of flow to laminate with the
equipment(team) MORE 100 is of 500L and for the surrounding areas to the flow laminating is of 700L, the
surfaces were sampled by the methodology of petrifilm, these samplings were realized for bacteria mesofilas and
fungi - yeast. With the obtained information action limits was realized waiting that the procedures of cleanliness and
sanitizacion are adapted for the packaging vaccine.
1. INTRODUCCION
Dentro del concepto de garantía de la calidad, las Buenas Prácticas de Manufactura constituyen el factor que
asegura que los productos se fabriquen en forma uniforme y controlada, de acuerdo con las normas de
calidad adecuadas al uso que se pretende dar a los productos, y conforme a las condiciones exigidas para su
comercialización. Las reglamentaciones que rigen las BPM tienen por objeto principal disminuir los riesgos
inherentes a toda producción farmacéutica que no pueden prevenirse completamente mediante el control
definitivo de los productos. Esencialmente, tales riesgos son de dos tipos: contaminación cruzada (en
particular, por contaminantes imprevistos) y confusión (causada por la colocación de etiquetas equivocadas
en los envases).
El control de calidad es la parte de las BPM que se refiere al muestreo, especificaciones, y ensayo, como
también a los procedimientos de organización, documentación, y autorización que aseguren que los ensayos
necesarios y pertinentes realmente se efectúan; y que no se permita la circulación de los materiales, ni se
autorice la venta o suministro de los productos, hasta que su calidad haya sido aprobada como satisfactoria.
El control de calidad no se limita a las operaciones de laboratorio, sino que debe estar presente en todas las
decisiones concernientes a la calidad del producto incluyendo la parte de evaluación de áreas estériles para
garantizar un ambiente estéril en el momento de envasar ya sea una vacuna como un producto farmacéutico.
Cada uno de los aspectos de la fabricación de productos farmacéuticos debe ir acompañado de un elevado
nivel de saneamiento e higiene, el cual debe abarcar al personal, instalaciones, equipos y aparatos, materiales
y recipientes para la producción, productos de limpieza y desinfección, y todo aquello que puede ser fuente
de contaminación del producto.
Para ello los estudios de validación constituyen una parte esencial de las BPM y deben efectuarse conforme
a protocolos definidos de antemano. Debe prepararse y archivarse un informe escrito que resuma los
resultados y las conclusiones. Deben establecerse procesos y procedimientos sobre la base de un estudio de
validación, los cuales se sometan periódicamente a una revalidación para asegurar que con ellos se puedan
seguir obteniendo los resultados deseados.
(http://apps.who.int/medicinedocs/documents/s18835es/s18835es.pdf)
1
2. MARCO TEÓRICO
El control de calidad y las buenas prácticas de manufactura (BPM) son aspectos relacionados, muy importantes
para la producción y control de farmacéuticos, con estos se busca el cumplimiento de requerimientos tales como
identidad concentración, esterilidad, inocuidad y potencia (Norma técnica de las buenas prácticas de manufactura.
2010).
El control de calidad son todas aquellas acciones o mecanismos existentes que son utilizados para detectar errores
humanos y así prestar asistencia al departamento de producción. El control de calidad tiene la responsabilidad de
hacer cumplir todos aquellos requerimientos necesarios para que un producto satisfaga las necesidades de calidad,
entre estas tenemos su comercialización y posterior uso en animales de producción.
En cuanto a las normas que componen las buenas prácticas de manufactura BPM, son necesarias para las empresas
farmacéuticas ya que las empresas certificadas en BPM aseguran que las instalaciones donde se fabrican los
productos son aptas y están siendo inspeccionadas para comprobar si el fabricante cumple con las normas de las
BPM y de control de calidad (Norma técnica de las buenas prácticas de manufactura, 2010).
De esta forma las buenas prácticas de manufactura se basan principalmente en disminuir considerablemente los
riesgos implicados en la fabricación de medicamentos, como la contaminación y mezclas de materiales. Por esta
razón es necesario que cada empresa farmacéutica cumpla con los requerimientos de las BMP para mantener un
control y garantizar la calidad del producto terminado y de esta forma brindar seguridad y confiabilidad a sus
usuarios (Norma técnica de las buenas prácticas de manufactura, 2010)
El termino sanitizacion a nivel de industria farmacéutica se define como la aplicación de productos químicos, para
reducir el número de microorganismos existentes, hasta lograr la inocuidad (Vecol PRO-FC1-022), lo cual debe
incluir la sanitizacion de equipos, recipientes, materiales entre otros elementos los cuales sean un potencial peligro
de contaminación para el producto en proceso.
El proceso de limpieza se define como la acción de remover la suciedad mediante métodos mecánicos, con lo que se
pretende reducir concentración de contaminantes existentes en el área (Quiles, 2008), de este modo se evita la
acumulación de microorganismos sobre las superficies y se previene posibles alteraciones sobre el producto que está
siendo procesado.
2
2.2.1 DESINFECTANTES UTILIZADOS EN LA INDUSTRIA FARMACEUTICA SOBRE
SUPERFICIES
El hipoclorito de sodio es efectivo contra bacterias gram positivas y gram negativas, las proteínas que el hipoclorito
ataca terminan siendo esenciales para el crecimiento microbiano ,actuando como solvente de materia orgánica como
lo son los ácidos grasos, convirtiéndolos en jabones y glicerol (Minambiente www.minambiente.gov.co), además el
mecanismo fundamental del hipoclorito de sodio es su acción oxidativa, produciendo la liberación de radicales libres
e inactivando los microorganismos presentes en cualquier superficie ocasionando la degradación de los aminoácidos
(www.consumer.es)
2.2.3 Sanivec
A base de amonio cuaternario (benzalconio cloruro).Se debe usar en solución acuosa. Efectivo contra bacterias,
hongos y virus. Indicado para desinfección de equipos de laboratorio (Sanivec- Vecol, www.plmconnection.com)
Su acción principal es sobre la membrana celular donde los compuestos son absorbidos provocando cambios en la
permeabilidad y ruptura de la membrana celular (Benzalconio- EcuRed www.ecured.cu).
2.2.4 Desinflor
Uso en solución acuosa a pH 6,5 ± 0.2. Efectivo contra bacterias, hongos y virus también tiene efecto sobre
esporas bacterianas presentes sobre superficies, en caso de presencia de residuos sólidos se recomienda realizar
limpieza previa a la desinfección (Muñoz et al. 2009).
Actúa alterando el ADN y la síntesis de proteínas de los microorganismos ya que provoca la alquilación de los
grupos sulfhidrilo, hidroxil, carboxil y amino (Manual de limpieza y desinfección hospitalaria es.scribd.com).
3
2.3 DESINFECTANTES AMBIENTALES UTILIZADOS EN LA INDUSTRIA FARMACEUTICA-
VECOL
2.3.1 TERMINEX 6
Debe ser manipulado por personal entrenado y usarse puro mediante microdifusor, siempre en ausencia de
personas, durante 10 minutos, a un pH de 7.9 con un plazo de seguridad de 6 a 8 horas.
Presenta elevada actividad antimicrobiana, contra bacterias, hongos, levaduras y virus disminuyendo
considerablemente las esporas.2 Afecta las lipoproteínas de la membrana celular y citoplasma de las bacterias,
facilitando la salida de líquidos intracelulares y la entrada del desinfectante al citoplasma. (www.ramosmejia.org)
2.3.2 CONTINUEX 10
Debe ser manipulado por personal entrenado y usarse puro mediante microdifusor, siempre en ausencia de
personas, durante 10 minutos, a un pH de 8.0 ± 0.5
Elevada actividad antimicrobiana, sus componentes se adsorben a la pared celular de los microorganismos y luego
son difundidos dentro de la célula provocando la precipitación de las proteínas por lo tanto el crecimiento
microbiano es inhibido. Pero su acción es prácticamente nula contra esporas (Biocidas- Lenntech
www.lenntech.es/biocidas.htm)
Debe ser manipulado por personal entrenado y usarse puro mediante microdifusor, siempre en ausencia de
personas, durante 10 minutos, a un pH de 5 ± 0.5. Con un plazo de seguridad de 3 horas
Contiene elevada actividad antimicrobiana, principalmente contra bacterias Gram positivas y hongos, por su pH
cercano al neutro es un buen inhibidor de estos microorganismos, debido a que contiene un grupo fenol en su
composición se une a las proteínas emulsionantes y provoca su inactivación, el éster propílico es de importante
acción contra bacterias esporuladas causantes de infecciones (Echeverry. et al 2007).
4
2.4 EQUIPO UTILIZADO PARA LA DESINFECCION DE AREAS DE ENVASE
Aparato diseñado para la desinfección de áreas, ampliamente utilizado en el sector clínico e industrial, por medio de
este aparato el desinfectante puede extenderse por toda el área llegando a zonas de difícil acceso ya que está basado
en el principio de la microdifusión molecular, el cual se basa en la emisión del sanitizante en forma de partículas al
ambiente y así lograr llegar a los rincones. Además de esto reduce las partículas de 0.5 a 2 micras (Desinfección por
vía aérea- Mark SRL www.marksrl.com.ar/productos.php)
Lamina usada para el muestreo de superficies, compuesta por una lámina de polipropileno, sobre el cual se
encuentra el medio de cultivo para el crecimiento de hongos y bacterias.
Las placas para el recuento de aerobios (AC) Contienen tetrazolium como indicador (Muñoz et al. 2009), Este
indicador colorea las colonias de bacterias y de este modo facilita el recuento de cada una de ellas.
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Figura No. 2 Placa petrifilm para el recuento de aerobios (AC)
Las placas usadas para el recuento de mohos y levaduras consisten en la reacción de la fosfatasa con el tinte
indicador rojo, ya que todas las células contienen fosfatasa, en presencia de esta, el tinte de las placas se activa y las
colonias son coloreadas de azul.
Por lo general las levaduras son pequeñas, de color rosa, cremosas, levantadas y de bordes definidos a diferencia de
los mohos los cuales no tienen bordes definidos, las colonias son planas y grandes, presentan variabilidad de colores
ya que los mohos pueden producir sus propios pigmentos (3M guía de interpretación, petrifilmTM levaduras y
mohos http://multimedia.3m.com) los hongos se pueden reconocer porque son grandes, de colores entre verde y
MR
azul además poseen un centro oscuro (3M placas petrifilm para el recuento de mohos y levaduras
http://www.chemicalcenter.com.ar)
6
Figura No. 3 Petrifilm (YM) crecimiento de levaduras Figura No. 4 petrifilm (YM) Crecimiento de mohos
7
2.5.2 Hisopos quick swab
Hisopo usado en el muestreo de superficies, contiene 1mL de caldo letheen en un envase plástico estéril (Muñoz et
al. 2009)
Medio de cultivo libre sustancias inhibidoras y de indicadores, diseñado para la cuantificación de microorganismos
presentes en agua, productos lácteos y otros materiales (www.solabia.com).
Este medio tiene la propiedad de inactivar desinfectantes ya que contiene lecitina de soya, la peptona de carne,
extracto de carne aportan los nutrientes necesarios para el adecuado crecimiento bacteriano y, el cloruro de sodio
ayuda a mantener el balance osmótico (www.britanialab.com.ar)
8
2.7 EQUIPO UTILIZADO PARA EL MUESTREO AMBIENTAL
Equipo utilizado para el muestreo ambiental de áreas basado en el principio de muestreador de Andersen, este
equipo realiza la aspiración de aire a través de una placa perforada, las partículas de aire contienen microorganismos
y estos caen en una placa de agar.
El MAS-100(Merck Air Sampler) funciona por medio de un dispositivo de succión el cual se puede configurar para
diferentes volúmenes de aire dependiendo del área a muestrear permitiendo un máximo 1000 L.
Un cuarto limpio es un ambiente controlado en el cual todo el aire, agua y químicos que entran son procesados para
cumplir altos estándares de pureza. Además, del control de la temperatura, humedad y presión, el elemento clave es
la filtración de aire, la cual se logra por el uso de filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air). El número de la
clase (100 000, 10 000, 1 000 y 100) es determinado por el número de partículas por metro cúbico de aire mayores a
0.5μm. La clase 100 es aquella en el cual el cuarto está diseñado para operaciones de llenado aséptico (Agalloco,
1998).
Los parámetros de control de áreas limpias se deben apoyar por datos microbiológicos y de partícula obtenidos
durante los estudios de calificación. La calificación inicial del área limpia incluye, en parte, un consolidado de la
calidad del aire bajo condiciones estáticas (Como se construyó). Es importante para la calificación y la clasificación
del área poner mayor énfasis en los datos generados bajo condiciones dinámicas (es decir, con el personal que labora
9
en ella, el equipo en el lugar de uso, y operaciones en curso). Un adecuado programa de monitoreo de un área de
proceso aséptico también determinará conformidades con las especificaciones de clasificación de las áreas limpias
bajo condiciones dinámicas sobre una base de rutina (FDA, 2004). La tabla siguiente (Tabla No.1) resume
clasificaciones limpias del aire del área y niveles recomendados de la acción de la calidad microbiológica.
Fuente: ISO 14644-1: Cleanrooms and Associated Controlled Environments, Classification of Air Cleanliness.
10 5 3 52
1000 6 35 200
b Las designaciones de ISO 14644-1 proporcionan valores de concentración uniformes de partículas para las áreas limpias en industrias
múltiples. Una concentración de partícula ISO 5 es igual a la clase 100 y aproximadamente igual el grado A de la UE.
Dos áreas limpias son de particular importancia para la calidad de los medicamentos estériles: El área crítica y las
áreas limpias de soporte asociadas con ella.
10
2.8.1 Área crítica - clase 100 (ISO 5)
Un área crítica es aquella en la cual el producto, los envases, y los tapones o cierres esterilizados se exponen a
condiciones ambientales que deben diseñarse para mantener la esterilidad del producto. Las actividades realizadas en
tales áreas incluyen las manipulaciones (ej. Conexiones asépticas, adiciones estériles de ingredientes) de materiales
estériles antes y durante las operaciones de llenado y taponado (FDA, 2004).
Esta área es crítica porque un producto expuesto es vulnerable a la contaminación y no será esterilizado
posteriormente en su envase inmediato. Para mantener la esterilidad del producto, es esencial que el ambiente en el
cual se realizan las operaciones asépticas (ej., alistamiento del equipo, llenado) sea controlado y mantenido en una
calidad apropiada. Un aspecto de la calidad ambiental es el contenido de partículas en el aire (Tabla Nº 2). Las
partículas son significativas porque pueden entrar en un producto como contaminante extraño, y pueden también
contaminarlo biológicamente actuando como vehículo para los microorganismos. Los sistemas de manejo de aire
apropiadamente diseñados reducen al mínimo el contenido de partículas de un área crítica (FDA, 2004).
Por otra parte un nivel de acción en monitoreos ambientales microbiológicos, se refiere al nivel de
microorganismos que cuando están en exceso requiere un seguimiento inmediato y si es necesaria, una acción
correctiva. Los niveles de alerta están usualmente basados en información histórica obtenida de las operaciones
de rutina del proceso en un ambiente controlado específico (USP XXVIII, 2005)
Se reemplazó en la fórmula:
En donde:
= media
= grados de libertad
11
2.8.2 Áreas limpias de Apoyo
Las áreas de soporte o de apoyo pueden tener varias clasificaciones y funciones. Muchas áreas de soporte funcionan
como zonas en las cuales los componentes no estériles, los productos formulados, los materiales en proceso, el
equipo, y envases/tapones son preparados, sostenidos, o transferidos. Estos ambientes se diseñan a fondo cuando
minimizan el nivel de partículas contaminantes en el producto final y controlan el contenido microbiológico
(biocarga) de los artículos y de los componentes que se esterilizan posteriormente. La naturaleza de las actividades
realizadas en un área limpia de apoyo determina su clasificación (FDA, 2004).
La FDA recomienda que el área inmediatamente adyacente para la línea que cumple el procesado aséptico, debe ser
como mínimo, clase 10 000 (ISO 7) bajo condiciones dinámicas. Los fabricantes pueden también clasificar esta área
como clase 1 000 (ISO 6) o mantener la totalidad del cuarto de llenado aséptico en la clase 100 (ISO 5). En un área
clasificada como clase 100 000 (ISO 8) el nivel de limpieza del aire es apropiado para actividades menos críticas (ej.,
Limpieza del equipo) (FDA, 2004).
2.9 VALIDACIÓN
Validación es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia documentada que proporciona un
alto grado de seguridad que un proceso determinado cumple con los requerimientos de calidad predeterminados en
forma permanente y consistente (González 2005). La validación hace parte de las buenas prácticas de manufactura
(BPM) y es parte esencial para asegurar la calidad de un producto o procesamiento en particular
(http://www.minsal.gob.cl/portal/url/item/pdf).
Otro alcance de la validación es el establecimiento de pruebas documentadas que aportan un alto grado de seguridad
de que un proceso planificado se efectuará uniformemente en conformidad con los resultados previstos
especificados. (Rey, 2004). Los estudios de validación son aplicables a las pruebas analíticas, los equipos, los
sistemas y sistemas de apoyo crítico (como aire, agua, vapor) y procesos (como el de fabricación, limpieza,
esterilización, llenado estéril, etc.). Se hará una calificación para el liofilizador como equipo y otra para el proceso de
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liofilización; una para la limpieza del material de vidrio y otra para la limpieza del establecimiento; y una para el
proceso de esterilización y otra para las pruebas de esterilidad. Es preciso demostrar que cada paso del proceso de
fabricación de un medicamento se efectúa según lo previsto. (OMS, 1998)
2.9.1.2 Validación prospectiva: En caso de ser un método nuevo se crea evidencia documentada en donde se
demuestra que un procedimiento cumplirá con su propósito, generando a través de análisis datos experimentales
(Validación de métodos y determinación de la incertidumbre de la medición, 2010).
2.9.1.2 Validación concurrente: Es la que se lleva a cabo durante la producción normal en la cual se establece una
evidencia documentada, donde se busca que el proceso o procedimiento haga lo que se espera que haga (Montoya,
2001).
2.9.1.3.1 Reproducibilidad: uso del mismo procedimiento analítico en diferentes laboratorios, la cual expresa la
variabilidad del método en diferentes condiciones (Dirección nacional de laboratorios)
2.9.1.3.2 Repetibilidad: uso de un procedimiento durante cierto tiempo, usando la misma muestra, los mismos
implementos y el mismo analista, que busca encontrar similitudes del método analítico (Dirección nacional de
laboratorios)
2.9.1.3.3 Robustez: Grado de precisión de los resultados obtenidos, para las mismas muestras, bajo variaciones del
método. (Dirección nacional de laboratorios)
13
Una validación apropiada es beneficiosa para el fabricante por varias razones:
14
3. JUSTIFICACION Y PROBLEMA DE INVESTIGACION
Las buenas prácticas de manufactura (BPM), son un conjunto de normas que buscan reducir al máximo los errores
humanos en procesos tales como la fabricación de medicamentos. También aseguran que los productos que se
fabrican cumplan con los requerimientos de identidad, concentración y eficacia, lo cual garantiza que es un producto
confiable para su uso. La implementación de las BPM implica varios componentes, como la capacitación del
personal que labora en el área y la sanitizacion que se debe realizar en esta, además de llevar una documentación de
la limpieza para mantener un control y establecer límites microbiológicos (BPM, 2010) y así reducir los riesgos de
contaminación por parte del personal involucrado en el área de envasado. Es por esta razón cada empresa
farmacéutica debe implementar las BPM para así asegurar que sus procedimientos están siendo controlados (PRO-
FC1-022. Vecol) y contar con un departamento de control de calidad el cual tiene la responsabilidad de realizar los
procedimientos requeridos para asegurar que la producción está bajo control (www.fda.gov/Drugs/). Por lo tanto
la EMPRESA COLOMBIANA DE PRODUCTOS VETERINARIOS (VECOL S.A), busca la certificación en
BPM en el área de envase de vacunas biológicas, para aumentar la confiabilidad de sus productos. Se valida el
proceso de limpieza y sanitizacion en el área de envase de producción de vacunas biológicas, para evitar posibles
alteraciones en los productos y de esta manera asegurar la inocuidad, confiabilidad y seguridad del producto
terminado (Muñoz et al. 2009).
15
4. OBJETIVO GENERAL
Validar el proceso de limpieza y sanitizacion del área de envase de vacunas biológicas de la empresa colombiana de
productos veterinarios (VECOL S.A)
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5. METODOLOGIA
Para el muestreo microbiológico del área de envase de vacunas estériles de Aftosa, se tuvieron en cuenta estos
puntos:
o Área Total
o Área de grafado.
17
20500.00
1. Tornamesa de entrada
15069.66
2. Piso
20743.16
3. Cortina
4. Pared
ESCLUSA7000.00
DE PERSONAL
1450.00
1500.00
5673.50
5673.50
11600.00
27500.00
5. Cortina
grafado
6400.00
1525.00
AREA DE GRAFADO
18
5.1 Metodología de muestreo de ambientes (basado en INS-CC1-029, manejo y limpieza del muestreador
de aire para microbiología. MAS 100)
El volumen de muestreo del MAS-100 para áreas de flujo laminar de envases se manejó de 500L de aire, para las
áreas circundantes al flujo laminar se manejó 700L de aire.
El muestreo ambiental se realizó de la siguiente manera: se hizo recorridos en toda el área sin movimientos bruscos y
se enfatizó en los rincones. Una vez terminado los muestreos se incubaron las cajas agar plate count y petrifilm a
32.5 °C ±2.5°C y 22.5°C ± 2.5°C para bacterias y hongos respectivamente. La lectura de las cajas de agar plate
count que se incubaron a 32.5 °C ±2.5°C se leyeron a los a los 5 días de incubación y del petrifilm de mesofilos
aerobios a los 3 días de incubación. Las cajas que se incubaron a 22.5°C ± 2.5°C se leyeron a los 7 días de
incubación y del petrifilm de hongos y levadura a los 5 días de incubación para realizar el informe final.
5.1.2 Metodología muestreo de superficies tomado de (basado en INS-CC1-029, manejo y limpieza del
muestreador de aire para microbiología. MAS 100)
Se ingresó al área estéril de envasado y se procedió a levantar la lámina semitransparente superior del petrifilm y se
colocó sobre la cortina del área estéril realizando una leve presión, luego de esto se retira el petrifilm de la superficie
y, esta se limpia con una esponja estéril humedecida con el sanitizante de rotación. Este mismo procedimiento se
realizó con las demás superficies muestreadas como la cortina del área de grafado, área envase: cortina, tornamesa,
piso, pared y uniforme.
Las agujas de envasado fueron muestreadas mediante la metodología Quick swab, el cual es un tubo que contiene
un bulbo con 1 mL de caldo letheen y un hisopo para el muestreo de superficies, al momento del muestreo se debe
presionar el bulbo hacia los lados derecho e izquierdo para permitir que el caldo letheen humedezca el hisopo. Para
muestrear la superficie se retira el hisopo realizando movimientos circulares contra las paredes del tubo para evitar
que este gotee, a continuación se frota la superficie deseada y se procede a guardar nuevamente este hisopo en el
tubo agitándolo para así desprender los microorganismos contenidos en el hisopo, ya en el laboratorio se vierte el
caldo letheen contenido en el quick swab sobre el petrifilm correspondiente para hongos y levaduras y el petrilm
19
correspondiente para bacterias, cada uno se debe incubar a 32,5 ± 2.5 ºC Petrifilm de mesófilos y a 22,5 ± 2.5 º C
Petrifilm de Hongos-levaduras.
1 ml
Caldo
Letheen
20
6.1 PROCEDIMIENTO MANEJO DE MUESTRAS CON HISOPOS QUICK SWAB
1 Petrifilm® de mesófilos y
1 de hongos-levaduras
Figura Nº 10 Procedimiento para el manejo de muestras con hisopos Quick Swab 3M.
21
7. METODOLOGIA PROMOCION DE CRECIMIENTO (Tomado de VECOL S.A. Procedimiento No.
PRO-CC1-056)
El Agar Plate count y los Petrifilm de mesofilos aerobios y hongos de levaduras se les realizo la prueba de
promoción de crecimiento, con el fin de saber si contenían todos los nutrientes necesarios para promover el
crecimiento de microorganismos, se siguió esta metodología:
Se descongelaran las cepas ATCC (-70C) durante 24 horas, se sembraron en agar sangre de forma masiva y por
duplicado los siguientes microorganismos: Candida albicans, Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa,
Clostridium sporogenes, se incubaron a 37C ± 2.5 C durante 24 horas. En el caso de Clostridium sporogenes su incubación
se realizó en cámara de anaerobisis, por ser un microorganismo anaerobio.
Luego de las 24 horas de incubación se observara el crecimiento de cada microorganismo en agar sangre y se
procedió hacer una suspensión de cada microorganismo, según el patrón No. 4 de Mac Farland para Clostridium
sporogenes y para el resto de microrganismo con el patrón No. 3 de Mac Farland. Se hicieron 6 diluciones base 10
(4.5ml del solución salina fisiología 0.85% + 0.5 suspensión del microorganismo) para el caso de Clostridum sporogenes
solo se realizan 4 diluciones. De la última dilución se tomó 0.1 ml para inocular en el agra Plate count y petrifilm
aerobios comunes y en el caso de hongos y levaduras solo Candida albicans.
El agar plate count fue inoculado con Staphylococus aureus, Clostridum sporogenes (cámara de anaerobiosis), Candida
albicans, Bacillus subtilis, y Pseudomonas aeruginosa, los petrifilms de mesofilos aerobios fueron inoculados con Candida
albicans, Bacillus subtilis, y Pseudomonas aeruginosa, luego incubadas a 32,5 ± 2.5 ºC por 48 horas; mientras los petrifilm
de hongos y levaduras se inocularon con Candida albicans y fueron incubados a 22,5 ± 2,5 ºC. durante 5 días. La
lectura se realizó por crecimiento de colonias y se confirmó con tinción de Gram.
Esta prueba se realizó con los medio que se utilizaron en el proyecto de grado para determinar que no fuera una
fuente de contaminación que alterara los resultados de los muestreos.
Los medios Caldo Letheen, solución salina fisiológica 0.85%, agar plate count, petrifilm de mesofilos aerobios y
hongos y levaduras, se les hizo prueba de autocontrol por 14 días de la siguiente manera:
22
La mitad del medio se incubo a 22.5ºC ± 2.5ºC por 14 días PARA HONGOS Y LEVADURAS
La otra mitad del medio se incubo a 32.5ºC ± 2.5ºC por 14 días PARA MESOFILOS AEROBIOS
Diariamente se revisó los medios y el petrifilm .Al día 14 se revisó si presentaba algún tipo de crecimiento y se dio
el Concepto Satisfactorio: no crecimiento y Rechazado: crecimiento.
23
9. RESULTADOS OBTENIDOS
La recopilación de datos y lecturas finales sobre crecimiento de microorganismos fueron realizadas durante septiembre, octubre y parte de noviembre de
2012 obteniendo los siguientes datos:
RESULTADOS
FECHA DE FECHA DE CLASE
DIA DE NOMBRE DE LA MESOFILOS HONGOS Y DESINFECTANTE
TOMA DE LECTURA FDA LOTE CONCEPTO
ENVASE MUESTRA AMBIENTAL
MUESTRA FINAL (OMS) AEROBIOS LEVADURAS
(UFC/m3) (UFC/m3)
área total 10.000 0 0 Satisfactorio
área de flujo 100 0 0 Satisfactorio
2012-09-11 2012-09-17 2012-09-11 Formol 2010335812
área esclusa 10.000 0 7 Satisfactorio
área grafadora 100 0 0 Satisfactorio
área total 10.000 0 0 Satisfactorio
PRIMER ENVASE
25
TABLA No. 5 Resultados de muestreo microbiológico de superficies (AT REST):
RESULTADOS
FECHA DE FECHA DE
DIA DE NOMBRE DE LA CLASE FDA DESINFECTANTE
TOMA DE LECTURA LOTE CONCEPTO
ENVASE MUESTRA (OMS) MESOFILOS HONGOS Y USADO
MUESTRA FINAL
AEROBIOS LEVADURAS
(UFC/PTF) (UFC/PTF)
26
Uniforme 100 1 0 SATISFACTORIO
27
Cortina grafadora 100 0 0 SATISFACTORIO
Pared 10 0 0 SATISFACTORIO
Cortina grafadora 100 0 0 SATISFACTORIO
Cortina 100 0 0 SATISFACTORIO
Pared 10 0 0 SATISFACTORIO
28
Guantes 100 0 0 SATISFACTORIO
29
9.1 RESULTADOS OBTENIDOS PROMOCION DE CRECIMIENTO
La promoción de crecimiento fue realizada a cada uno de los medios usados para el muestreo de las áreas y las
superficies del envase. Con este procedimiento se pretende evaluar que cada medio de cultivo utilizado provea a los
microorganismos de los nutrientes necesarios, para su adecuado crecimiento.
Estos datos fueron recopilados durante las semanas de muestreo del envase, obteniendo un buen resultado en el
crecimiento de microorganismos.
MEDIO FECHA
FECHA MICROORGANISMO DILUCION
DE LOTE DE RESULTADO CONCEPTO
ANALISIS UTILIZADO DE USO
CULTIVO LECTURA
30
04 TO Pseudomona MNPC SATISFACTORIO
aeruginosa
Bacillus subtilis MNPC SATISFACTORIO
2013-04 Candida MNPC SATISFACTORIO
KH
Staphylococus aureus MNPC SATISFACTORIO
2012- Pseudomona MNPC SATISFACTORIO
2012-10-12 2012-10-16
Petrifilm 04 TO aeruginosa 10- 6
Bacillus subtilis MNPC SATISFACTORIO
2013-04 Candida MNPC SATISFACTORIO
KH
Staphylococus aureus MNPC SATISFACTORIO
2012- Pseudomona MNPC SATISFACTORIO
2012-11-09 2012-11-13
Petrifilm 04 TO aeruginosa 10- 6
Bacillus subtilis MNPC SATISFACTORIO
2013-04 Candida MNPC SATISFACTORIO
KH
(151)
(152)
31
Agar plate count VM31366131 2012-10-09 2012-10-23 APROBADO
(155)
(159)
10. DISCUSION
Para la selección de los puntos de muestreo se tuvo en cuenta lo establecido en la USP 32 NF 27,2009. Que
corresponde a la Farmacopea de Estados Unidos (en inglés United States Pharmacopeia, USP) la cual es la
farmacopea oficial de los Estados Unidos, publicada junto con el National Formulary (formulario nacional de
medicamentos) como la USP-NF. En donde se establece. USA. que los puntos de control deben ser aquellos que
entran en contacto con el producto y los lugares donde el aire y las superficies podrían entrar en contacto con el
producto terminado. Para el muestreo de superficies planas, el petrifilm es el método más adecuado, en cambio el
método de hisopo o quick swab es usado para el muestreo de superficies irregulares como es el caso de las agujas de
inyección. Para el muestreo de áreas fue utilizado el método MAS 100 el cual es un equipo diseñado para alojar una
placa de Petri con agar plate count. La tapa contiene perforaciones las cuales permiten el ingreso de partículas de
diferentes tamaños gracias a una bomba de vacío que aspira una cantidad determinada de aire, estas partículas que
contienen microorganismos caen en la superficie del agar (USP 32, 2009)
Los resultados obtenidos durante tres (3) semanas de muestreo, antes del envasado. Fueron graficados de forma
independiente por punto de muestreo. Se tuvo en cuenta que los días de muestreo también se realizaron la
sanitizacion de áreas y superficies, de esta manera fue posible demostrar la acción bactericida o bacteriostática del
sanitizante empleado en dichas áreas y superficies según el programa de rotación semanal.
Para llevar a cabo la validación de los procesos de limpieza y sanitización del área de llenado aséptico, se realizó
una validación concurrente, en la cual se establece una evidencia documentada, basada en la información recopilada
durante la implementación del proceso, en la cual se busca que el proceso o procedimiento haga lo que se espera
que haga (Montoya, 2001). Para tal fin se evaluaron los siguientes sanitizantes utilizados en áreas: Formol (se emplea
para la sanitizacion de ambiente antes de empezar un lote nuevo de producto INICIAL), y Terminex® (se emplea
para los diferentes días de un envase de un mismo lote ) y para las superficies fueron: Desinfloor 2% y sanivec 1%,
32
en la tabla de graficas 1 (ver anexo 1) se puede observar el comportamiento de mesófilos aerobios y el de hongos y
levaduras en unidades formadoras de colonia (UFC/m3) y (UFC/PTF) para áreas y superficies respectivamente.
Teniendo en cuenta los resultados de los monitoreos realizados durante los tres envases asépticos y bajo las dos
condiciones evaluadas (“AT REST”), se establecieron límites de acción para mesófilos, hongos-levaduras (Delgado,
2004). Un nivel de acción en un monitoreo ambiental microbiológico es aquel nivel de microorganismos que
cuando es excedido requiere un seguimiento inmediato y si es necesario acciones correctivas (USP XXVIIII, 2006),
En cuanto a los resultados obtenidos podemos analizar que los diferentes desinfectantes utilizados en las áreas y
superficies del envase cumplen con los requerimientos de garantizar áreas limpias para el procesamiento de vacunas
asépticamente. Si alguno de estos requerimientos llegase a fallar y el crecimiento de microorganismos excede los
límites permitidos como en el caso del envase del día 2012/09/13 donde se obtuvo una calificación DEFICIENTE
en la superficie del piso con un recuento de 23 UFC/m 3se hizo necesario realizar una investigación documentada
(USP 32, 2009), la cual incluyó la identificación del microorganismo por medio de la técnica BBL cristal, en donde
se obtuvo bacilos Gram positivos. Corynebacterium species, con un porcentaje de concordancia del 98.54%. Las
colonias de este microorganismo se caracterizan por ser pequeñas, cremosas y brillantes, no poseen movilidad y no
son esporuladas. Se encuentran en gran cantidad de ambientes, estos incluyen cavidad oral, piel de seres humanos y
animales (Verdaguer, 2008). Por otra parte la técnica BBL.Cristal ID Gram-positivo, es una técnica modificada de
métodos clásicos para la identificación de bacterias Gram positivos aerobios, la cual se fundamenta en la
degradación microbiana de substratos específicos. La hidrolisis enzimática de los substratos fluorogénicos que
contienen derivados cumarínicos del 4-metil-umbeliferona o del 7-amino-4-metilcumarín. Los substratos
cromogénicos, después de su hidrolisis, producen cambios de color que pueden descubrirse a simple vista o mejor
aún con lámpara de fluorescencia (sistemas de identificación BBL-Cristal ID)
33
laminar, posiblemente llevando así contaminación del piso de este tipo de áreas al piso del área de flujo laminar. Sin
embargo se evidencia que el día siguiente 2013/09/14 después de la sanitización que realiza el personal operario se
encontró 1 UFC/PTF demostrando así que se realizó el proceso de limpieza a cabalidad, impidiendo que siguiera
siendo una fuente de contaminación en el área estéril. Es importante decir que para propósitos del establecimiento
de límites en esta área, no se determinaron límites de alerta, únicamente límites de acción, debido a que esta es un
área critica (teniendo en cuenta que se lleva a cabo el envase de vacunas veterinarias) y en este caso específico sólo
aplica el establecimiento de límites de acción que permitan identificar cualquier desviación de las tendencias
normales en el recuento de microorganismos y aplicar las acciones correctivas necesarias para así poder evitar una
contaminación que no pueda ser controlada. Además esta es una excelente herramienta que en el futuro puede ser
de gran importancia para determinar fallas en el proceso que puedan ser determinadas oportunamente y puede ser
de gran ayuda en un en un llenado aséptico para determinar si la sanitizacion ambiental y de superficies se llevó
perfectamente.
Se determinaron los límites de acción por punto de muestreo, obteniendo datos límites de crecimiento de
microorganismos antes del envasado (AT REST). Ver Tabla No 8, 9, 10,11.
LIMITES DE ACCION
34
Tabla No.9 Límites de acción para ambientes- Hongos
LIMITES DE ACCION
LIMITES DE ACCION
Cortina 0
Tornamesa 0,859
Piso 6,045
SUPERFICIES
Uniforme 0,252
Guantes 0
Agujas 0
Pared 0
35
Tabla No.11 Límites de acción para superficies-Hongos
LIMITES DE ACCION
Cortina 0
Tornamesa 0,252
Piso 0,090
SUPERFICIES
Uniforme 0
Guantes 0
Agujas 0
Pared 0
En general el crecimiento de microorganismos antes del envasado debe ser nulo (0), ya que se ha realizado la
sanitizacion de las áreas y superficies y, no ha ingresado el personal encargado del envasado solamente está presente
la persona encargada de los muestreos. En cuanto al formol usado como sanitizante rotado para los ambientes es
importante resaltar que este compuesto es comúnmente empleado en la industria farmacéutica y a nivel hospitalario
para obtener una desinfección de alto nivel, en la cual son eliminados bacterias, hongos y virus incluyendo
Mycobacterium tuberculosis (Fuller, 2007), al igual que el formol, Terminex es empleado para aquellas áreas donde es
necesario una desinfección de alto nivel (Desinfeccion terminal). Por sus componentes sinérgicos de aldehído y
fenoles (Muñoz et al. 2009), posee una acción bactericida de alto espectro, eliminando bacterias incluyendo esporas,
hongos y virus.
Se destaca el efecto bactericida de estos dos compuestos usados en las áreas de envase, como lo son el área de flujo
y área total donde el crecimiento bacteriano es considerablemente bajo o nulo y de esta forma se demuestra la
36
acción bactericida del formol y terminex, manteniendo dichas áreas en condiciones asépticas para el envasado de
vacunas. En cambio, las áreas que presentan mayor frecuencia de conteo de colonias (UFC/m3), las cuales son área
grafado y área esclusa no son sanitizadas con ninguno de estos compuestos, pero se evidencia que el conteo de
colonias no sobrepasa los límites permitidos.
Se pudo evidenciar que los medios que se utilizaron en los muestreos como lo fueron agar plate count, petrifilm
aerobios comunes y hongos-levaduras están dentro de parámetros y son confiables para su uso. De esta forma los
medios de cultivo utilizados en esta prueba proporcionan a los microorganismos los nutrientes esenciales en la
concentración adecuada, pH adecuado y la cantidad necesaria de agua y sales para su apropiado crecimiento.
(Manacorda.et al 2007).
La prueba de esterilidad busca determinar contaminaciones microbianas, esta se define como la ausencia de todo
microorganismo capaz de multiplicarse. Cualquier producto estéril debe estar totalmente libre de microorganismos
viables (OMS. 1998).
Las pruebas de esterilidad hacen parte del control de calidad microbiológica, y es útil para probar que determinado
producto es estéril, determinando la ausencia o presencia de microorganismos contaminantes en este (Cortes.et al
2003).
Por este motivo a los medios preparados y esterilizados anteriormente, Caldo Letheen, solución salina fisiológica
0.85%, agar plate count, petrifilm de mesófilos aerobios y hongos y levaduras, se les realizo un seguimiento diario
37
durante catorce (14) días teniendo muestras a 32.5ºC ± 2.5ºC y a 22.5ºC ± 2.5ºC para determinar mesofilos
aerobios y hongos-levaduras respectivamente. Obteniendo como resultados SATISFACTORIOS en todos los
medios preparados y así asegurándonos que no haya falsos positivos en los muestreos microbiológicos.
38
11. CONCLUSIONES
1. Los procesos de limpieza y sanitizacion llevados a cabo, aportaron los datos necesarios para mencionar que su
funcionamiento es óptimo y cumplen con los requerimientos de mantener áreas limpias.
2. Se evidencio que los sanitizantes ambientales: Formol y Terminex y lo sanitizantes de superficie: Desinfloor 2% y
Sanivec 1% son efectivos a la hora de la desinfección de la cabina de envase.
3. Se demuestra que el tiempo de exposición o contacto que tienen los sanitizantes con las áreas y superficies son
suficientes para reducir y/o eliminar los microorganismos presentes.
4. Se estableció un plan de muestreo microbiológico teniendo en cuenta 4 puntos de muestreo de aire (Área de
esclusa, Área Total, Área de Flujo laminar y Área de grafado) y 8 de superficies (Cortina área estéril, Piso área estéril,
Tornamesa área estéril, Uniforme área estéril, Guantes área estéril, Agujas área estéril, Pared área total y Cortina área
de grafado).
5. Se establecieron 12 límites de acción para el área de envase aftosa formulación tanto ambientales como de
superficies.
39
12. RECOMENDACIONES
2. Evitar generar turbulencias de aire en el área de envase aséptico, teniendo cuidado al abrir y cerrar la
puerta del área de esclusa para evitar contaminación cruzada entre áreas.
3. Sanitizar ambientalmente la esclusa y el área de grafado también con microdifusor, para abarcar una
sanitizacion ambiental al 100% en el área.
4. Realizar muestreos AT REST periódicos para evaluar la sanitizacion ambiental y de superficies del área de
envase.
40
13. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
AGALLOCO, J. 1999. Validation of Pharmaceutical Process Sterile Products. Segunda edición. New York,
Estados Unidos. Páginas 669 -702. Capítulo 3.
CORTÉS, A. Sandino, C. Arias, J. 2003. 34. Validación de la prueba de esterilidad para vacunas virales
preparadas en vehículos oleoso y acuoso. Vol. 45 (1): 2-5
DELLEPIANE, N. Griffiths, E. Milstien, J. 2000. Nuevos retos para asegurar la calidad de las vacunas.
Bulletin of the World Health Organization. Vol 78 (2): 155–162.
DUFFAU, F. Rojas, I. Guerrero, L. Roa, L. Rodríguez. et al. 2010. Validación de métodos y determinación
de la incertidumbre de la medición: “aspectos generales sobre la validación de métodos”. Guía técnica No.
1: 21-49.
ECHEVERRY, G. Cifuentes, J. Granados, J. Arias, C. Fernández. 2007. Cinética de desinfección para cinco
desinfectantes utilizados en industria farmacéutica. Revista cubana de farmacia. Vol. 41(2): 1-5.
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MAZARIEGOS, G.A. 2004. Determinación de la carga bacteriana más frecuente en pollo fresco,
distribuido en el mercado “ciudad real”, situado en la zona 12 de la ciudad de Guatemala. [cited November
18, 2012]; (125): 26-31.
MEDINA, J. S. Quintana. 2002. Validación microbiológica de las áreas de producción de la vacuna contra la
fiebre amarilla y laboratorios de aseguramiento de calidad en el instituto nacional de salud. Pontificia
Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de microbiología. Bogotá, Colombia.
MUÑOZ, D. M. Ross. 2009. Validación de procesos de limpieza y sanitizacion del área de producción y
envase de inyectables de una industria farmacéutica. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias.
Departamento de microbiología. Bogotá, Colombia.
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USP 32 nf 27 2009 united pharmacopeias. USA.
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VERDAGUER, F. Tubau, Z. Vázquez, J. Lucena. 2008. Cartas científicas Infección del tracto urinario
causada por Corynebacterium riegelii. Servicio de Microbiología y Parasitología. Hospital Universitario de
Bellvitge. 26(10):669-73.
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14. CONSULTAS EN LINEA
ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. 1998. Guía de la OMS sobre los requisitos de las
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[http://www.who.int/vaccines-documents/DocsPDF/www9811.pdf]
(http://apps.who.int/medicinedocs/documents/s18835es/s18835es.pdf).
45
http://www.solabia.com. Página consultada: 22/11/2012
http://www.distribucionesbiotecnologicas.com.mx/files/quick_swap_para_1_2_3_4_placas_petrifilmpdf .
46
1. A continuación se graficaron los resultados de las áreas:
47
1.2. SEGUNDA SEMANA.
48
1.3 TERCERA SEMANA.
49
2. A continuación se graficaron los resultados de las superficies:
50
51
2.2 SEGUNDA SEMANA.
52
53
2.3 TERCERA SEMANA.
3.
54
55
1. Crecimiento de microorganismos muestreo de áreas DURANTE ENVASADO (OPERACIONAL)
57
2. Crecimiento de microorganismos muestreo de superficies DURANTE ENVASADO (OPERACIONAL).
FECHA DE FECHA DE DIA DE NOMBRE CLASE FDA RESULTADOS DESINFECTANTE LOTE CONCEPTO
TOMA DE LECTURA ENVASE DE LA (OMS) USADO
MUESTRA FINAL MUESTRA
MESOFILOS HONGOS Y
AEROBIOS LEVADURAS
(UFC/PTF) (UFC/PTF)
58
uniforme 100 12 0 DEFICIENTE
59
guantes 100 6 0 DEFICIENTE
60
agujas 100 0 0 SATISFACTORIO
61
Pared 10.000 0 0 SATISFACTORIO
62
1. A continuación se graficaron los resultados de las áreas, durante el envasado (OPERACIONAL)
63
1.2 SEGUNDA SEMANA.
64
1.3 TERCERA SEMANA.
65
2. A continuación se graficaron los resultados de las superficies, DURANTE ENVASADO (OPERACIONAL):
66
67
2.2 SEGUNDA SEMANA.
68
69
2.3 TERCERA SEMANA.
70
71
INDICE DE GRAFICAS - ANEXO 1 Y 2
(OPERACIONAL)………………………………………………………………………………………………63
(OPERACIONAL)………………………………………………………………………………………………65
(OPERACIONAL)……………………………………………………………………………………………...66
72
INDICE DE TABLAS- ANEXO 3
73