Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey

Campus Ciudad de México

Proyecto de diseño y producción de un cóctel de

bacteriófagos con aplicación en remoción del biofilm
formado en la industria de embutidos

Proyecto de diseño en bioingeniería

Profesora: Dra. Cecilia Rojas

Alonso Malacara Becerra

Alba Paulina López Flores A01338779
Daniela Aracely Rosales Escamilla A01333013
Natalia Estefanía Gómez de la Fuente A01338422
Abreviaciones:

OMS- Organización Mundial de la Salud

BL-1 -Nivel de Biocontención 1

°C- Grados Celsius
% V/V- Porcentaje volumen volumen
ATCC- American Type Culture Collection
BPM- Buenas Prácticas de Manufactura
CANACITRA- Cámara Nacional de la Industria de Transformación
CDC- Centers for Disease Control and Prevention
CFR- Code of Federal Regulations
cm- centrímetros
EPA- Environmental Protection Agency
EPS- Sustancias Poliméricas Extracelulares
EU- Endotoxin Units
FDA- Food and Drug Administration
FSIS - Food Safety and Inspection Service
g- Gramos
GRAS- Generally Recognized as Safe
h- horas
HDPE- High Density Polyethylene
ISO- International Organization for Standardization
kD- kilodaltones
kg- kilogramos
kW- kilowatts
LAL- Limulus amebocyte lysate
LPS- Lipopolisacáridos
m- metros
min- minutos
mL- mililítros
MOI- Multiplicity Of Infection
NOM- Norma Oficial Mexicana
NPR- Número Prioritario de Riesgo
OECD-Organisation for Economic Co-operation and Development
OD​600​- Densidad Óptica a 600 nm
Pa- Pascales
PCR- Polymerase Chain Reaction
TB- Terrific Broth
TLR-Technology Readiness Level

UFC- Unidades Formadoras de Colonias

FP- Unidades Formadoras de Placa

WIPO-World Intellectual Property Organization

PROPUESTA PEI ​4
a) Título del proyecto. ​9
b) Generalidades. ​9
c) Responsabilidades. ​10
d) Justificación del proyecto. ​11
e) Análisis de Factibilidad del proyecto. ​13
f) Plan Detallado del proyecto. ​25
i) Generalidades ​25
ii) Planificación de la Secuencia del Proyecto ​25
iii) Estructura Organizativa ​29
g) Presupuesto ​30
h) Control del Programa de trabajo del proyecto ​30
i) Protección de la Propiedad de los Resultados del Proyecto Tecnológico. ​31

ANEXOS ​33
MÓDULO 1: DESCRIPCIÓN DE EMPRESA, PRODUCTO Y SERVICIO ​34
1.1 Empresa ​34
1.2 Producto ​34
Módulo 2: PLANEACIÓN ESTRATÉGICA ​46
2.1 Información de Mercado ​46
2.1.1 Mercado Meta ​47
2.1.2 Nicho de Mercado ​47
2.1.3 Tamaño del mercado Global ​47
2.1.4 Tamaño de mercado Regional ​48
2.1.5 Participación Inicial de Mercado ​49
2.2 Estado del arte ​51
2.2.1 Biofilm en la industria de cárnicos ​51
2.2.2. Aplicaciones de bacteriófagos en la industria alimentaria. ​52
2.2.3. Producción de bacteriófagos en biorreactores ​54
2.3 Factibilidad técnica ​55
2.3.1 Elección de bacteriófagos ​55
2.4. Especificaciones del producto ​57
2.4.1 Instrucciones de uso del producto ​57
2.4.1.1. Caso demostrativo: Tina tipo chiller ​58
2.4.1.2. Caso demostrativo: Tina tipo Ahumador Fessman. ​61
2.4.2. Superficie cubierta por el equipos ​62
2.4.3. Vida de anaquel ​62
2.3 Diagrama de Flujo ​62
 2.4 Diagrama de Proceso ​63
2.5 Localización de Planta(Laboratorio) ​66
2.6 Balance de Materia ​68
2.7 Costos Operativos ​71
MÓDULO 3: DISEÑO DE OPERACIONES UNITARIAS ​72
3.1 Análisis de Operación ​72
3.1.1 Cultivo bacteriano ​72
3.1.2 Cultivo de bacterifagos ​73
3.2.3 Primera microfiltración ​73
3.2.4 Ultrafiltración ​74
3.2.5 Diafiltración ​74
3.2.6 Mezclado ​74
3.2.7 Segunda ultrafiltración ​74
3.2 Caracterización de Equipo ​74
3.3 Estimación de Capacidades ​76
3.4 Consulta con Proveedores ​77
MÓDULO 4: CONTROL Y ASEGURAMIENTO DE CALIDAD ​78
4.1 Normas Nacionales e Internacionales ​78
4.1.1 Normas Nacionales ​78
4.1.2 Normas Internacionales. ​79
4.2 Puntos Críticos de Control ​81
4.2.1 Análisis de Modo y Efecto potencial de Falla ​81
4.2.1. Estrategias de control ​84
4.3 Puntos Críticos de Seguridad ​86
4.3.1 Manejo de Riesgo biológico ​86
4.3.2. Características generales de la estructura ​87
4.3.3. Prevención y reacción a incendios. ​87
4.3.4. Otras normas relevantes ​88
4.4 Certificaciones y distintivos ​88
Referencias 90
A) PROPUESTA PEI
a) Título del proyecto.

Proyecto de diseño y producción de un cóctel de bacteriófagos con aplicación en remoción del biofilm
formado en la industria de producción de carnes frías.

b) Generalidades.

Fundada en 2018 por cuatro Ingenieros Biotecnólogos, MEPS Solutions surge con el objetivo de
ofrecer una respuesta efectiva e innovadora al problema de formación de biofilm en las diversas
industrias alimentarias en México. Nuestro primer producto a diseñar está pensado para industria de
producción y manejo de carnes frías. “Bactroy” es un plaguicida antimicrobiano de tipo sanitizante para
uso sobre superficies en contacto con alimentos. Consiste en una solución de cuatro bacteriófagos
enfocados a la eliminación de cuatro de los principales organismos encontrados en el biofilm formado en
esta industria: ​Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas fluorescens y​ Escherichia
coli. Coadyuvando en los protocolos usuales de limpieza, previniendo el alojamiento y crecimiento de
microorganismos patógenos que pueden representar tanto un peligro para los consumidores como
pérdidas económicas. Una característica crucial de nuestro producto es su inocuidad tanto para el
consumidor como con el medio ambiente.

MEPS Solutions es un start-up tecnológico con planes de operación en el Estado de Nuevo

León. Acorde a la escala y requerimientos de producción iniciales, para arrancar este proyecto se
requiere de un capital aproximado de $6,958,655.99 MXN. Una parte de este presupuesto está dirigido a
la estandarización y posterior aplicación de los procesos de fermentación, infección de cultivo celular y
pruebas de calidad; las actividades de este último rubro estarán enfocadas a la validación y
caracterización de los protocolos.

El resto del presupuesto planteado será utilizado para establecer una planta de producción con
capacidad de manejo de aproximadamente 5,450.00 L/año. Se consideran gastos de equipamiento
necesarios para el inicio de operaciones y sostener la tasa de producción, acorde al objetivo de cubrir un
15% del mercado nacional para 2021. Esta proyección fue calculada con base en los niveles de
producción reportados a nivel nacional, y la demanda que podríamos tener.

El lanzamiento de Bactroy, como primer producto de línea, sería un parteaguas que permitirá a
MEPS Solutions incursionar en un mercado de alto potencial a nivel nacional, para luego escalar su
influencia a nivel internacional. Ofreciendo una alternativa económica y tecnológicamente viable para el
problema de control de microorganismos en industrias de alimentos.

c) Responsabilidades.

CEO: Daniela Aracely Rosales Escamilla

Encargada de Ia administración del proyecto, es decir, vigilar su elaboración, controlar su desarrollo, dar
seguimiento a las etapas y presentar el plan de protección y explotación de los resultados que se
obtengan. Será el punto de contacto entre el CONACYT y MEPS Solutions.
Contacto: +52(1) 55 48885723/drosales@meps.com

Responsable del área de producción:Alonso Malacara Becerra

Entre sus obligaciones principales se encuentran todas aquellas inherentes al proceso de producción y
purificación de fagos. Siendo el responsable de la zona de laboratorios, diseñará y optimizará pruebas
para incrementar el rendimiento global de nuestro proyecto. Será responsable de la redacción y
planeación de las propuestas de protocolos de operación y seguridad para nuestro espacio de
producción.
Contacto: +52(1) 4772524324/amalacara@meps.com

Responsable del área de Investigación y desarrollo: Alba Paulina López Flores

Llevará a cabo y validará los resultados de las pruebas elaboradas para obtener evidencia experimental
que justifique el uso propuesto de nuestro producto. Será el principal contacto de MEPS Solutions con la
institución de investigación asociada al proyecto PEI.
Contacto: +52(1) 5513654810/ alopez@meps.com.

Responsable de Área administrativa: Natalia Estefanía Gómez de la Fuente

Se encargará del contacto con proveedores y otras organizaciones privadas y gubernamentales que
aporten al correcto desarrollo del proyecto. Vigilará el manejo y utilización de recursos técnicos, humanos
y financieros de la empresa. Será responsable de la correcta aplicación y comprobación de los recursos
canalizados por el CONACYT, así como la elaboración del Informe Financiero Final.

Contacto: +52 (1) 55 30174480/ ngomez@meps.com

d) Justificación del proyecto.

La limpieza de instalaciones y equipos de procesamiento de alimentos presenta un reto

considerable para las empresas de la industria alimentaria. Muchos microorganismos potencialmente
patógenos han desarrollado resistencia a métodos de limpieza tradicionales (Davidson, 2002).
Estrategias químicas más fuertes son caracterizadas como tóxicas o corrosivas, descartándolas como
posibles soluciones. Este problema aumenta cuando se habla de formación de biofilm.

El término biofilm se utiliza para designar estructuras formadas por la acumulación de

microorganismos en una interfase sólido-líquido, encapsulados en una matriz de sustancias poliméricas
extracelulares (EPS, por sus siglas en inglés) (Flemming, 2010). Esta estructura va a conferir estrategias
que explican la prevalencia incluso bajo los protocolos de limpieza más estrictos: la estructura de EPS
proporciona una barrera fisicoquímica; los microorganismos que lo conforman tienen un estado
metabólico alterado (principalmente dormante) debido a la limitación de nutrientes y condiciones
anaeróbicas; se expresan genes que favorecen resistencia; hay diferenciación de bacterias y
transferencia genética horizontal. (Anderson, 2008)

Dentro del marco de las propuestas innovadoras a este problema, MEPS Solutions propone el
desarrollo de una alternativa basada en bacteriófagos. El producto fruto de esta idea, “Bactroy” está
enfocado a las cuatro cepas de organismos que se encuentran principalmente en el biofilm de plantas de
manejo de carnes frías. Con una operación anual de mil millones de toneladas por año e ingresos de
cerca de $2.24 mil millones de dólares, es un sector altamente productivo y en constante crecimiento en
el país. (Consejo Mexicano de la Carne, 2016)

En el presente documento se hará una descripción detallada del plan para establecer una
producción de producto equivalente a 5,450 L al año. La cantidad de producto necesario para una planta
se calcula de acuerdo a la superficie que entra en contacto con el alimento. La producción planteada
alcanzará a cubrir el 10% de la superficie utilizada para la producción nacional de carne frías
mencionada anteriormente. Si bien las industrias tienden a economizar sus gastos, temas de limpieza y
desinfección son claves para su correcta operación. Por lo que una alternativa como la que ofrece MEPS
Solutions resulta atractiva. La frecuencia de uso de nuestro producto irá acorde a los protocolos de
limpieza previamente dispuestos por la empresa, respetando los turnos y horarios de producción.
Se tiene proyectada un ingreso de $3,270,240.00 MXN Durante el primer año, a partir de ello se planea
aumentar la capacidad de producción en un 50% para el quinto año.

Uno de los beneficios más altos es que con el apoyo del estímulo del PEI para operar en el estado de
Nuevo León, es que se podría consolidar la fórmula bacteriofágica que garantice la eficacia de
funcionamiento de Bactroy. Dado que seremos acompañados y apoyados por una Institución de
Educación Superior o Centro de Investigación, será posible hacer incluso la prueba de concepto para
validar el pronóstico de participación de entrada en el mercado Nacional.

Al medir la respuesta del cliente se obtendrá información y retroalimentación valiosa que pueden tomarse
en cuenta para la mejora tecnológica continua del producto. De antemano se sabe que no todas las
empresas de cárnicos siguen los mismos protocolos de limpieza, y que muy seguramente tendrán que
adaptar sus fases de desinfección para que Bactroy actúe adecuadamente sobre sus superficies de
trabajo.

El lanzamiento de Bactroy es un proyecto del que se espera obtener un producto realmente

efectivo en la reducción de riesgo de contaminación por microorganismos patógenos para cuidar la
inocuidad de las carnes frías que consume la población mexicana. Se espera ganar fuerza de venta
durante el primer año de producción, así como establecer alianzas estratégicas con empresas de carnes,
para que permitan continuar investigando cuáles serían otros posible patógenos a los que se debería
dirigir la fórmula y en consecuencia ampliar el espectro del producto. De igual manera se podría plantear
el diseño de otras combinaciones de cócteles de fagos para tener un resultado más robusto. El mejor
escenario para la empresa sería estar comenzando la producción del lote inicial al término del año
siguiente,para así colocarse en el mercado en el 2020.

A partir de los recursos otorgados del fondo PEI se podrán obtener las especificaciones para patentar
nuestra innovación y planificar su consiguiente escalamiento para producción en una planta. A largo
plazo, MEPS Solutions visualiza que este producto sea un escalón para poder continuar expandiéndose
a otros mercados. De la venta de Bactroy se podría invertir en Investigación y Desarrollo para lanzar
formulaciones que sean específicas para biofilms que se forman en otras industrias de alimentos.

e) Análisis de Factibilidad del proyecto.

El proyecto propuesto consiste en una planta de producción de un agente coadyuvante para la remoción
del biofilm de la industria cárnica. El producto consta de un cóctel de 4 bacteriófagos en solución, cada
uno enfocado al ataque de una especie bacteriana de las más comunes en la estructura del biofilm
formado en la superficie de equipos de la industria cárnica. El producto es aplicado por aspersión a las
superficies de los equipos con alta probabilidad de desarrollar biofilm, que intuitivamente son aquellos
que entran en contacto directo con los productos.

A través del producto propuesto, MEPS Solutions busca disminuir el riesgo de contaminación de carnes
frías causada por la presencia de biofilm en la superficie de los equipos utilizados para su producción;

Se presenta a continuación información detallada sobre cada uno de los monofagos:

Nombre: ​ LiMN4L
Orden: ​Caudovirales
Propiedades: Cadena doble de ADN, lítico
Rango de hospederos: cepas de ​Listeria monocytogenes ​15JO5, CW2, SMAC91, 18AO1, 22BO5,
22BO7, 18GO1, 19CO5, 17AO2, 15AO7, 19EO1, 18FO9, 19CO9, 19EO3, 19DO9, 19DO3, 19EO5,
19CO7, SSM91, 18DO7, 18D05, ​Listeria ivanovii, Listeria innocua (​ ​Ganegama​, 2013​).

Nombre: Φ S1 (ATCC 27663-B1)

Orden: ​Caudovirales
Familia: ​Podoviridae
Propiedades: Cadena doble de ADN, lítico
​ igula
Rango de hospederos:cepas de ​Pseudomonas fluorescens, se reporta Pseudomonas fluorescens M
ATCC® 13525™(​Sillankorva,2012)​, aunque también funciona para ​Pseudomonas putida.

Nombre: K (ATCC 19685-B1)

Orden: ​Caudovirales
Familia: ​Myoviridae
Propiedades: Cadena doble de ADN, lítico (O’Flaherty, 2004)
Rango de hospederos: ​S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus, S. chromogenes, S. capitis, S.
hominis, S. haemolyticus, S. caprae y S. hyicus (O’Flaherty, 2005)

Nombre: T3 (ATCC 11303-B3)

Orden: ​Caudovirales
Familia: ​Podoviridae
Propiedades:
​ (ATCC, 2016) y ​E. coli T
Rango de hospederos: Por lo menos ​E. coli B ​ G1 (Tkhilaishvili, ​et al, ​2018)
El biofilm, o biopelícula, es una comunidad sésil de microorganismos embebidos en una matriz de
sustancias poliméricas extracelulares (EPS, por sus siglas en inglés) y se encuentra formando capas en
superficies sólidas. La matriz del biofilm es lo que mantiene a las células próximas entre sí, por lo que
mantienen una interacción celular. Del mismo modo, la matriz protege a los organismos frente a biocidas,
desecación, oxidantes, antibióticos, cationes metálicos, radiación ultravioleta y defensas inmunes. Sin
embargo, las células del biofilm no quedan completamente inmovilizadas, ya que tienen movilidad en el
interior e incluso pueden desprenderse.

En 2014 en Dinamarca, ​12 personas fallecieron en el país debido a un brote de listeria causado por
fiambres contaminados; las pruebas confirmaron que todos los infectados por Listeria, habían consumido
una salchicha enrollada. En consecuencia se ordenó retirar los productos de esta empresa, por las
graves consecuencias que tuvo la contaminación por tal bacteria (BBC, 2014).

Con lo anterior, se evidencia que la formación de biofilm con bacterias patógenas es un grave riesgo de
salud pública de los consumidores a nivel mundial. Esto debe ser altamente controlado y regulado por los
más altos estándares de calidad de las empresas procesadoras de carnes. De ahí se deriva la
importancia de que los procesos de limpieza y desinfección de superficies y equipos que se encuentren
en contacto con la materia prima, se realicen al terminar el procesamiento; pues es necesario evitar la
desecación, que es el principal factor que impulsa la fuerza de unión de las células y muchas especies
bacterianas.

Por otro lado, una empresa de capacidad baja de procesamiento de carne de res, invierte hasta $2,098
dólares anuales ($42,253.72 MXN) en métodos de sanitización de sus equipos de fabricación, así como
una empresa de capacidad de producción alta, invierte hasta $15,766 dólares anuales (317,527.24 pesos
mexicanos) (​Viator, 2015​). Algunos de los desinfectantes más utilizados en este tipo de industria son
clorito de sodio acidificado, cloruro de cetilpiridinio, dióxido de cloro, ácido hipocloroso, ácidos orgánicos
y ácido peracético, el costo anual del agente antimicrobiano más caro utilizado en una planta de
capacidad alta de procesamiento de carne de res es de aproximadamente $230,708.00 dólares
(4,646,459.12 MXN) (​Viator, 2015​). Como puede observarse, los métodos antimicrobianos es la parte
más costosa en la higiene de las plantas de esta industria; un escenario propuesto es la reducción en la
cantidad de productos antimicrobianos adquirida al año y la complementación de los procedimientos de
sanitización y esterilización con Bactroy, que tendría un costo anual de $72,000.00, promoviendo
además, la reducción de costos cubiertos en eventos de emergencia que se presentan, por ejemplo,
cuando es identificada alguna contaminación en el producto o parte del proceso.
En el mercado global de embutidos, vemos que en los últimos años la tendencia ha sido creciente, para
los distintos productos: Jamón, salchichas y carnes frías. Tomando ello como referencia, la proyección
hacia el año 2021 sugiere que el crecimiento anual será del 4%.
De la misma manera, trayendo una visión nacional, se ha incrementado la participación mexicana en el
mercado global. Por lo que se estima un crecimiento anual de 11.35%.
De acuerdo con Mordor Intelligence (2017) los productores más grandes en el mercado global de carne
procesada, están centrando sus estrategias en la expansión hacia regiones en desarrollo en donde
establecen nuevas plantas, y negocian la adquisición o unión de pequeños y medianos fabricantes.
Es claro que la tendencia en cárnicos está siguiendo una buena dirección y eso en consecuencia
beneficia a la industria de la limpieza de equipos y superficies. Ya hay productos que se enfocan en ello,
siguiendo los principios de los productos biocidas. Más la innovación con la que Bactroy mostraría
ventajas competitivas es que su enfoque no sólo es eliminar microorganismos patógenos, sino que
también degradar la matriz del biofilm.
El monitoreo tecnológico implica obtener la información sobre el desarrollo que se está llevando a cabo y
las tecnologías emergentes. También incluye la búsqueda de las normas y regulaciones a la que éstas
deben apegarse.

En este proceso, una variable que no se puede perder de vista es la tecnología cambiante, pues es la
estrategia en la que se basan y cómo es que proyectan los éxitos de un producto. El análisis tecnológico
permite comprender el funcionamiento, diseño y construcción de una propuesta.

Dentro del negocio de productos y servicios para la limpieza de equipos y superficies en industria
alimentaria, hay diferentes métodos utilizados que se basan en la actividad biocida, pero que a su vez
pueden seguir métodos químicos, mecánicos o enzimáticos.

Es preciso mencionar que al hablar de patentes, hasta ahora y también como parte de la competencia
analizada, se tiene que los productos QUACIDE® BF31 y QUACIDE® BF31 EC de Betelgeux obtuvieron
una patente, por lograr la eliminación de biofilms en superficies abiertas y en circuitos. “Su composición
se basa en una mezcla sinérgica de agentes oxidantes, tensioactivos, secuestrantes y biocidas, actúa de
forma eficaz a la hora de desprender biofilms de las superficies, degradar la matriz exopolimérica que
protege a los microorganismos y eliminar estos microorganismos de las instalaciones” (Betelgeux, 2014).

Dentro de la World Intellectual Property organization (WIPO) se encontró una solicitud de patente:
(ES2560262) , titulada : “Bacteriófago o proteína lítica derivada del bacteriófago que es eficaz para el
tratamiento de la biopelícula de Staphylococcus aureus”, solicitada por la empresa ​Intron Biotechnology,
Inc. Su técnica proponer el uso del bacteriofago SAF-i, la invención también menciona el uso de
proteínas tilicas derivadas de! bacteriófago SAP-1. Si bien su uso no está dirigido para asuntos que
tengan que ver con alimentos, es verdad que se propone su uso en aspectos médicos, por ejemplo en
material quirúrgico o en órganos artificiales. (Yoon, 2016).

De google patents, se encontró la siguiente: US20050175594A1. El claim de ésta dice que se trata de un
método para controlar la contaminación por ​Listeria en un producto alimenticio, equipo de procesamiento
de alimentos o en contenedores de almacenamiento de alimentos. El fago lítico que se toma es el P100,
designado en la ATCC como no. PTA-4383. Se aplica en una cantidad suficiente, tal que se pueda
reducir la cantidad de Listeria.

E​n esta invención se prepara un vector de ADN recombinante utilizando el fago virulento P100 que es
específico para Listeria monocytogenes.​ El vector incluye un sistema genético de ADN que codifica la
expresión de una o más proteínas detectables que no son un producto génico de ​Listeria
monocytogenes. ​ (​Loessner y Carlton, 2008).

También hay artículos de investigación que han propuesto el uso de bacteriófagos con aplicación en la
industria de alimenticia. Gutierrez, Diana , et al. (2016) menciona en su estudio la importancia de cuidar
la inocuidad en el procesamiento de alimentos, ya que en el biofilm puede haber ​bacterias hospederas.
La matriz de biofilm podría ser una barrera física para el fago, sin embargo algunos fagos poseen
polisacárido depolimerasas, que son enzimas hidrolíticas específicas que pueden usar polisacáridos o
derivados de polisacáridos como sustrato.

Ahora bien, de acuerdo con S. Y.-E. Tan, et. al. (2013), otras estrategias de eliminación de biofilms se
basan en la inhibición de las señales de quorum sensing, la inducción de la separación del biofilm de la
superficie, el bloqueo de las señales reguladoras del biofilm o el tratamiento de superficies para evitar la
adhesión de biofilms.

Es por ello que una de las técnicas más prometedoras para el control de biofilms en la industria es el
empleo de bacteriófagos

​Tabla 1 . Comparación de los productos de la competencia existente en el mercado de la

eliminación de biofilm.

Marca Forma de acción

Test de detección de biofilms TBF® 300 y TBF® 300S
 Usado para la comprobación de la presencia de biofilms en
superficies tras las operaciones de limpieza y desinfección.

Aplicación en forma de espuma o en spray, se pueden detectar por

Betelgeux simple inspección visual las zonas en las que existe biofilm, ya que
estas quedan coloreadas tras el aclarado de la espuma.

Para eliminación de biofilm

• QUACIDE® BF31 - tratamiento de superficies

• QUACIDE® BF31 EC - tratamiento de circuitos

Mecanismo basado en la combinación sinérgica de ingredientes de

naturaleza exclusivamente química. Degradan la matriz del biofilm, lo
desprenden de las superficies y eliminan los microorganismos que
contiene.

Tratamiento de biofilm en superficies abiertas

· ENZY JET 1: Detergente enzimático espumante concentrado.
Concentración de uso 1%
· ENZY JET 3: Detergente enzimático espumante. Concentración
de uso 3%
ITRAM
· BIO JET: Activador enzimático para procesos curativos en
superficies abiertas.

Tratamiento de biofilm en CIP (Common Industrial Protocol)

· BIO CIP C1: Detergente enzimático para tratamientos curativos

en limpiezas CIP.
· BIO CIP C2: Activador enzimático para mezclar con BIO CIP C1
para tratamientos curativos en limpiezas CIP.
· BIO CIP P1: Detergente enzimático para tratamientos
preventivos en limpiezas CIP.
· BIO CIP P2: Activador para mezclar con BIO CIP P1 en
tratamientos preventivos en limpiezas CIP.

Especialistas en desarrollar programas de limpieza y desinfección

para prevenir la aparición de biofilms. En el caso de detectar
Hygenia presencia de biofilm, establecen programas de choque para su
eliminación.
 Esta empresa desarrolla proeductos a partir de bacyeriófagos, para
uso en el procesamiento y producción de alimentos, limpieza
ambiental, aplicaciones veterinarias y terapia humana.
Intralytix

ListShield™: Su objetivo es contaminación por la cepa patógena

Listeria monocytogenes​ en alimentos e instalaciones de producción.

EcoShield™: ​Su objetivo es contaminación por la cepa patógena

Escherichia coli O157:H7​ en alimentos e instalaciones de producción.

SalmoFresh™: ​Su objetivo es contaminación por cepas patógenas de

Salmonella​ en alimentos e instalaciones de producción.

ShigaShield™: ​Su objetivo es contaminación por la cepa patógena

​ n alimentos e instalaciones de producción.
Shigella ssp. e

SalmoPro®. Producto para uso como auxiliar antimicrobiano sobre

superficies en contacto con alimentos (a una concentración de
1 x 108 PFU), cuyo objetivo es cepas de ​Salmonella.
Phagelux

Como se observa, los productos comercializados por Intralytix y Phagelux pueden tener un uso muy
similar al propuesto para Bactroy; son utilizados para atacar contaminación bacteriana en superficies de
equipos de producción de alimentos. Los productos además están enfocados a utilizarse durante eventos
de contingencia, en que una cepa bacteriana específica fue detectada.

Por otro lado, Bactroy está diseñado para atacar no solo contaminación específica de una cepa, sino
biofilm formado frecuentemente en las superficies de la industria de producción de carnes frías; los
bacteriófagos fueron seleccionados para atacar las cuatro cepas bacterianas más comunes en la
estructura del biofilm formado en los equipos de esta categoría alimenticia. Los fagos cuentan además
con enzimas que igualmente participan en la degradación de la matriz que le va dando soporte al biofilm
Basados en que los principales objetivos del estímulo de PEI son:

La creación de nuevos productos, procesos o servicios de alto valor agregado, así como la generación,
apropiación y protección de la propiedad intelectual, es necesario enfocarse en el proyecto de
investigación y desarrollo tecnológico, más que en infraestructura de la empresa.

En caso de hacernos acreedores del apoyo de este fondo, habrá una serie de evidencias y reportes que
podrán entregarse periódicamente para demostrar que las actividades van alineadas con los objetivos.
Siguiendo el esquema de maduración tecnológica de CONACYT (2017), los entregables necesarios
podrían seguir esa estructura, mostrada en la Tabla 2.

Tabla 2. Programa general de trabajo para el lanzamiento de Bactroy.

 ​Recursos humanos

Figura 1. Organigrama para MEPS solutions. Se incluyen 3 áreas que rigen la organización de la
empresa.

Cabe destacar que hay cuatro puestos directivos, pertenecientes a nosotros, quienes como socios
también asumiremos las responsabilidades participando activamente en la toma de decisiones y manejo
del proyecto.

Además, la empresa requerirá personal para los siguientes puestos:

● Analistas de calidad (por turno)

● Operadores de producción (por turno)
● Operador de envasado (por turno)
● Representante de ventas
 Recursos técnicos

Pruebas de calidad

Para realizar las cuatro pruebas de calidad, es necesario contar con la estandarización del procedimiento
de cada una, ya que la naturaleza las muestras de nuestro producto puede diferir en gran medida de las
utilizadas en los protocolos que son reportados en la literatura. Además de esto, debe existir un
procedimiento de validación de estas pruebas, para ello puede seguirse el siguiente ​formato​:

Mantenimiento de equipos de producción

Es necesaria información completa específica de cada equipo de fabricación y envasado, que debe
incluir:

● Diagrama de tuberías e instrumentación (DTI)

● Dimensiones, volumen, presión, flujo, capacidad, etc.
● Vida útil de todos los equipos para planificar el mantenimiento y reemplazo.

Además de lo mencionado, también es necesario mantener calibrados todos los equipos en el área de
producción y el laboratorio de Calidad. Se buscará tercerizar esta actividad, para contar con personas
externas que realicen la actividad; es por ello que, para los equipos de producción, se pretende contratar
los siguientes servicios ofrecidos por el Centro Nacional de Metrología.

● Dirección de flujo y volumen

● Dirección de fuerza y presión

Estos servicios cubrirán la calibración de barómetros y flujómetros en las cuatro líneas de producción y
en la de envasado

Para el caso de los equipos utilizados en el laboratorio de Calidad, el servicio de la calibración es

proporcionada por la empresa proveedora:

● Termociclador de punto final Axygen

● Lector de placas HLab

Recursos materiales
Tabla 3.0 Materia prima utilizada en el proceso

Medio de cultivo 1: BHI Broth [Brain Heart Infusion Broth], 5 kg, RPI.
*Al utilizarse a 37 g/L

Medio de cultivo 2:Medio de cultivo 2: Tryptic Soy Broth (TSB, (Tryptone Soya Broth, CASO
Broth, Soybean
Casein digest Broth, Casein Soya Broth) MERCK.
*Al utilizarse a 30 g/L

Medio de cultivo 3: BHI Broth [Brain Heart Infusion Broth], 5 kg, RPI (botes de 5 kg/Lotes
anuales)
*Al u.tilizarse a 37 g/L

Medio de cultivo 4: Nutrient Broth, 1 kg, RPI

*Al utilizarse a 8 g/L

Buffer TMN

Envases de polipropileno, volumen de 5 L

Agua desionizada

f) Plan Detallado del proyecto.

i) Generalidades

Para darle marcha al proyecto es necesario establecer una planeación estratégica de actividades, con
las que se pueda dar un correcto seguimiento. Así mismo es pertinente establecer criterios de éxito, para
que se logre el cumplimiento de acciones en tiempo y forma.
Como parte de la evaluación de avances y resultados, MEPS propone realizar reportes trimestrales para
notificar a CONACYT los detalles en los que se va avanzando y permanezca sustentada la razón del
apoyo económico.

ii) Planificación de la Secuencia del Proyecto

La planificación de un proyecto requiere la asignación de fechas de inicio y de término.Como límites

para cumplir las etapas.En el siguiente diagrama de Gantt se consideran todas las fases en las que se
descompone el proyecto. Que van desde los aspectos legales hasta la posibilidad de producir el primer
lote de producto para comienzos de 2020.

Tabla 4. Diagrama de Gantt con la Planeación de actividades por etapa para el proyecto de la
empresa.
A continuación se expone el seguimiento de actividades de Meps, para todo el año 2019. En la Tabla 4
se incluyen criterios de éxito, que permitirán ir evaluando si Meps llega a los objetivos o no. Con ese
indicador también es posible notificar a CONACYT los resultados que se están obteniendo.

Tabla 5. Fechas de medición de resultados y criterios de éxitos de las etapas del proyecto Meps
solutions.

Medición de avances MEPS 2019

Fase Fecha de Fecha de Criterio de éxito Reportes a

inicio fin CONACYT

Asesoría legal con

un abogado

Aspectos legales 03-ene 17-ene

100% de
15-mar-19
cumplimiento de
los requerimientos
para abrir un
laboratorio

Continuo Aseguramiento de
Investigación y hasta 15 la efectividad de
desarrollo 03-ene de agosto Bactroy en
Industrias

14-jun-19
Adquisición de 31-oct Espacio 100%
espacio y equipos habilitado con la
25-ago instalación de
servicios y
equipos
 Contratos hechos 13-sep-19
con proveedores y
materia recibida
Adquisición de 20-sep 06-oct en tiempo y con la
materia prima calidad requerida

El proceso de
producción
funciona sin fallas
y cumple con los
Validación 22-sep 07-dic tiempos estimados
por operación
unitaria

Determinación de
condiciones
Estandarización 08-dic 8 de enero óptimas de
2020 operación

No hay vacantes y
Recursos humanos los empleados
13-dic
01-dic 30-dic están capacitados

Primer lote de
Segunda Bactroy sale en el
Producción para ene-20 quincena mercado. Cumple
comercializar de enero con el pronóstico
2020 de ventas
 iii) Estructura Organizativa

Los socios y directores de Meps tendremos juntas recurrentes para asegurar la mejora continua en todo
proceso del proyecto y establecer estrategias para sobreponerse a las dificultades que puedan
presentarse durante el desarrollo del proyecto..

Operadores de producción

El trabajo consiste en entrar de lleno al proceso para vigilar y establecer las condiciones óptimas de
producción de Bactroy. Deberá permanecer al tanto de los biorreactores y unidades de filtración
trabajando en perfusión, siempre respetando los turnos. Es necesario apegarse a las especificaciones de
producción y monitorear que ningún equipo falle.

Analistas de calidad

La tarea de quien ocupe esta vacante consiste en proveer un marco de metodología y estandarización a
la Organización y sus Proyectos, en dos importantes ramas: Calidad en Procesos y Calidad de Producto.
Su labor es clave para detectar en forma temprana las causas de los defectos y evitar su propagación.

En este puesto se deben realizar las pruebas de calidad por monofago, y cuando se juntan los cuatro
bacteriofagos también. Elaboración de reportes.

Representante de ventas

Son los agentes que serán capacitados con información científica y técnica sobre el funcionamiento de
Bactroy. Asimismo esta posición de trabajo debe conocer cómo se aplica el producto, para convencer
mediante demostraciones, por qué la industria de cárnicos debería optar por nuestro producto para
complementar sus protocolos de limpieza y desinfección.
g) Presupuesto
h) Control del Programa de trabajo del proyecto

Se hizo un análisis del proceso completo y se determinaron varias posibles fuentes de riesgo que ponen
en peligro la integridad del producto. Para evitarlo se elaboró un plan que se detalla en anexos. La
estrategias se basa, principalmente en la prevención. Los puntos principales son:

Medio de cultivo. Tener un medio de cultivo bien caracterizado incrementa la seguridad y

reproducibilidad de nuestro proceso. Para garantizar esto adquiriremos medios prefabricados, en
los que se garantiza un contenido constante de cada uno de los componentes.

Inoculación de los biorreactores con la cepa de trabajo. La replicación de la cepa se va a hacer

en matraces. Nuestro laboratorio cuenta con las características necesarias para el manejo y
sostenimiento de cepas sin riesgo biológico o contaminación, de acuerdo a las recomendaciones
de la Organización Mundial de la Salud (OMS, 2005). Será necesario elaborar manuales
detallados y capacitar al personal para reducir al máximo riesgos de contaminación del cultivo.

Manejo de membranas de filtración. El equipo de filtrado que se adquirirá de Sartorius

“SartoFlow Study” tiene cassettes de filtrado removibles. Riesgos de contaminación durante este
paso se eliminan con un lavado con buffer durante 10 minutos, dando un volumen total de lavado
de 7.8 L

Mantenimiento de equipos y material de trabajo. Todos los equipos e instrumental técnico deben
ser correctamente identificados y validados, dando mantenimiento continuo de acuerdo a las
instrucciones del fabricante. El mantenimiento, limpieza, servicio, desinfección y sanitización de
los equipos deberá ser realizado constantemente y registrado adecuadamente.

Procedimiento de Operación Estándar (SOP). Una vez que se hayan identificado las
especificaciones críticas para el proceso se debe llevar a cabo una la elaboración de un SOP. En
él se debe indicar a detalle todas las características de materiales y reactivos utilizados. Existen
varios manuales para la elaboración de estos documentos se utilizarán las recomendaciones
publicadas por la EPA (EPA, 2007)

Así mismo se han elegidas cuatro pruebas de calidad para el análisis de nuestro producto en
fases intermedias e inmediatamente antes del envasado:

a) De potencia. ​La forma de cuantificar la actividad lítica del producto es mediante protocolos
 estandarizados de titulación de bacteriófagos. El método a emplear por MEPS Solutions es el
conteo de unidades formadoras de placa en agar en suspensión y se basa en la infección de
cuatro cultivos saturados, uno por cada cepa hospedera, con diluciones seriadas de la solución
fágica. Los parámetros de calidad durante esta fase se basan en la concentración final esperada
del producto, y por lo tanto se espera obtener un título > 1×10​9​ PFU/mL.

b) Identidad
Esta prueba consiste en hacer uso de ​Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Realizada
con primers específicos de cada una de las cepas seleccionadas. Aquí es importante tomar una
estrategia que incremente la especificidad como variantes de diseño y primers extra que se unan
entre la zona flanqueada.

c) Contenido de endotoxinas
Las cepas productoras gram negativa, producen endotoxinas y Lipopolisacáridos (LPS). Esto se
realiza mediante ensayos de LAL (Lisado de amebocitos de limulus), que consisten en usar
amebocitos provenientes del cangrejo Herradura.

d) Esterilidad
La presencia de microorganismos en las soluciones fágicas podría afectar severamente el
rendimiento del producto final. Es necesario corroborar su ausencia mediante el enriquecimiento
de una muestra de solución fágica con caldo nutritivo.Uno de los principales requisitos es la
garantía de condiciones asépticas. La implementación de sistemas cerrados de cultivo
(automatizados) ha sido sugerida como una estrategia para apegar el proceso a BPM (Sensebé,
2013). Adicionalmente este tipo de producción previene la diseminación de bacterias y
bacteriófagos (patógenos) dentro de las instalaciones, evitando contaminación en pasos
posteriores.

i) Protección de la Propiedad de los Resultados del Proyecto

Tecnológico.
Al término de la fase de investigación y desarrollo se pretende registrar nuestra marca del producto
Bactroy. Una búsqueda fonética y de marcas correspondientes en el Instituto Mexicano de la Propiedad
Industrial (IMPI) mostró que no existen registros similares a esta búsqueda.

En cuanto a la tecnología a desarrollar se encontraron, en la página del IMPI, dos patentes como
antecedentes para justificar la estrategia de patente que busca MEPS Solutions:

● MX/a/2010/009391. “METODO PARA PRODUCIR UNA MEZCLA DE BACTERIOFAGOS Y AL

USO DE LA MISMA EN LA TERAPIA DE ESTAFILOCOCOS RESISTENTES A ANTIBIÓTICOS.”
La invención se refiere a un método para producir una mezcla de bacteriófagos, en donde por lo
 menos dos cepas diferentes de bacteriófagos se han reproducido por separado, en donde una
cepa de estafilococos se desarrolla en un precultivo con cada una de las cepas de un
bacteriófago que puede usar estafilococos y luego se reproduce además en un cultivo principal y
luego se purifica y las cepas diferentes se mezclan, en donde la mezcla de bacteriófagos usada
comprende por lo menos dos diferentes serotipos de bacteriófagos que usan específicamente
bacterias de la especie ​Staphylococcus​.
● MX/a/2016/001343. “METODO PARA OBTENER PERLAS DE ALGINATO CONTENIENDO
BACTERIOFAGOS”. La presente invención describe un método para la elaboración de una
forma farmacéutica sólida a base de perlas de alginato que contienen bacteriófagos complejos, y
que son útiles en el tratamiento de enfermedades infecciosas de etiología bacteriana tanto en
humanos como en aves de corral.

Ambos documentos muestran dos precedentes importantes, a nivel nacional, de patentes

otorgadas a un desarrollo con bacteriófagos. Los fago utilizados en la formulación de nuestro producto no
son patentables, debido a que han sido ampliamente reportados y no son aislados ​de novo por MEPS
Solutions. Pero la estrategia resultante de producción, una vez que se encuentra bien caracterizada,
tiene potencial de ser patentable tal como se demuestra en la primera patente mencionada con
anterioridad. Otra característica patentable de nuestro producto es la presentación y uso de la misma, tal
como se demuestra en el segundo documento.

MEPS Solution solicitaría una patente para “Mezcla de cuatro bacteriófagos como coadyuvante en la
remoción de biofilm de superficies en industria alimentaria”. El documento resultante describiría “el
método de producción y aplicación de un coctel de cuatro bacteriófagos específicos para: ​Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas fluorescens y​ Escherichia coli. Mediante un
proceso de cultivo en biorreactor se producirán los componentes para la solución a ser asperjada sobre
superficies que tienen contacto con alimentos en industria de producción de alimentos”
B) ANEXOS
MÓDULO 1: DESCRIPCIÓN DE EMPRESA, PRODUCTO Y
SERVICIO

1.1 Empresa
• Nombre comercial
MEPS Solutions
El nombre de la empresa, MEPS Solutions, surge por el acrónimo en inglés de las Sustancias de Matriz
Extracelular Poliméricas. Esta matriz es uno de los componentes más importantes del biofilm y es justo lo
que nuestro producto insignia busca atacar. Funcionando como coadyuvante de una limpieza profunda
de equipos y tuberías en la industria de procesamiento de carnes.

• Logotipo

1.2 Producto
• Nombre del producto
Bactroy. El nombre del producto es un juego entre la palabra bacteriófago y Troya. Haciendo alusión al
famoso artilugio desplegado por los griegos para entrar a la ciudad fortificada, el funcionamiento de
nuestro producto podría ser una analogía a este mito griego.
Como beneficio adicional es un nombre de fácil pronunciación y que puede ser recordado con facilidad
por nuestros clientes.

• Búsqueda fonética del nombre del producto.

Como se aprecia, del portal de Marcanet de la página del IMPI, hasta el día de hoy, no existen
coincidencias de registro de marca, por lo que los nombres establecidos son viables para cuando se
decida echar a andar la empresa. Realizar esta búsqueda es indispensable para proteger la identidad de
la idea.

• Presentación comercial.

Figura 1. ​Diseño propuesto para el logo de nuestro producto Bactroy en su presentación

comercial
Figura 2.​​ Etiqueta delantera del producto Bactroy
 Figura 3​​. Etiqueta trasera del producto Bactroy

Figura 4​​. Propuesta de vista para el envase de 5L para la formulación de Bactroy. Se incluyen
dimensiones
• Ficha técnica.
 • Hoja de seguridad.

1. Identificación de la mezcla y datos del proveedor

1.1. Nombre del producto

Bactroy
1.2. Uso recomendado
El contenido del envase debe diluirse hasta una concentración de 1% en agua. Una
vez preparado debe ser utilizado inmediatamente. Aplicar sobre la superficie con
ayuda de un nebulizador a presión, dejar actuar durante 30 minutos.
1.3. Datos del proveedor
MEPS Solutions
Calle del Puente 222, Ejidos de Huipulco, 14380 Tlalpan, CDMX, México
1.4. Número de teléfono en caso de emergencia
SETIQ 01 800 00 214 00
UANL Departamento de Farmacología y Toxicología 01 8 348 6883
EMERGENCIAS 911

2. Identificación de peligros

2.1. Clasificación de la sustancia química

La mezcla no está clasificada como una sustancia nociva para la salud de acuerdo a
la GHS
Es considerado como Generally Recognized as Safe (GRAS)
2.2. Elementos de señalización en etiqueta
Atención: Provoca irritación ocular grave (H319)
Puede irritar las vías respiratorias (H335)

3. Composición

3.1. Contenidos de la mezcla

El concentrado de Bactroy contiene los siguientes compuestos en las concentraciones indicadas
Tris 50 mM………100 Mm
MgCl​2​……...........50 mM
NaCl………………...100 mM
Bacteriofagos….. 10​10​ PFU/ml

4. Primeros auxilios
Inhalación: Traslade a la víctima y procure aire limpio. Si no respira,
suministre respiración artificial. La inhalación puede
provocar ligera irritación de mucosas. Consulte a su
médico.

Ingestión: No inducir el vómito. Enjuague la boca. Si el vómito ocurre

de manera espontánea, coloque a la persona de costado
para evitar aspiración.

Contacto con los ojos:
Enjuagar inmediatamente con abundante aguas durante,
por lo menos, 15 minutos. Asegurarse de aclarar todo el ojo
y el tejido de los párpados. Si tiene lentes de contacto
retirar tras los primeros 5 minutos del enjuague y continúe
con el procedimiento.

Contacto con la piel: Enjuagar de manera inmediata con agua abundante

durante, por lo menos, 15 minutos. Retire la ropa
contaminada y lave antes de usar nuevamente.

5. Medidas contra incendios

5.1. Medidas de extinción.

Utilizar espuma resistente a alcohol, químico seco, arena, espuma o CO​2​. Evitar los
chorros de agua directos.
5.2. Peligros específicos.
La combustión del producto tiene como productos CO y CO​2
5.3. Recomendaciones para el personal de extinción de incendios
Utilizar indumentaria apropiada para combatir incendios aprobados por NIOSH y
equipo autónomo de respiración con mascarilla completa operando en la demanda
de presión.

6. Medidas en caso de derrame accidental

6.1. Precauciones personales.
Evacue al personal hacia un área ventilada. Utilice equipos de protección personal.
Evite el contacto con la piel, ojos y vestimenta.
6.2. Precauciones ambientales.
Prevenga que el producto llegue a cursos de agua. El producto no debe ser liberado
al medio ambiente, para mayor información ecológica consulte la sección 12.
6.3. Limpieza de derrames.
Absorba el líquido derramado con un material inerte. Almacene en contenedores
cerrados para su posterior manejo responsable.

7. Manejo y almacenamiento

7.1. Manejo
Use equipo de protección personal adecuado. Asegure ventilación apropiada. Evite
contacto con ojos. No ingerir
7.2. Almacenamiento
Mantenga los contenedores de almacenamiento en un lugar fresco, seco y bien
ventilado. Almacene en interiores.

8. Controles de exposición

8.1. Límites de exposición

Este producto no contiene ningún material peligroso con un límite establecido dentro
de las regulaciones de organismos nacionales.
8.2. Sistema de ventilación
El sistema de ventilación utilizado normalmente en operaciones de manufactura es
generalmente adecuado.
8.3. Medidas de protección personal
Protección de Utilizar lentes de protección
ojos/rostro

Protección de piel Utilizar guantes de protección

y cuerpo adecuados

Protección Durante la aplicación de las

respiratoria nebulizaciones utilizar un respirador
de partículas (NIOSH tipo N95)

Medidas de Manejar de acuerdo a buenas

Higiene prácticas de higiene industrial y
seguridad
 9. Propiedades químicas y físicas

Apariencia Líquido, transparente

Olor No presente

Umbral de olor Sin información disponible

pH 6.05±.05

Punto de fusión/congelación ≤-5 °C/23 °F

Temperatura de ebullición ≥120 °C/248 °F

Punto de inflamación Sin información disponible

Velocidad de evaporación Sin información disponible

Inflamabilidad No aplica

Límite superior de inflamabilidad Sin información disponible

Gravedad específica 1.100

Solubilidad Soluble en agua

Viscosidad 900 mPa @25°C

Peso molecular No aplica

10. Estabilidad y Reactividad

Reactividad No reportada

Estabilidad química Estable a condiciones de almacenamiento y

operación estándar.

Posibilidad de reacciones peligrosas No reportadas

Condiciones que deberán evitarse Altas temperaturas

Materiales incompatibles Modificadores fuertes de pH inactivan las

partículas virales
Oxidantes fuertes

Productos de descomposición peligrosos Dióxido de carbono y monóxido de carbono

11. Información toxicológica

 Información de componentes

Componente LD50 Oral

Cloruro de magnesio 8100mg/kg

Cloruro de sodio 2000 mg/kg

Tris Base No reportado

Bacteriofagos No reportado. Estudios no demuestran riesgo de

consumo en humanos para concentraciones de trabajo de
Bactroy.

Efectos mutagenicos No reportados

Efectos reproductivos No reportados

Teratogenicidad No reportados

Disruptor del sistema endócrino No reportado

Otros efectos adversos No reportado

12. Información ecotoxicológica

12.1. Persistencia y degradabilidad

Medio soluble en agua y carente de componentes de toxicidad aguda. Evitar vaciado
en alcantarillado.
12.2. Potencial de bioacumulación
De acuerdo a la información disponible para cada componente no parece presentar
potencial para bioacumulación.
12.3. Otros efectos adversos
No reportados

13. Eliminación del producto

Tanto el sobrante de producto como los envases vacíos deberán eliminarse según la legislación
vigente. Deberá clasificar el residuo y disponer del mismo mediante una empresa autorizada.
Procedimiento de disposición: tratamiento de aguas residuales o disposición de relleno sanitario.
 14. Información relativa al transporte

Mercancía no regulada para su transporte. Trasladar de acuerdo a lo establecido en la

NOM-003-SCT2-1994, NOM-004-SCT2-1994 y NOM-005-SCT2-1994 para transporte de
materiales y residuos peligrosos.

15. Información reglamentaria

Esta hoja de seguridad cumple con los requisitos establecidos dentro del marco legal de la
NOM-018-STPS-2015

16. Otra información

16.1. Exención de responsabilidad

La información indicada en esta Hoja de Seguridad fue recopilada e integrada con la
información suministrada en las Hojas de Seguridad de los proveedores de materia
prima. Esta hoja de seguridad no pretende ser completa o exhaustiva; incluso la
manera, condiciones de uso y de manipulación pueden implicar otras
consideraciones adicionales no contempladas en este documento.
16.2. Control de cambios
La última edición de este documento fue elaborada y revisada en Noviembre de
2018

Módulo 2: PLANEACIÓN ESTRATÉGICA

2.1 Información de Mercado

La industria alimentaria en México representó cerca del 3.5% del PIB en el año 2017, de acuerdo
al INEGI (Industria Alimenticia, 2018). Dentro de este sector uno de sus principales ramas es la
relacionada a producción de carne roja y de pollo con cerca de seis millones y medio de toneladas
producidas anualmente (Heinrich Böll Stiftung, 2016)​. ​La producción de carne pasa por tres distintas
etapas: cría y posteriormente la parte de industria y comercialización.
Dentro de la etapa industrial se incluyen todo tipo de transformaciones como es la fabricación de
carnes frías. En nuestro país, en 2016, este rubro produjo cerca de 1,047,000 toneladas de producto.
Representando un ingreso de cerca de treinta mil millones de pesos, con un crecimiento anual promedio
de 4.6%. (Consejo Mexicano de la carne, 2016)
Los principales tres estados productores de carnes frías son Ciudad de México, Nuevo León y
Jalisco,en respectivo orden. De estos únicamente Nuevo León tiene producción para exportación a
Estados Unidos. El resto se dedica a la producción para consumo doméstico y una pequeña proporción
se destina a exportación a países centroamericanos. (Romo, 2018)
 Dentro de las principales empresas procesadoras de embutidos se encuentran: Sigma, Fud y
Qualtia. Sigma reporta ventas de hasta medio millón de toneladas por trimestre, que se pueden traducir a
$1,503 millones de USD. Con crecimientos trimestrales de hasta el 2%. (Sigma Alimentos, 2017)
El presente proyecto busca enfocarse en estas industrias donde los niveles de producción y
manejo de materia orgánica son tales que los procesos de limpieza se vuelven críticos para evitar
problemas de salubridad en la planta. Bactroy es un cóctel de bacteriófagos que va dirigido a las
principales cepas de microorganismos que se pueden encontrar en el biofilm de las plantas de
producción de carnes frías.

2.1.1 Mercado Meta

Se pretende llegar a las plantas procesadoras que se encargan de obtener producto categorizados como
carnes frías:Jamón, chorizo, longaniza, salchicha, salchichón, chicharrón de puerco, machaca, carne
seca, chuleta ahumada, tocino, salami, carne enchilada, jamón etc.
De acuerdo con datos estadísticos la producción alimentos cárnicos procesados ha sido creciente al
menos hasta el año 2016, y dentro de las principales empresas que figuran en el procesamiento de carne
en el país, se encuentran: SuKarne, MaxiCarne, El Jarocho Carnicerías, Carnemart, BIF, Cafisu y Carnes
Ramos.

2.1.2 Nicho de Mercado

​ - Descripción del perfil de los clientes potenciales
Plantas industriales que utilizan carne de res, cerdo o aves para generar productos procesados.
Son empresas que dentro de sus procesos de producción tienen equipos como: Molinos de carne,
embutidoras, mezcladoras, ahumador, balanzas, etc. Deben de tener altos estándares de calidad y
procesos para asegurar que los procesos de limpieza reduzcan al máximo el riesgo biológico. Se podrán
interesar principalmente aquellas empresas en las que se destine el producto a exportación, sobre todo a
Estados Unidos. Bactroy funge como un seguro adicional en contra de la posible aparición de biofilm en
sus equipos de procesamiento. La empresa deberá contar con protocolos de limpieza ya establecidos.

​ - Necesidades específicas de nicho

Las plantas procesadoras de carne cuentan con protocolos de limpieza específicos, sin embargo
es de suma importancia asegurar la inocuidad de sus productos cuidando que no haya contaminación en
ninguna parte del proceso. Lo que buscan en las soluciones de limpieza son componentes capaces de
degradar las proteínas de la sangre y restos cárnicos para facilitar su desaparición, al igual que combatir
e incluso prevenir el alojamiento de microorganismos patógenos.
En términos generales, se emplean lavados con agua a presión para eliminar los trozos de carne que
pudiesen estar sobre las tablas de despiece. Además, hay ciertas máquinas que deben desmontarse
durante para efectuar el lavado a profundidad. En esto se utiliza la combinación de espuma de
detergentes alcalinos y agua caliente a 70-80ºC y con una presión de 150 bar, que faciliten el
desengrase de las superficies, para esta labor. Normalmente se cuenta con hidrolavadoras industriales
trifásicas que manejen una presión de entre 25 a 200 bares.
Otra de las necesidad principales es la de agentes desinfectantes/antimicrobianos que reduzcan
significativamente la carga de microorganismos que se encuentran dentro del equipo tras el
procesamiento de un lote Con todos los requerimientos, Un producto de alto rendimiento que no sea
corrosivo o incremente significativamente el desgaste de los equipos en su uso cotidiano.

2.1.3 Tamaño del mercado Global

Cabe destacar que a nivel global, las aves de corral abarcan el segmento más grande del
procesamiento de carne,representando el 40% del mercado (Global processed meat market, 2017). Sin
embargo, a la par, la industria de los embutidos ha demostrado con el paso de los años una tendencia
creciente.
Los ingresos en el segmento de productos cárnicos y embutidos ascienden a $ 139.792 millones de
dólares en 2018.

​ anancia en millones de dólares obtenidos por carne y salchichas a nivel internacional

Figura 5​​. G

El volumen promedio por persona en el mercado de productos cárnicos y embutidos ascendió a 46.2kg
en 2018.

De acuerdo con la proyección publicada por Statistics hasta el año 2021 (Statistics,2018), se estima que
el crecimiento anual será de 4%, lo cual es favorable para las industrias procesadora de carnes.

2.1.4 Tamaño de mercado Regional

Año con año el Consejo Mexicano de la Carne elabora un compendio estadístico del desempeño
de su sector en el país. Una de las áreas reportadas es dedicada a la producción de embutidos y carnes
frías. En su reporte de 2016 se informa que el tamaño del mercado fue de 40,006 millones de pesos
mexicanos. Esta cifra se conforma por salchichas (34.19%), jamón (52.82%) y carnes frías (12.94%).
(Consejo Mexicano de la Carne, 2016)
Para este año el tipo de cambio promedio fue de $18.68MXN por cada $1 USD (DOF, 2018). Lo
que nos da una participación del mercado global de 2,241millones de dólares americanos,
correspondiente al 1.67% del mercado en el mundo.
De acuerdo a los datos de la misma institución se hace una proyección de un crecimiento anual
de 11.35% (Consejo Mexicano de la Carne, 2016). El cual es mayor al mercado global, descubriendo una
situación favorable para la inversión en este sector de la industria de procesamiento de carnes.

2.1.5 Participación Inicial de Mercado

Basándonos en la producción conocida a nivel nacional de carnes frías se hizo una proyección
de la superficie en equipos que utilizan las empresas para conseguir este rendimiento. La efectividad de
nuestro producto se puede cuantificar en la superficie cuadrada que cubre de equipos y superficies de la
planta. Se elaboró una proyección que contemplaba una planta de producción de embutidos con
capacidad de producir 386,880 kg anuales de producto. Como se puede observar en la Figura 6.
tenemos una superficie de 150 m​2​ para esta capacidad. (Gómez, 2012)
Figura 6.​​ Desglose de superficie de equipos utilizados en cada etapa general en una planta de
embutidos con capacidad de producción de 386,880 kg anuales. (Gómez, 2012)
 De acuerdo con lo reportado por el Consejo Mexicano, a nivel nacional se tiene una producción
de 1,046,835,000 toneladas por año de carnes frías en México. Esto equivale a 2,705 plantas con el
tamaño de la descrita en la Figura 6. y tomando en cuenta que una planta tiene en promedio 150 m​2 de
superficie efectiva en contacto con los productos cárnicos, siendo sensibles a formación de biofilm, se
obtiene el estimado de una superficie de 405,750 m​2​ a nivel nacional.

Nuestro objetivo a corto plazo, los primeros tres años de operación, es hacer de Bactroy un producto
aplicado en el 10% de la superficie en plantas a nivel nacional. Bactroy tiene un rendimiento de 50m​2​/L y
un uso recomendado de aplicación de por lo menos de dos veces por semana (Detalle consultar sección
2.4.3.). Con ello, la necesidad de producción sería de cerca de 78,000 L de producto por año.

2.2 Estado del arte

2.2.1 Biofilm en la industria de cárnicos

El término biofilm se utiliza para designar estructuras formadas por la acumulación de
microorganismos en una interfase sólido-líquido, encapsulados en una matriz de sustancias poliméricas
extracelulares (EPS, por sus siglas en inglés) (Flemming, 2010). La característica más importante de las
células que se encuentran en un biofilm de industria cárnica es su mayor resistencia a tratamientos de
sanitización, comparados con células en estado planctónico. Se han descrito en literatura, por lo menos
cuatro mecanismos que propician este fenómeno: (i) la protección de la matriz exopolimérica forma un
barrera física que limita la difusión de los sanitizantes dentro del biofilm; (ii) el fenómenos de
transferencia horizontal de genes puede ocasionar que se activan mecanismos de resistencia, por
ejemplo transportadores de membrana, contenidos en plásmidos; (iii) la diferenciación de bacterias hacia
diferentes estados metabólicos y (iv) la modificación del microambiente dentro del biofilm, por ejemplo pH
reducido, que ocasiona la disminución en la eficiencia de algún sanitizante en particular. (Donlan, 2002,
Gilbert, 2002)

Los equipos de procesamiento de alimento de carnes frías modernos representan un reto

particular para las estrategias de prevención de biofilm por la complejidad de los mismos, las horas de
operación prolongadas, los grandes volúmenes y la vasta superficie susceptible a infección. La materia
prima utilizada representa una importante fuente de transporte para microorganismos normalmente
encontrados en biofilms: ​L. monocytogenes, S. enterica, E. coli, Staphylococcus aureus, Yersenia
enterocolica, Campylobacter jejuni y Pseudomona fluorescence (​ Giaouris, 2014). Una vez que se ha
formado el biofilm, los procedimientos de limpieza y desinfección ya no bastan para eliminarlos
efectivamente (Bremer, 2006). Es entonces cuando comienza a surgir el fenómeno de contaminación
cruzada, donde la ruptura espontánea de uno de los biofilms libera bacterias hacia el producto en
producción. Este fenómeno es uno de los principales factores que favorecen brotes esporádicos de
patógenos en alimentos, convirtiéndose en un tema clave para clientes y empresas productora.

Para reducir o eliminar estos microorganismos de superficies de contacto con alimentos, se han
utilizado una amplia gama de de procedimientos tanto físicos como químicos. Además de su relativa baja
eficacia contra biofilm vamos a tener algunas desventajas como posible toxicidad y la generación de
resistencia de los patógenos, en el caso de antibióticos. Así se han enfocado esfuerzos en la
investigación y desarrollo de nuevas alternativas. Otro factor de gran peso ha sido el rechazo del
consumidor hacia el uso de químicos sintéticos, ocasionando la búsqueda de alternativas amigables con
el medio ambiente que el cliente perciba como “naturales”. (Giaouris, 2014) Una potencial respuesta que
cumple con las características requeridas son los bacteriófagos.

2.2.2. Aplicaciones de bacteriófagos en la industria alimentaria.

La industria alimentaria busca, constantemente, nuevas técnicas y procesos para eliminar el

riesgo de enfermedades transmitidas por patógenos en alimentos. Además de estrategias que se
enfocan a tratar el alimento directamente, también se le da alta importancia a métodos para “neutralizar”
las posibles fuentes de contaminación. Parte clave de estos esfuerzos son las condiciones del sitio de
producción, establecer protocolos de limpieza eficientes de instrumentos y superficies que entran en
contacto con alimentos se ha vuelto prioridad. Para esto se utilizan innumerable cantidad de productos
químicos y métodos de eliminación física, sin embargo no siempre tiene la efectividad deseada. Se ha
demostrado la presencia de patógenos incluso después de limpiezas en plantas de alimentos
(Marouani-Gadri, 2009). Una muestra de esto es que a pesar de los constantes esfuerzos, la
Organización Mundial de Salud reporta cerca de 150 casos por cada 100,000 habitantes de infecciones
atribuibles a patógenos en alimentos tan solo en América del Norte. (Havelaar, 2015)

La búsqueda de nuevas alternativas efectivas, que no dañen los equipos y sean amigables con
el medio ambiente ha llamado la atención hacia soluciones biotecnológicas. Entre ellas se encuentra el
desarrollo de cócteles de bacteriófagos enfocados a la eliminación de algunos de los patógenos más
comunes en las zonas de producción de alimentos. Se han realizado múltiples estudios que avalan la
efectividad de este tipo de estrategia y su funcionamiento contra cerca de 12 especies diferentes (Moye,
2018). Así mismo se encuentran registradas 9 empresas, a nivel global, dedicadas a la producción y
comercialización de productos para industria alimentaria a base de bacteriofagos (Sulakvelidze,
n.d.).Entre ellas existen 11 productos aprobados por la FDA como GRAS (Tabla 1) (Moye, 2018).

Tabla 1. Productos basados en Bacteriófagos aceptados para su uso en industria alimentaria (Adaptado
de Moye, 2018)

Organismo
Producto Compañía Certificaciones Permisos regulatorios
objetivo

FINK TECH
Secure FDA, GRN 724 pending
GmbH E. coli -
Shield E1 as of 19 March 2018
(Alemania)

USDA, FSIS Directive

Ecolicide E. coli ​O157:H7 -
Intralytix, Inc. 7120.1
(USA)
EcoShield E. coli ​O157:H7 Kosher; Halal FDA, FCN 1018; Israel
 Ministry of Health;
Health Canada

FDA, 21 CFR 172.785;

FDA, GRN 528; EPA
L. Kosher; Halal;
ListShield Reg. No. 74234-1; Israel
monocytogenes OMRI
Ministry of Health;
Health Canada

FDA, GRN 435; USDA,

Kosher; Halal; FSIS Directive 7120.1;
SalmoFresh Salmonella ​spp.
OMRI Israel Ministry of Health;
Health Canada

ShigaShield Shigella s​ pp. - FDA, GRN 672

FDA, GRN 198/218;

Kosher; Halal; FSANZ; EFSA;
PhageGuard L.
OMRI; SKAL Swiss BAG; Israel
Listex monocytogenes
Ministry of Health;
Micreos Food Health Canada
Safety (Holanda)
FDA, GRN 468; FSANZ;
PhageGuard Kosher; Halal; Swiss BAG;
Salmonella ​spp.
S OMRI; SKAL Israel Ministry of Health;
Health Canada

Passport Food
USDA, FSIS Directive
Finalyse Safety Solutions E. coli ​O157:H7 -
7120.1
(USA)

Xanthomonas
​ v.
campestris p
vesicatoria​,
AgriPhage - EPA Reg. No. 67986-1
Pseudomonas
Phagelux (China)
syringae
pv. tomato

SalmoPro Salmonella ​spp. FDA, GRN 603

Los productos mostrados en la Tabla 1 son todos para aplicación directa sobre los alimentos
producidos en la planta. La alternativa propuesta en este trabajo se basa específicamente en el diseño
de un producto para aplicación sobre superficies. Abdulaze, et al. (2008) probó la actividad de una
mezcla de bacteriófagos sobre superficies similares a las utilizadas en industria de productos cárnicos,
encontrando una reducción significativa en la presencia de ​E. coli​ 0157:H7.
 Otro estudio interesante para este tipo de aplicación fue publicado por Woolston (2013), en él se
describe el uso de bacteriófagos para reducir la contaminación de ​Salmonella ​en superficies de vidrio y
acero inoxidable. Los resultados demostraron una reducción significativa en la cantidad de
microorganismo viable tras la aplicación de SalmoFresh y SalmoPro (ambos productos en desarrollo de
Intralytix, Inc.). Al final del mismo artículo se mencionan algunos retos y características, relevantes para
los fines de este trabajo:

● Los fagos líticos, debido a su alta especificidad, van a reducir la carga microbiana de una
sola especie. Por tanto, las estrategias que utilicen estos microorganismos deben ser
consideradas, más que un sustituto, un suplemento a los químicos de amplio espectro
utilizados normalmente.
● Los fagos son altamente sensibles a las concentraciones usuales utilizadas de otros
detergentes y desinfectantes. Por esto el uso de bacteriófagos debe ser coordinado con
el uso de químicos para optimizar el resultado de ambos.

2.2.3. Producción de bacteriófagos en biorreactores

El cultivo de bacteriófagos para su uso comercial es una tecnología que se encuentra en
constante desarrollo, gracias al creciente número de aplicaciones de dichas entidades. En la actualidad,
una gran cantidad de productos basados en bacteriófagos se encuentran tanto en el mercado, como en
desarrollo. Aún así, parece ser que la información generada en cuanto a la producción de bacteriófagos
en biorreactores se mantiene aislada del dominio público, ya que las investigaciones correspondientes
son realizadas principalmente por el sector industrial ​(Agboluaje & Sauvageau, 2018)​.
De esta forma, son pocos los estudios que se han enfocado a su producción en condiciones
controladas ​(Agboluaje & Sauvageau, 2018). Sargeant ​et al (1968) describen por primera vez un cultivo
del Bacteriófago T7, con ​E. coli ​B (ATCC 11303) como hospedera, en biorreactores de 3 y 20 L. Los
parámetros de temperatura, aireación y agitación fueron controlados a lo largo del cultivo. En ambos
casos se realizó el monitoreo del CO​2 presente en el gas efluente como medida indirecta de la tasa
metabólica bacteriana. Los cultivos tuvieron un rendimiento promedio 9.5×10​11 ​UFP/mL de medio.
Algunos años después, Werquin ​et al (1983) realizaron una serie de experimentos con el propósito de
optimizar la producción de distintos bacteriófagos de ​Rhizobium meliloti.​ En su publicación se describe la
necesidad de mantener condiciones de aireación y agitación constante para promover un título de
bacteriofágos final alto.
En años más recientes, y con el avance de la tecnología, se han realizado estudios que buscan
comparar el título viral obtenido gracias a la variación de distintos parámetros de fermentación, como la
temperatura, el pH, el oxígeno disuelto y la MOI. De esta forma, se ha demostrado que la temperatura y
el pH tienen un efecto significativo en el rendimiento de producción viral (Grieco, ​et al​, 2012). Por otro
lado, se ha explorado la posibilidad de usar modelos basados en técnicas analíticas, que permitan
predecir el título de bacteriófagos al final de una fermentación en biorreactor. Smrekar, ​et al​. (2011)
explican que existe una correlación entre la cantidad de material genético bacteriano suspendido en el
medio en determinado punto de la fermentación, y el título viral máximo al final de esta.
Aunado a lo anterior, el estudio realizado por Mancuso, ​et al. (​ 2018) describe un método de
producción de bacteriófagos basado en dos cultivos continuos conectados en serie y un tercero
semicontinuo. En el primer biorreactor se realizó la propagación del hospedero, ​E. coli ​(ATCC 11303),
manteniendo una tasa de dilución que da paso a una tasa de crecimiento alta y estable. Esto a su vez
permite que la susceptibilidad de infección de los hospederos aumente y se encuentren en condiciones
óptimas para su infección con el bacteriófago de ​E. coli ​B3 (ATCC 11303-B3), la cual se lleva a cabo en
el segundo biorreactor. Por último, en el tercer biorreactor se da el proceso de amplificación viral. El
diseño presentado en este artículo logró obtener un título viral de 10​11 UFP/mL en un régimen de
producción semicontinua, además de promover un bajo índice de desarrollo de resistencia por parte del
hospedero.
De acuerdo a los propios autores de los estudios antes descritos, la importancia de estos es
justificada bajo la premisa de que en un futuro cercano, la demanda de productos a base de
bacteriófagos sufrirá un crecimiento exponencial en diferentes áreas. Entre los campos involucrados se
incluyen los alimentos, la agricultura, la medicina humana y veterinaria, entre otros. Por lo tanto, es
necesario contar con procesos de producción que sean escalables y capaces de cumplir con las Buenas
Prácticas de Manufactura (BPM). Las técnicas de fabricación de productos biotecnológicos actuales
pueden ser adaptadas a la producción de bacteriófagos, teniendo en cuenta implicaciones importantes
​ 018).
en el diseño de las operaciones unitarias (Mancuso, ​et al., 2

2.3 Factibilidad técnica

2.3.1 Elección de bacteriófagos

Escherichia coli
Se ha demostrado en múltiples ocasiones la capacidad de formación de biofilm de varias cepas
de ​E. coli ​en superficies abióticas. Entre los factores que juegan un papel importante en el fenómeno de
adhesión, además de la cepa específica, se encuentra la temperatura del ambiente y la hidrofobicidad de
la superficie de adhesión (Galié, ​et al,​ 2018).
En un experimento realizado por Dourou ​et al (2011), se puso a prueba la adhesión,
sobrevivencia y crecimiento de ​E. coli O157:H7 en superficies de acero inoxidable y polietileno de alta
densidad (HDPE, por sus siglas en inglés), con el objetivo de simular condiciones de procesamiento de
carne de res. Se demostró que el conteo de células adheridas a la superficie de acero inoxidable
incrementó durante su almacenamiento a 15°C (temperatura de áreas de procesamiento de res durante
horas no productivas), durante 168 h, de 2.2 a 5.4 log UFC/cm​2​, y se mantuvo constante a 4°C
(temperatura de refrigeración), durante el mismo intervalo de tiempo.
Se ha determinado que la mayoría de las cepas patógenas de ​E. coli cuentan con mecanismos
de resistencia a entornos ácidos, como es el caso de la cepa patógena O26. Este tipo de mecanismos
permiten al microorganismo mantener su viabilidad aún después del tratamiento con agentes ácidos,
tales como los usados para la limpieza de equipos industriales de procesamiento de cárnicos. Además,
el serotipo O157:H7 ha sido identificado com un microorganismo resistente a las altas temperaturas, a
las altas presiones y a desinfectantes de uso común en la industria alimenticia (Carpentier, 2009).
En la actualidad se encuentran en el mercado diversos productos, basados en bacteriófagos,
que se enfocan a la infección y eliminación de ​E. coli en alimentos. Mientras que la mayoría de los
bacteriófagos empleados en estos productos se encuentran bajo una patente, muchos otros serotipos no
han sido caracterizados respecto a su capacidad de eliminación de biofilm, y, otros cuantos que sí han
sido probados, son comúnmente aislados de diversas fuentes ambientales.
 En el caso del bacteriófago T3 (ATCC® 11303-B3™), se demostró mediante un estudio de
microcalorimetría isotérmica (técnica que mide el calor generado por el crecimiento microbiano) el efecto
del bacteriófago, aplicado a diferentes concentraciones, en una capa de biofilm de ​E. coli ​TG1
(Tkhilaishvili, ​et al​, 2018). Entre los resultados obtenidos, se obtuvo una reducción significativa de 3 log​10
UFC/cm​2​. Desafortunadamente, el rango infectivo del bacteriófago en biofilm no ha sido estudiado a
profundidad, por lo que este sería definido una vez que se haya recibido la cepa.
El hospedero seleccionado para su cultivo es la cepa de ​E. coli B (ATCC® 11303™), ya que la
propia ATCC indica que una de sus aplicaciones es la propagación de bacteriófagos, además de que se
ha comprobado la capacidad del virus de infectar a dicha bacteria con facilidad y tiene un nivel de
bioseguridad de 1.

Staphylococcus
​La prevalencia de este género de microorganismo en las plantas que procesan carne cruda ha
sido demostrado incluso después de protocolos de limpieza y desinfección. Se ha encontrado que
pueden representar hasta un 34% de los microorganismos en las zonas de manejo de carne cruda​. Este
género de bacteria cuenta con cepas patógenas y no patógenas. Estas últimas, si bien no implican un
riesgo de salud inmediato para el consumidor, por la proporción en la que se presentan se sospecha que
pueden tener un papel importante en el enriquecimiento de biofilm multiespecies que favorece la
propagación de microorganismos patógenos ​(​Marouani-Gadri, 2009). Por esto han sido elegidas como
uno de los objetivos en el diseño de Bactroy.
Múltiples bacteriófagos han sido estudiados por su capacidad de reducir la carga de
Staphylococcus ​en alimentos (Moye, 2018). Sin embargo muchos de estos no han sido caracterizados
por completo y/o no se encuentran disponibles en repositorios públicos para su compra y uso con fines
de lucro. Una notable excepción a esto es el “Bacteriófago de ​Staphylococcus K”. Su genoma y
características específicas ya han sido estudiadas y reportadas en literatura (O’Flaherty, 2004). Así
mismo se encuentra disponible para compra en el catálogo de ATCC como “​Staphylococcus aureus
subsp. Aureus​ bacteriophage K (ATCC® 19685B1 ™)”.
El uso de este bacteriófago ha sido estudiado ​in vitro y se ha demostrado que, por lo menos
nueve especies diferentes de ​Staphylococcus s​ on susceptibles a infección: ​S. aureus, S. epidermidis, S.
saprophyticus, S. chromogenes, S. capitis, S. hominis, S. haemolyticus, S. caprae ​y S. hyicus
(O’Flaherty, 2005). Su aplicación también ha sido estudiada para la remoción de biofilm, encontrando
desde una significativa remoción hasta una completa eliminación dependiendo del tiempo de tratamiento
(Kelly, 2012).
Para la producción de este fago se reporta ampliamente su replicación en cepas de
Staphylococcus aureus,​ especie patógena del género (O’Flaherty, 2005; Kelly, 2012). Una alternativa
viable es el uso de la especie ​Staphylococcus xylosus​, una cepa utilizada comúnmente en
fermentaciones cárnicas y disponible en ATCC bajo el nombre de “Staphylococcus xylosus Schleifer and
Kloos (ATCC® 12162™)”. Con un nivel de Bioseguridad 1, se demostró que esta especie es altamente
competente para producir un fago que sigue teniendo actividad lítica en cepas de ​S. aureus a ​ isladas de
diversas fuentes (El, 2014).

Pseudomonas fluorescens
 Dentro de los microorganismos que destacan en la formación de Biofilm en la industria de
alimentos, se encuentran las pseudomonas, que son bacterias gramnegativas, cuyo metabolismo es
estrictamente respiratorio. De acuerdo con Law, B.A., et. al. (1977) en entornos industriales, la presencia
de P. fluorescens no es deseable pues es responsable del deterioro del producto debido a la producción
de lipasas y proteasas extracelulares resistentes al calor. Además, son de los organismos de deterioro
más documentados para carnes rojas, pescado y aves de corral por la capacidad que tienen de utilizar
un amplio rango de fuentes de carbono.
Se realizó un estudio sobre la persistencia de bacterias en superficies en contacto con cárnicos;
y la persistencia se logró más fácilmente con una cepa de ​P. fluorescens que con la cepa H7 de E. coli
O157 (Peneau et al., 2007). Por ende los resultados sugieren que las condiciones que conducen a la
persistencia de ​P. fluorescens pueden alcanzarse incluso cuando se aplican muy buenas prácticas
higiénicas.
En otro estudio realizado por Wang, et al. (2018) se vio como es la dinámica en la que se forma
el biofilm por Pseudomonas fluorescens relacionada al deterioro de la carne . Los resultados indicaron
que más de 4.5 log CFU / cm​2 de ​P. fluorescens ​se transfirieron a una superficie de acero inoxidable en
tan sólo el transcurso de 5 h, y la transferencia de bacterias ocurrió incluso después de una exposición
de solo 10 minutos.
Dada esa premisa, se dispuso necesario incluir en el cóctel de bacteriófagos, uno que tuviera
como diana a esta bacteria que si bien no es patógena, contribuye fuertemente a que la matriz de
exopolisacáridos del biofilm perdure y aloje a otros organismos patógenos.
Se propone el fago Φ (phi) S1, (ATCC® 27663B1™), pues de acuerdo con el experimento realizado por
Sillankorva, et al. (2010) se prueba que es eficiente como agente de control del biofilm que forma ​P.
fluorescens​ tanto en suspensión como en superfici​e.
Se obtuvo que el proceso de infección por fagos es dependiente de la temperatura y que la temperatura
óptima de infección es a 26°C. A esta temperatura, el bacteriófago alcanzó una Multiplicidad de Infección
(MOI) de 0.5, dando como consecuencia una reducción de biomasa de alrededor del 85% en ambos
casos.
Si bien se logró probar que el uso del bacteriófago funciona, es preciso recalcar que el estudio se
hizo en condiciones óptimas, que habría que probar si pueden controlarse en la industria; por lo que es
necesario combinar la infección con otros métodos basados en biocidas para alcanzar resultados más
eficaces hacia la degradación total del biofilm. La cepa productora de este bacteriofago puede ser
aislada de tierra, y también se encuentra en la ATCC como ​Pseudomonas fluorescens Migula (ATCC®
27663™), cuyo nivel de bioseguridad es de 1.

Listeria monocytogenes

L. monocytogenes es una especie bacteriana gram positiva no esporuladora, con la capacidad

de sobrevivir en ambientes extremos tales como altas concentraciones de sal y amplios rangos de
temperatura (​–0.4°C – 45°C​), pH (​4 - 9.6​) y actividad de agua; además, este microorganismo tiende a
formar biofilm en diferentes tipos de superficies y es especialmente frecuente en superficies de equipos
de procesamiento de carnes (​Kurpas, 2018​). La contaminación de los alimentos es la principal causa de
transmisión de ​L. monocytogenes y el 99.00% de los casos de listeriosis ocurren a causa de esto
(​Kurpas, 2018​). Como otras especies patógenas y formadoras de biofilm, ​L. monocytogenes
frecuentemente presenta resistencia a agentes desinfectantes, tratamientos con luz UV y desecación
(Muhterem-Uyar, 2015). Las zonas más comunes de crecimiento de esta bacteria, en plantas de
producción de alimentos listos para comer, son pisos, drenaje, bandas transportadoras, superficie de
equipos de acero inoxidable y cuartos fríos de almacenamiento (Kamlesh, 2010).

El bacteriófago propuesto para atacar este microorganismo presente en el biofilm es ​LiMN4L​,

que en conjunto con otros dos bacteriófagos, ​LiMN4p y LiMN17, también específicos de ​L.
monocytogenes, f​ ue probado en cocultivos de diferentes cepas de este microorganismo con el objetivo
de simular un ambiente más apegado a la realidad (​Ganegama​, 2013); ya que el bacteriófago no está
disponible en reservorios de los que se puede adquirir, puede seguirse el método de este estudio para
aislarlo.

2.4. Especificaciones del producto

2.4.1 Instrucciones de uso del producto

Dentro de nuestros compromisos con el cliente, MEPS Solutions busca garantizar que el método
de uso de nuestro producto actúe de la manera más eficiente. Nuestra propuesta teórica consiste en la
aplicación de la solución de Bactroy, diluida en agua desmineralizada hasta una concentración de
1x10​8​PFU/mL. ​Mediante una pistola rociadora se aplica la solución sobre la superficie procurando que se
cubra en su totalidad.
En literatura se reporta el uso de bacteriófagos para la desinfección de superficies. Bajo
condiciones de laboratorio se ha encontrado que tras la aplicación de cantidades tan pequeñas como
100 μL por cada 625 mm​2 se logra ver una disminución en la cantidad de patógenos, un aumento en
este volumen o concentración de fagos puede mejorar la efectividad del producto. Una concentración de
fagos de 1x10​8 PFU/mL puede reducir hasta 16 veces el número de microorganismos encontrados en
una superficie (Abuladze, 2008).
El ciclo lítico de un bacfteriófago suele concretarse entre 20-40 minutos (Mathews, 1994). Sin
embargo, el efecto deseado de un bacteriofago como desinfectante de superficies se basa únicamente
en la lisis por el proceso inicial de adsorción (Abuladze, 2008). En este contexto, a pesar de que un ciclo
completo puede tomar hasta 40 minutos, se puede considerar que cualquier bacteria que entre en
contacto con un fago ya ha sido eliminado, desde el momento de aplicación. Por esto es prioridad
garantizar que la mayor parte de la superficie entre en contacto con el producto. (Sulakvelidze, 2010)
La concentración de trabajo de nuestro producto se estableció de acuerdo a la sugerida de dos
productos que ya se encuentran en el mercado: ShigaShield​TM de Intralytix y SalmoPro​(R) de Phagelux.
Se consultó la solicitud de GRAS enviada a la FDA de cada uno de los productos, donde se hace una
descripción detallada del proceso de elaboración y las características específicas de uso. (Phagelux,
2015; Intralytix, 2016)
​Es importante recalcar que se espera que Bactroy sea incorporado a los protocolos de limpieza
ya establecidos de nuestros clientes. Para comenzar a explorar esta posibilidad se comenzó por
investigar protocolos que se encuentran en uso en industrias de producción de carnes frías. La
información fue proporcionada por el representante de la División de Alimentos de ECOLAB. Los
procedimientos de limpieza se llevan a cabo en una planta de producción de carnes frías en México. De
acuerdo con el proveedor el tiempo aproximado del lavado de rutina de una línea promedio es de 3
horas, y se realiza entre cada lote fabricado; esto quiere decir que se llevan a cabo aproximadamente 1 o
2 lavados al día. En la mayoría de los casos las líneas trabajan constantemente, con un par de horas o
menos entre lote y lote; otras con menos saturación de producción, tienen más tiempo entre cada lote.
Los dos protocolos que nos compartieron son de una tina tipo chiller y un ahumador marca
Fessman. Resulta evidente que para cada empresa y cada equipo los protocolos serán diferentes y el
mejor momento de adición de Bactroy también cambiará. Será necesario un análisis particular para caso
de aplicación.
Como un ejercicio demostrativo se describirán las características que se recomendarían para los
protocolos que se obtuvieron. Como antecedentes, los productos utilizados en los procedimientos
descritos tienen las siguientes características generales:
● Bevro Sheen: detergente alcalino para eliminar grasa.
● Liquido K: detergente ligeramente alcalino auto espumante o aditivo para hacer espuma.
● Vortexx: desinfectante, aplicado por recirculación, aspersión o inundación de equipo de acero
inoxidable, elimina carga microbiológica de manera efectiva.
● Enforce LP: Detergente alcalino clorado para eliminar suciedad mediante espuma, puede
utilizarse para realizar limpieza externa.
● AC-101: detergente alcalino para eliminar grasa por recirculación.​:

2.4.1.1. Caso demostrativo: Tina tipo chiller

​La tina tipo chiller es ampliamente utilizada en la industria de producción de embutidos como un
método de enfriamiento rápido tras la cocción inicial de las carnes frías (FYMSA, 2017). Debido a los
altos niveles de humedad constante y alto contenido de restos de materia orgánica puede ser una fuente
de contaminación. Si bien las temperaturas usadas usualmente son menores a los 4°C algunos
microorganismos pueden llegar a sobrevivir a estas condiciones, entrando en fase latente. En la Figura 7.
se resume el protocolo actualmente utilizado para lavar este equipo.
Nuestro producto busca eliminar la carga microbiana que permanece tras los procedimientos y
métodos químicos. Por lo que se sugeriría su aplicación tras el choque térmico realizado con agua
desmineralizada a 50°C, con un tiempo de reposo de 15 minutos. La finalidad del paso posterior, adición
de Vortexx, es mantener el equipo estéril hasta su próximo uso. La alta acidez de Vortex (pH=0.9)
(ECOLAB, 2014), inactivaría los fagos y el enjuague previo al inicio de operaciones asegura la limpieza
completa de ambas soluciones.
Es importante mencionar que estos pasos mencionados son principalmente para el lavado del
interior de la tina del equipo. Hay alguna piezas que no pueden ser sumergidas en las soluciones como
se menciona en el protocolo. Para estas es especialmente útil la aplicación de Bactroy, pues reducirá la
carga microbiana que un lavado manual no pueda retirar.
Figura 7​​. Procedimiento de lavado y desinfección de tina tipo chiller.
2.4.1.2. Caso demostrativo: Tina tipo Ahumador Fessman.

Hay algunos equipos que tienen un protocolo simplificado de limpieza, ya que cuentan con
sistemas de limpieza automáticos. Tal es el caso de la ahumadora que se está proponiendo en este caso
demostrativo (Fessmann, 2018). Inclusive en la descripción, mostrada en la Figura 7 se especifican
únicamente los pasos necesarios para la limpieza de los paneles donde se colocan los embutidos.
Nuevamente, al igual que en el caso demostrativo anterior, Bactroy no está diseñado para
mantener la esterilidad de los equipos hasta su nuevo uso. Siendo nuestro principal objetivo eliminar
bacterias remanentes tras los lavados principales, se recomienda añadirlo como un paso previo a la
aplicación de Vortexx y reposar 15 minutos. De esta manera se elimina la necesidad de un paso de
enjuague adicional.

Figura 8.​​ Procedimiento de lavado y desinfección de paneles de cocción de Ahumador Fessman.

2.4.2. Superficie cubierta por el equipos
De acuerdo a las instrucciones de uso de SalmoProⓇ (cuya concentración de operación es de
10​ UFP/mL), la dosis de aplicación del producto puede ser de 10​8 ​UFP/g de alimento a tratar, es decir, 1
8

mililitro de producto debe ser aplicado por cada gramo de alimento, o de 0.2 mL de producto

2.4.3. Vida de anaquel

El método para preservar nuestro producto Bactroy se definió de acuerdo a lo reportado por
Phagelux en la solicitud GRAS de SalmoPro (PhageLux, 2015). En este documento se especifica que el
producto se puede almacenar en buffer TMN hasta por un año en condiciones de refrigeración (2-6°C).
Estas condiciones sólo son válidas si la solución de producto se encuentra estéril al momento de su
envasado, pensando en esto se adicionó la última filtración con membrana de 0.45 μm.
En la literatura se reporta la composición del buffer TMN como: NaCl (100mM), MgCl​2 (50mM),
Tris-Cl (100mM) y Tween 20 (0.05% v/v) a un pH de 9.5 (TMN, 2009). En esta formulación el NaCl y el
MgCl​2 juegan un papel importante al ser moléculas que facilitan la adsorción del fago a la superficie de la
bacteria (Epstein, 1974). Para el uso de este buffer en nuestro producto se omitirá la adición de Tween
20, ya que los detergente no iónicos van a tener un efecto inhibitorio en la adsorción y replicación de
fagos (Okafor, 2007).

2.3 Diagrama de Flujo

A continuación se presenta el diagrama de flujo de nuestro proceso para la elaboración del
producto a base de bacteriófagos Bactroy. Este proceso fue adaptado de las propuestas elaboradas por
las empresas PhageLux e Intralitix (PhageLux, 2015, Intralitix, 2015). Ambas empresas tienen procesos
establecidos para la producción de fagos con aplicaciones sobre superficies de alimentos. De acuerdo a
las especificaciones de nuestro proceso fue que adaptamos sus operaciones unitarias y secuencia de
producción como se muestra en la Figura 9
Figura 9. ​Diagrama de flujo del proceso de producción de Bactroy. Adaptado por Daniela Rosales de:
Phagelux, 2015, Intralitix, 2016

2.4 Diagrama de Proceso

El proceso de manufactura de Bactroy comienza con la preparación de un preinóculo de 50 mL,
por cada una de las cepas hospederas, que puede provenir de un lote previo o de una muestra
criopreservada. El volumen total es empleado para inocular el tanque semilla (ST-n) con volumen de
operación de 1 L de medio de cultivo, cuya composición se muestra en la tabla X. Este último cultivo
tiene que alcanzar una densidad óptica a 600 nm (OD​600​) de 0.6, para avanzar en el proceso. En este
punto, una muestra de 50 mL es recolectada y tratada para su criopreservación y almacenamiento (figura
10 (diagrama de inóculos)). El resto del volumen ingresa al proceso principal de producción.
 Figura 10. ​Escalamiento de inóculo bacteriano previo al proceso de producción de Bactroy

Las etapas que se describen a continuación son repetidas por cada uno de los bacteriófagos a
producir, por lo que únicamente se hará la descripción de la fabricación de un bacteriófago individual.
Por medio de una manguera de latex, 950 mL de inóculo son transportados al biorreactor de
cultivo bacteriano (BB-n) el cual contiene 9 L de TB, previamente esterilizado en el interior del
biorreactor. En este punto comienza la etapa de cultivo bacteriano, cuyo propósito es promover una tasa
óptima de reproducción para alcanzar una concentración celular de 20 g de biomasa/L de medio de
cultivo. El crecimiento bacteriano es monitoreado durante todo el cultivo mediante un sensor de densidad
óptica acoplado a la jarra del biorreactor. Una OD​600​de 0.6 (Agboluaje & Sauvageau, 2018) implica que la
concentración bacteriana deseada ha sido alcanzada, y que la etapa de propagación viral debe dar
inicio, por lo que el volumen entero del BB-n es bombeado al biorreactor de cultivo viral (BF-n), donde se
agrega el inóculo viral.
Los inóculos virales, al igual que los bacterianos, son almacenados a -20°C y son descongelados
solo hasta el momento previo a su adición. La producción de bacteriófagos en condiciones controladas,
trae consigo una serie de aspectos extras a considerar. Variables adicionales a aquellas de una
fermentación bacteriana, tales como la multiplicidad de infección (MOI, por sus siglas en inglés), que
contempla la relación entre número de partículas virales en el inóculo y número de hospederos viables al
momento de la infección, deben ser determinadas de acuerdo al perfil específico de la fermentación
(Agboluaje & Sauvageau, 2018). De acuerdo a estos autores, es recomendable que la inoculación del
cultivo en lote se realice a una MOI de entre 0.001 y 0.01, esto ya que se favorece un título viral mayor y
una cantidad menor de residuos celulares. En los 4 cultivos, la MOI es de 0.01. Con el fin de asegurar la
producción máxima de bacteriófagos, el cultivo viral tiene una duración aproximada de 8 horas, a partir
de su inoculación (Agboluaje & Sauvageau, 2018). Es posible conocer el punto de lisis poblacional
mediante el monitoreo de la OD​600 (identificado por su disminución significativa o alto total de su
incremento). Durante ambas etapas de cultivo se monitorean los parámetros de oxígeno disuelto y pH.
Una vez finalizada la etapa de cultivo, comienzan las etapas de separación. Dado que los
bacteriófagos han lisado sus bacterias hospederas y además se encuentran en suspensión en el caldo,
no es necesario incluir un paso de disrupción celular. El primer paso por lo tanto, consiste en la
clarificación del cultivo mediante filtración tangencial. El volumen total del BF-n es bombeado a través de
una manguera de látex, a razón de 13.89 mL/s, hasta la unidad de microfiltración (MF-n), cuya
membrana tiene un tamaño de poro de 0.45 μm. Este punto de corte permite la remoción de residuos de
membrana, pared celular, algunos organelos, así como bacterias que no fueron lisadas (residuos
grandes). El permeado, que contiene la solución estéril de bacteriófagos, avanza a la siguiente
operación, mientras que el retenido de restos celulares . El tiempo total de esta filtración es
aproximadamente 12 minutos.
Tras remover la mayoría de los restos celulares, la solución de bacteriófagos es bombeada
nuevamente a razón de 13.89 mL/s a través de una membrana de ultrafiltración (UF-n) con punto de
corte de 100 kD. El propósito de esta operación es separar proteínas y otras macromoléculas residuales,
provenientes del cultivo celular (residuos pequeños). En esta ocasión, el retenido contiene a los
bacteriófagos de interés (solución concentrada de bacteriófagos), mientras que el permeado acarrea los
residuos pequeños. Considerando que el área total de membrana es la misma en todas las operaciones
de filtración, el tiempo estimado de ultrafiltración es de 20 minutos. Es importante destacar, que los
procesos de micro y ultrafiltración de cada bacteriófago individual se llevan a cabo en el mismo equipo de
filtración, únicamente serán intercambiados los cassettes de filtración de acuerdo a la operación de
separación. Además de remover los residuos pequeños, la ultrafiltración anterior permitió la pérdida de la
mayor parte del volumen de medio de cultivo. En este punto del proceso se realiza una toma de muestra
para llevar cabo el primer control de calidad (CC1), el cual consiste únicamente en las pruebas de
potencia e identidad, descritas en la sección 4.2.1. Una segunda muestra del lote es tomada y tratada
para su preservación a -20 °C (Golec ​et al., 2 ​ 011) para ser utilizada como inóculo en lotes posteriores.
Un lavado con buffer TMN (formulación presentada en la tabla ​X​) mediante diafiltración (DF-n) es
el siguiente paso del proceso. En este caso, un volumen de buffer igual al volumen de líquido perdido
durante la ultrafiltración es añadido. El tamaño de poro de la membrana de diafiltración es de 100 kD y el
proceso completo es realizado en 30 minutos. La etapa de diafiltración tiene como resultado una solución
monofágica con concentración de 4.06×10​10 ​UFP/mL.

Tabla 2​​. Composición del buffer TMN

Componente Concentración

Tris 50 mM 100 mM

MgCl​2 50 mM

NaCl 100 mM

Las soluciones monofágicas son transportadas en proporción 1:1 (en cuanto a título) a
un tanque de mezclado (MT-1), donde se da la dilución y formulación final con buffer TMN de la
mezcla de los cuatro bacteriófagos. Al final de esta etapa, la concentración de bacteriófagos
individuales es cercana a 10​10 UFP/mL. La mezcla es circulada a través de una unidad de
microfiltración (MF-5), con un tamaño de poro de 0.45 μm. El permeado, constituido por la
mezcla estéril de bacteriófagos, es bombeado a un tanque de almacenamiento, donde espera
al proceso manual de llenado de envase. Nuevamente, se toma una muestra, cuya constitución
es la misma del producto final para el segundo punto de control de calidad (CC2), y en esta
ocasión se realizan las cuatro pruebas de control de calidad descritas en la sección 4.2.1. Una
vez que el total de las pruebas han sido aprobadas, el lote es liberado para su venta.

Figura 11​​. Diagrama de proceso

​ odos los residuos generados, tanto en las fermentaciones, como en las filtraciones, son de
T
naturaleza biológica. Además, ninguna de las cepas bacterianas empleadas es patógena. Por este
motivo, la totalidad de los residuos generados en la línea principal de producción serían secados
mediante calor y vendidos para ser usados como alimento de animales.

2.5 Localización de Planta (Laboratorio)

​Los clientes a los que está a dirigido el producto son industrias de producción de embutidos. A
nivel nacional los tres principales estados en este rubro son, en orden: Nuevo León, Estado de México y
Jalisco. Únicamente dos estados tienen producción destinada a la exportación: Nuevo León y
Chihuahua. (Romo, 2018)
Debido al monitoreo constante que se realiza en los productos de exportación, hay que
considerar que las industrias de estos últimos dos estados pueden tener una mayor apertura a comprar
productos que le den un valor agregado adicional a su producto.
Con este objetivo en mente elegimos tres posibles localizaciones de la planta, a continuación se
muestra la matriz de decisión para determinar cuál de las opciones sugeridas resulta más estratégica.

Tabla 3.0​​ Matriz de decisión para la elección de localización de planta de producción.

A Jalisco
B Nuevo León
C San Luis Potosí

​El Los criterios de selección están ponderados dando más peso al costo del terreno.
El estado seleccionado fue Nuevo León, principalmente por el impulso que da el gobierno estatal a
desarrollos industriales. Estos apoyos se ven significativamente reflejados en subsidios a pago de
servicios.- Adicionalmente en este estado se encuentra una importante proporción del mercado al que
buscamos dirigir nuestro producto.
Figura 12. Layout del laboratorio.

2.6 Balance de Materia

Se realizó el balance de materia de cada una de las etapas principales del proceso de
producción de Bactroy. Los resultados obtenidos en el mismo fueron considerados dentro de la selección
de equipos y proveedores de insumos, por lo tanto, tienen un fuerte impacto sobre los costos de
instalación y producción.
El balance de materia de la primera fermentación se presenta en la tabla X. El cálculo de los
flujos presentados en este balance se basa en la siguiente ecuación de reacción biológica:

C 6 H 12 O6 + O2 + N H 3 → C H 1.77 O0.49 N 0.24 + CO2 + H 2 O

La fórmula química C H 1.77 O0.49 N 0.24 corresponde a la composición química aproximada de ​E.
coli​ (Doran, 2013). En esta reacción, se contempla a la glucosa como fuente de carbono y al amoniaco
como fuente de nitrógeno. Los medios de cultivo usados para las fermentaciones son diferentes para
cada cepa a producir (tabla X), pero todos tienen en común estas fuentes de carbono y nitrógeno.
 La ecuación anterior no se encuentra balanceada estequiométricamente, por lo que este es el
primer paso del balance de materia, de tal forma que los coeficientes a-e son usados para plantear el
balanceo:
C 6 H 12 O6 + a O2 + b N H 3 → c CH 1.77 O0.49 N 0.24 + d CO2 + e H 2 O

De tal forma que las ecuaciones de balanceo atómico son:

C : 6=c+d
H : 12 + 3b = 1.77c + 2e
O : 6 + 2a = 0.49c + 2d + e
N : b = 0.24c
Requerimos una quinta ecuación para encontrar el valor de los 5 coeficientes. Doran (2013)
sugiere hacer uso del cociente respiratorio (​RQ​), el cual se define como:

moles de CO2 producidos d

RQ = moles de O2
= a

Pare este caso particular, y de acuerdo a lo reportado por Andersen & von Meyenburg (1980), el
RQ​ de ​E. coli, u
​ sando como fuente de carbono glucosa es ​RQ= ​ 1.01. Resolviendo el sistema de
ecuaciones se obtiene la siguiente ecuación estequiométricamente balanceada:

C 6 H 12 O6 + 3.794 O2 + 0.52033 N H 3 → 2.168 CH 1.77 O0.49 N 0.24 + 3.832 CO2 + 4.8618 H 2 O

El balance de materia del cultivo bacteriano se reporta en la tabla X. Las principales

suposiciones para este balance son: no hay fugas de ningún tipo, los flujos de aire y gas son secos.
Además, los medios de cultivo empleados son medios complejos, por lo que resulta complicado conocer
la cantidad exacta de glucosa y amoniaco que posee. De esta forma, las cantidades iniciales de ambas
especies químicas serán calculadas en función de la cantidad de biomasa que se espera producir.
Teniendo en cuenta que habrá un remanente de glucosa y amoniaco. Otras consideraciones importantes
son: el volumen de operación del biorreactor es de 10 L, el inóculo bacteriano es de 0.95L (a una
concentración aproximada de 20 g/L), la concentración celular final esperada es de 20 g/L (fue a partir de
este valor que se calcularon el resto de los flujos), entra un exceso de aire de 30%

Tabla X. Balance de materia de la fermentación bacteriana. Los datos se reportan en kg.

La tabla X muestra el balance de materia de la etapa de producción viral. En este caso, el balance se
encuentra en términos de UFC y UFP, esto por practicidad del cálculo. Las principales suposiciones en
este caso son: no hay fugas de ningun tipo, el total de los microorganismos hospederos es
lisado (Agboluaje & Sauvageau, 2018) y el MOI de inoculación es 0.01, se considera una tasa
de viabilidad celular de 80% y un ​burst size (cantidad de bacteriófagos liberados por célula) de
​ 014). Se presenta además en esta tabla, la concentración aproximada de
125 (Alves, ​et al., 2
UFP por mililitro.

Tabla X. Balance de materia de la producción de bacteriófagos individuales

Para la primera fase de microfiltración (0.45 μm) se va a tener una separación de los componentes de las
células lisadas. De este peso total se tiene un 75% de residuos pequeños (agua, iones, ácidos nucleicos,
lípidos, entre otros), el 25% se compone de residuos grandes (principalmente células sin lisar y restos de
membrana) (Cooper, 2000). Otras suposiciones son: no hay fugas de ningun tipo, la masa total de
residuos grandes se mantiene en el retenido, la membrana, de acuerdo al proveerdor, tiene una
eficiencia de separación de 95% y se pierde un 5% de agua en el retenido. El balance de materia para
esta etapa se encuentra en la tabla X. A excepción de los bacteriófagos, el resto de los componentes se
presentan en kilogramos.
Tabla X. Balance de materia para la etapa de esterilización de solución monofágica
La tabla X presenta el balance de materia para la etapa de ultrafiltración (100 kD). En este punto las
suposiciones son: no hay fugas de ningun tipo, el total de los residuos pequeños son removidos en el
permeado y los bacteriófagos se mantienen en el retenido. Nuevamente, a excepción de los
bacteriófagos, el resto de las corrientes por especie se encuentran reportadas en kg.

Tabla X. Balance de materia para la etapa de concentración de solución monofágica

Durante la diafiltración ingresa la misma cantidad de buffer que la cantidad de agua que fue perdida
durante la ultrafiltración. El balance de materia resultante se reporta en la tabla X.

Tabla X. Balance de materia para la diafiltración

La penúltima etapa del proceso consiste en la mezcla de los 4 bacteriófagos y su dilución a lo
que sería la concentración comercial del producto. La tabla X y X resumen el balance de
materia para el tanque de mezclado. Al finalizar este proceso, aún falta una etapa de filtración,
cuyo objetivo es esterilizar el producto finalizado. Al final del proceso se obtienen
aproximadamente 154 L o poco menos de 31 envases de 5 L de Bactroy.

Tabla X. Balance de materia del proceso de mezclado

2.7 Costos Operativos
MÓDULO 3: DISEÑO DE OPERACIONES UNITARIAS

3.1 Análisis de Operación

Las distintas etapas y operaciones unitarias del proceso de producción de Bactroy se
encuentran representadas en el diagrama de flujo (figura X). A continuación se realizará un
análisis detallado de cada una de ellas.

3.1.1 Cultivo bacteriano

Los principales métodos de cultivo de bacteriófagos que han sido descritos son: cultivo
en lote, cultivo continuo, cultivo continuo en dos etapas y cultivo cíclico en dos etapas
(​Agboluaje & Sauvageau , 2018)​. El tipo de cultivo del proceso de producción de Bactroy es
considerado un cultivo en lote en dos etapas y la justificación de esta selección será explicada
en el punto 3.1.2.
La primera etapa consiste en la reproducción del microorganismo hospedero. El
principal objetivo en este punto del proceso es conseguir una densidad celular óptima, ya que
serán estas bacterias quienes se encargaran de la fabricación de los bacteriófagos de interés.
El volumen estimado de producción permite que el cultivo bacteriano se lleve a cabo en
una fermentación tipo lote. Por este motivo, el cultivo es detenido una vez que se alcanza una
concentración celular cercana a 5×10​8 UFC/mL (aproximadamente OD​600​=0.6). Los medios
seleccionados para el crecimiento de cada una de las células hospederas se encuentran
reportados en la tabla X y estos fueron escogidos de acuerdo a las fichas técnicas del
proveedor.
Tabla X. Medios de cultivo a emplear durante ambas fases de cultivo
Microorganismo Medio de cultivo a emplear

E. coli Caldo triptona de soya

L. monocytogenes Caldo de infusión

cerebro-corazón

S. xylosus Caldo de infusión

cerebro-corazón

P. fluorescens Caldo nutritivo

3.1.2 Cultivo de bacteriófagos
El objetivo principal de esta etapa es obtener un título alto de bacteriófagos. Este
proceso se lleva a cabo en un segundo biorreactor, en una fermentación tipo lote. Al manejar el
cultivo viral en un biorreactor diferente, se disminuye la probabilidad de que los
microorganismos hospederos generen resistencia a la infección de sus huéspedes (​Agboluaje
& Sauvageau , 2018)​. Además, este diseño de proceso permite que el biorreactor de cultivo
bacteriano quede libre para iniciar un segundo lote de producción. Como se ha discutido en la
sección 2.2.1, el control de las condiciones del cultivo viral es esencial para la obtención de
altos títulos finales de producto. Por este motivo, se han seleccionado equipos que cuenten los
controladores necesarios para proveer un ambiente óptimo de cultivo.
De acuerdo al proveedor, los biorreactores a adquirir (tanto de cultivo bacteriano como
de cultivo viral) son de borosilicato y acero inoxidable AISI 316L y cuentan con sensores
internos de: pH, oxígeno disuelto, turbidez, nivel de líquido. Además, incluyen sistema de
agitación por propela tipo Rushton de 6 palas, sistema de aireación con filtros, sistema de
bombeo para el control de pH y antiespumante, y son completamente esterilizables en
autoclave.

3.1.3 Primera microfiltración

El producto resultante de la última fermentación es un caldo que contiene los restos
celulares de la bacteria hospedera (en su mayoría lisadas), productos metabólicos bacterianos,
agua, sustrato remanente y los bacteriófagos de interés. La primera operación de membrana es
realizada con un tamaño de poro de 0.45 μm. El objetivo de este tamaño de poro es la
retención de la mayoría de los residuos celulares y el permeado de una solución estéril de
bacteriófagos.
Las operaciones de separación siguen generalmente el siguiente orden lógico:
recuperación, concentración, purificación y acabado (esquema RIPP, por sus siglas en inglés).
En este esquema, las operaciones que implican una baja resolución de separación son
utilizadas en la recuperación y concentración, mientras que operaciones de alta resolución
están implicadas en la purificación y el acabado. La microfiltración entra en la categoría de
recuperación (Tejeda, ​et al., ​2011). La ausencia de residuos de gran tamaño después de este
tratamiento permite la implementación de procesos de separación posteriores más finos y
eficientes.
El fenómeno de transporte predominante en este proceso es la transferencia de
momentum. Esto se explica ya que, durante el proceso de filtración, el caldo de cultivo fluye a
través de la membrana gracias a un gradiente de presión generado por una bomba peristáltica.
Este tipo de bomba fue seleccionado debido a que carecen de un efecto agresivo sobre los
fluidos con partículas biológicas en suspensión. Es decir, para evitar la degradación del
producto debido la acción agresiva de una bomba centrífuga o de desplazamiento positivo.

3.1.4 Ultrafiltración
La etapa de ultrafiltración implica una membrana con tamaño de poro de 100 kD. Este
punto de corte permite el filtrado de los residuos más pequeños de la fermentación bacteriana.
Entre estos residuos se encuentra el ADN bacteriano, el cual se ha comprobado que es el
contaminante que se encuentra en mayor cantidad después de la lisis poblacional (​Smrekar, ​et
al​., 2011). Al ser un tamaño de poro tan pequeño, los bacteriófagos de interés no atraviesan la
membrana y quedan en el retenido. Esto permite a su vez, que grandes cantidades permeen la
membrana y la solución estéril de bacteriófagos aumente su concentración. Nuevamente, el fenómeno
de transporte predominante es la transferencia de momentum, debida a la diferencia de presiones
generada por la bomba de la unidad de filtración.

3.1.5 Diafiltración
La solución, o torta, que se mantuvo retenida en la membrana es diluida, en esta
ocasión por buffer TMN, cuya composición es la misma que el buffer del producto finalizado. La
adición de este buffer cumple con propósitos (dos de ellos presentados en sección 2.4.3): el
primero de ellos es lavar la solución concentrada de bacteriófagos, al mismo tiempo que son
filtradas residuos pequeños remanentes. Además, de acuerdo a lo observado en otros
productos a base de bacteriófagos ​(PhageLux, 2015), el buffer TMN brinda un ambiente
propicio que alarga la vida de anaquel del producto. Por último, el NaCl y el MgCl​2​,
componentes del buffer TMN son moléculas que facilitan la adsorción viral a la superficie
bacteriana ​(Epstein, 1974). El fenómeno de transporte principal en esta etapa es la
transferencia de momentum. Sin embargo, la transferencia de masa juega también un papel
importante en los procesos de diálisis por membrana, ya que es la diferencia de concentración
la que permite el flujo de especies moleculares a través de la membrana.

3.1.6 Mezclado
Bactroy es un cóctel de 4 bacteriófagos, en concentraciones similares (10​10 UFP/mL).
Por este motivo, un proceso de mezclado homogéneo es requerido al final de la línea de
producción de las soluciones monofágicas. El equipo seleccionado para llevar a cabo esta
operación es un tanque, con 4 baffles en su pared interna, y un agitador tipo rushton. El
agitador tipo rushton permite que el proceso de mezclado se lleve a cabo en un régimen de
flujo radial. Además, los baffles evitan que se genere un patrón constante de mezclado. El
fenómeno de transporte predominante en esta operación es la transferencia de momentum.
Esta se da gracias la diferencia de presiones generada por el movimiento del agitador.

3.2.7 Segunda microfiltración

La última microfiltración tiene el propósito de esterilizar el producto antes de ser
envasado. La necesidad de esta operación yace en la etapa previa, donde buffer TMN no
estéril fue añadido al tanque de mezclado para diluir la solución. Nuevamente, PhageLux
(2015) reporta que la vida de anaquel de sus productos, a las condiciones de temperatura
adecuadas, es mantenida únicamente si el producto se mantiene estéril. Por lo tanto, el
propósito del último proceso de membrana es elevar la vida de anaquel de Bactroy.

3.2 Caracterización de Equipo

La tabla X presenta las condiciones de operación seleccionadas por cada uno de los equipos del
proceso principal.

Tabla # Descripción de las características de cada equipo utilizado durante la producción de Bactroy así
como sus requerimientos adicionales.
3.3 Estimación de Capacidades
Para la estimación de capacidades de nuestra planta se hizo una proyección a partir de
un mercado nacional conocido. Determinando así el total de litros necesarios al año para cubrir
las necesidades de nuestros clientes. Partiendo de esto es importante conocer características
de nuestras cepas productoras tales como rendimiento, tiempo de duplicación, sustrato y
condiciones generales de crecimiento. Una vez que tienes definidos estos factores debes
estudiar, mediante un balance de materia, la cantidad de cultivo que es necesaria para obtener
el producto establecido como meta. Con esta información es posible realizar una planeación de
insumos, adquisición de equipos y gasto energético programado para el posterior análisis de
costos.

Figura #. Algoritmo de diseño para planear los requerimientos para la producción anual de Bactroy.

3.4 Consulta con Proveedores

Biorreactores de 10 L.
Para el proceso de Bactroy se necesitan 8 vasos con una capacidad de 10 L cada uno; para economizar
en la inversión se buscó que por cada torre de control se manejen 2 vasos.
La consulta fue realizada con Saúl Guevara, manager de producto de la marca Sartorius. La cotización
fue de $65,000 US ($1,332,623.50 MXN).

Unidades de Filtración
Otro de los equipos cruciales para el proceso es la unidad de filtración tangencial, ya que con ella es
posible realizar tanto la microfiltración como la ultrafiltración, cambiando sólo las membranas. También
de marca Sartorius, esta unidad conocida como Sartoflow Study permite procesar hasta 200 L durante 4
horas. Su costo es de $40,000 US ($807,012 MXN).

Se utilizarán también 2 unidades de diafiltración, para las que se consideró la marca EMD Millipore,
cotizada en $2500 U.S. ($51,300 MXN).
Bombas
-Centrífuga
Se cotizó la marca Siemens , ya que esta bomba permite el paso de 98 litros por minuto, y la potencia de
su motor es de 750 W.
-Peristáltica
De la marca Shenchen, se encontró esta opción con un ​rango de caudal: 0.000166-1330 ml/min, es ideal
para el cuidado durante el transporte de los fagos

Tanque de mezclado
Se buscó uno de capacidad de 200 L , cuesta $19,000 MXN y es de agitación central de acero
inoxidable, la marca que se consideró fue : Hubei Hengfeng Medical and Pharmaceutical Equipment Co.

Tanque de almacenamiento
La capacidad que se requiere es de 400 L, y de la marca Inoximexico se cotizó uno en $22,200 MXN.

MÓDULO 4: CONTROL Y ASEGURAMIENTO DE CALIDAD

4.1 Normas Nacionales e Internacionales

Tanto en la normatividad nacional, como la internacional, Bactroy pertenece a la clasificación de

pesticida. De acuerdo con la Environmental Protection Agency (EPA) el biofilm o biopelícula es una capa
conformada por conglomerados de bacterias u hongos y es además considerado una plaga; por lo tanto
cualquier sustancia o mezcla de sustancias cuyo propósito sea prevenir, destruir, repeler o mitigar biofilm
formado sobre una superficie inanimada, es considerado un plaguicida y debe seguir las normas de
etiquetado, envasado y métodos de validación para esta clasificación de producto (Thomasino, 2014).
Además la EPA indica que los plaguicidas antimicrobianos pueden clasificarse en tres grupos:
​ ​esinfectante; y sanitizante, que es una sustancia o mezcla de sustancias utilizada para
esterilizante; d
reducir, pero no necesariamente eliminar, los microorganismos de superficies inanimadas a niveles
considerados seguros según lo determinado por los códigos o regulaciones de salud pública, estos a su
vez se dividen en dos de acuerdo a su uso: para superficies en contacto con alimentos y superficies que
no están en contacto con ellos.
De acuerdo con esto, Bactroy es un plaguicida antimicrobiano de tipo sanitizante para uso sobre
superficies en contacto con alimentos, por lo que nos referiremos a él de esta manera, incluyendo el
etiquetado.

4.1.1 Normas Nacionales

NOM-034-SSA1-1993, BIENES Y SERVICIOS. PRODUCTOS DE LA CARNE. CARNE MOLIDA Y

CARNE MOLIDA MOLDEADA. ENVASADAS. ESPECIFICACIONES SANITARIAS. ​Se establecen los
límites máximos referidos a la calidad microbiológica de los productos de carne molida. Los límites
máximos son:

Mesofílicos aerobios 5,000,000 UFC/g

Salmonella spp. ​Ausente en 30 g de muestra
Staphylococcus aureus 1 ​ 000 UFC/g

Además, el producto final debe tener ausencia de materia extraña (definida como una fuente de
contaminación orgánica o inorgánica).

NOM-044-SSA1-1993, ENVASE Y EMBALAJE. REQUISITOS PARA CONTENER PLAGUICIDAS.

Principalmente se enuncian las características que deben cumplir envases, entre las cuales se
encuentran cuestiones de diseño práctico, resistencia, vida media del envase, entre otras.

NOM-045-SSA1-1993, PLAGUICIDAS. PRODUCTOS PARA USO AGRÍCOLA, FORESTAL, PECUARIO,

DE JARDINERÍA, URBANO E INDUSTRIAL. ETIQUETADO. ​Se establecen las indicaciones y
características que debe presentar la etiqueta comercial de los productos plaguicidas con aplicación
industrial.

NOM-213-SSA1-2002, PRODUCTOS Y SERVICIOS. PRODUCTOS CÁRNICOS PROCESADOS.

ESPECIFICACIONES SANITARIAS. ​Entre otros parámetros, se establecen los límites máximos en
cuanto a calidad microbiológica de los productos cárnicos procesados.
De donde es remarcable mencionar que para productos cocidos los niveles aceptables de mesófilos son
de entre 10,000​1​ a 60,000​2​ UFC/g y <3 NMP/g para coliformes fecales.
Otro punto relevante es que para productos ya sean cocidos, crudos o curados, la Salmonella deberá
estar ausente.

NOM-052-SEMARNAT-1993, QUE ESTABLECE LAS CARACTERÍSTICAS DE LOS RESIDUOS

PELIGROSOS, EL LISTADO DE LOS MISMOS Y LOS LÍMITES QUE HACEN A UN RESIDUO
PELIGROSO POR SU TOXICIDAD AL AMBIENTE. ​El anexo 2 de dicha norma coloca a los residuos de
procesos de producción de biológicos dentro del giro número 15.3. Así mismo, se declara que un residuo
con características biológico infecciosas se considera peligroso cuando contiene microorganismos o virus
con capacidad de infección, o cuando el residuo contiene toxinas producidas por microorganismos que
causen efectos nocivos a los seres vivos.

NOM-002-SCFI-1993, PRODUCTOS PREENVASADOS-CONTENIDO NETO TOLERANCIAS Y

MÉTODOS DE VERIFICACIÓN. ​En esta norma se establece el rango de tolerancia de volumen de
producto que puede contener el envase, así como los métodos de verificación de contenido y el tamaño
de muestra de acuerdo al tamaño de lote.
4.1.2 Normas Internacionales.
La ​Environmental Protection Agency (EPA) ​emite una serie de guías, políticas y
regulaciones que deben cumplirse para poder registrar un producto como pesticida
antimicrobiano. Tomando como referencia las partes 40 CFR 156 y 40 CFR 152, dentro de los
puntos importantes se tienen:
● Requerimientos para registrar un producto como pesticida y obligaciones generales del
registrante.
● Información necesaria para el registro: características químicas, modo de acción del
producto, determinación de riesgo en humanos y animales doméstico y estudios de
exposición.
● Etiquetado, existe un documento guía sobre las características de etiqueta.
● Formas de registro.

Los establecimientos cárnicos y avícolas deben operar en un establecimiento sanitario según lo

regulado por el Departamento de Agricultura y Alimentos de los Estados Unidos y el Servicio de
Seguridad e Inspección de alimentos.

La FSIS (Food Safety and Inspection Service) ​emitió una regla final sobre requisitos de
saneamiento para establecimientos oficiales de carnes y aves, donde se muestra el análisis de
riesgos y puntos críticos de control (HACCP).En lo que respecta a productos de limpieza, la
normativa expone que todos los limpiadores y desinfectantes utilizados por las instalaciones de
carne / aves deben ser seguros y efectivos bajo las condiciones de uso. Además las superficies
en contacto con alimentos deben limpiarse y desinfectarse tan frecuente como sea necesario
para prevenir condiciones insalubres y la adulteración del producto

La ​Ley de Protección de la Calidad de los Alimentos ​establece que las regulaciones de la

EPA​​ deben regir los desinfectantes utilizados en las superficies en contacto con alimentos.
Por lo que esta norma internacional ​consiste en que todos los desinfectantes de superficies de
alimentos deben estar registrados con la EPA y deben formularse de acuerdo con las normas
de la FDA, codificadas en el código de regulaciones Federales( CFR por sus siglas en Inglés) y
que se incluyen en el título número 21, que es el que trata sobre alimentos y bebidas, en la
parte 178 y sección 10

21 CFR 178.1010. ​ (42 FR 14609, Mar. 16, 1977)

Se enfoca en la combinación de procesos para tratar las superficies en contacto con alimentos
con el fin de lograr una esterilidad comercial al menos equivalente.a lo que se puede lograr por
medio de tratamientos térmicos. Se incluyen explícitamente las soluciones con los distintos
ingredientes que una solución sanitizante puede tener.
Programa Environment, Health and Safety de OECD
La Organización para la Cooperación Económica y el Desarrollo (OECD) ha trabajado para
consolidar y establecer guías y regulaciones relacionadas con la seguridad química y biológica
entre los países miembros, a través del programa ​Environment, Health and Safety (EHS). Este
programa es supervisado por el Comité de Política Ambiental (EPOC), dividido en Químicos,
Pesticidas y Biotecnología. El objetivo del departamento de Pesticidas es armonizar
estimaciones de contaminación por su uso, métodos de evaluación y requerimientos para el
registro de productos que puedan considerarse pesticidas, tomando en cuenta que la definición
según la OECD para pesticida es: productos como desinfectantes, conservantes de madera,
rodenticidas, agentes antiincrustantes y conservadores, utilizados en hogares o lugares
públicos como hospitales e industrias, para destruir y controlar virus, bacterias, algas, hongos,
insectos, ratones o ratas (OECD).
El documento ​OECD Guidance for Country Data Review Reports on Microbial Pest Control
Products and their Microbial Pest Control Agents (Monograph Guidance for Microbials)
publicado en febrero del 2004 es el punto de partida para sacar al mercado un producto
pesticida​.

4.2 Puntos Críticos de Control

4.2.1 Análisis de Modo y Efecto potencial de Falla

A continuación se presenta el análisis de cada paso crítico en nuestro proceso y sus
potenciales modos de falla. Cada uno de ellos está ponderado de acuerdo a su Severidad,
Ocurrencia y facilidad de Detección. Aquellos que tengan un mayor valor en “Número prioritario
de Riesgo” (NPR) serán en los que nos enfocaremos para hacer nuestro diseño de estrategias
posterior.
4.2.1. Estrategias de control
● Medio de cultivo. En literatura se ha reportado que el rendimiento de fagos depende
poco del tipo de medio de cultivo utilizado (Bourdin, 2014). Sin embargo, tener un medio
de cultivo bien caracterizado incrementa la seguridad y reproducibilidad de nuestro
proceso. Para garantizar esto adquiriremos medios prefabricados, en los que se
garantiza un contenido constante de cada uno de los componentes.
● Inoculación de los biorreactores con la cepa de trabajo. ​Al momento de controlar una
inoculación de tanque a partir de un cultivo semilla es altamente recomendado evitar, en
medida de lo posible la manipulación excesiva del inóculo (Pirnay, 2017). Sin embargo la
automatización de nuestro proceso con un biorreactor semilla resulta incosteable,
conforme a nuestras metas de corto plazo. Por esto la replicación de la cepa se va a
hacer en matraces. Nuestro laboratorio cuenta con las características necesarias para el
manejo y sostenimiento de cepas sin riesgo biológico, de acuerdo a las
recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS, 2005). Será necesario
elaborar manuales detallados y capacitar al personal para reducir al máximo riesgos de
contaminación del cultivo.
● Manejo de membranas de filtración. ​El equipo de filtrado que se adquirirá de Sartorius
“SartoFlow Study” tiene cassettes de filtrado removibles. Esto nos permite, mediante un
protocolo de menos de 10 minutos, utilizar el mismo equipo para la ultrafiltración y la
microfiltración. Sin embargo, esto también se convierte en un proceso que arriesga
nuestro producto por ser fuente de contaminación. Para evitar esto se hará un lavado
con buffer durante 10 minutos, dando un volumen total de lavado de 7.8 L
● Mantenimiento de equipos y material de trabajo. ​Todos los equipos y materiales
deben de ser utilizados únicamente para el fin con el que fueron fabricados. Todos los
equipos e instrumental técnico deben ser correctamente identificados y validados, dando
mantenimiento continuo de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Si algún
parámetro crítico del proceso (pH, temperatura, contaminación) depende de algún
equipo en particular este deberá ser sujeto a monitoreo, sistema de alarma y acciones
correctivas que garanticen que estos parámetros se mantendrán dentro de un rango
aceptable en todo momento del proceso. Todo equipo o instrumento utilizado para
mediciones deberá ser calibrado contra un estándar conocido, de estar disponible. El
mantenimiento, limpieza, servicio, desinfección y sanitización de los equipos deberá ser
realizado constantemente y registrado adecuadamente.
● Procedimiento de Operación Estándar (SOP). ​Una vez que se hayan identificado las
especificaciones críticas para el proceso se debe llevar a cabo una la elaboración de un
SOP. En él se debe indicar a detalle todas las características de materiales y reactivos
utilizados. En particular cuando se refiere a medio de cultivo, conservación y embalaje.
Existen varios manuales para la elaboración de estos documentos se utilizarán las
recomendaciones publicadas por la EPA (EPA, 2007)

El proceso de producción de Bactroy se basa en procedimientos que han sido puestos a prueba con
anterioridad en productos de Phagelux e Intralytix, para la purificación y concentración de bacteriófagos.
De acuerdo con Phagelux (2015), los puntos críticos de control deben estar enfocados en evaluar
individualmente cada uno de los cuatro bacteriófagos incluidos en el producto. Con este fin, se incluyen
dentro del flujo de producción de Bactroy dos puntos de control para el aseguramiento integral de la
calidad del producto final. El primer punto de control de calidad se encuentra justo antes del proceso de
mezclado de bacteriófagos y los ensayos se realizan a cada solución individual. El segundo punto de
control consiste en los mismos ensayos, realizados al producto finalizado. Las pruebas realizadas son las
siguientes:

e) De potencia
La potencia del producto se refiere a la capacidad de infección y lisado por parte del
bacteriófago. La forma de cuantificar la actividad lítica del producto es mediante protocolos
estandarizados de titulación de bacteriófagos. El método a emplear por MEPS Solutions es el
conteo de unidades formadoras de placa en agar en suspensión y se basa en la infección de
cuatro cultivos saturados, uno por cada cepa hospedera, con diluciones seriadas de la solución
fágica. Cada cultivo infectado es combinado con agar (para alcanzar una concentración final de
2%), y después es vertido sobre cajas Petri que contienen una capa gelificada de agar LB. Una
vez sólido, el cultivo es incubado a 37°C durante una noche (​Baer y Kehn-Hall, 2014)​. Gracias a
esta técnica de cultivo en suspensión es posible observar la formación de placas a causa de la
lisis bacteriana, así como determinar la eficiencia de la infección. Los parámetros de calidad
durante esta fase se basan en la concentración final esperada del producto, y por lo tanto se
espera obtener un título > 1×10​9​ PFU/mL.

f) Identidad
Esta prueba se divide a su vez en dos ensayos diferentes: ​especificidad de infección y Reacción
en Cadena de la Polimerasa (PCR). implica el uso de tres cepas diferentes del microorganismo
que se quiere combatir (por cada uno de los 4 bacteriófagos utilizados), y enseguida se realiza
una PCR específica que tenga perfiles de referencia predeterminados con los que se pueda
identificar correctamente el bacteriófago de interés. El límite crítico no tiene una notación
numérica, sin embargo,en este punto de control lo que se busca es que en la PCR haya
concordancia con las bandas de los perfiles de referencia.

g) Contenido de endotoxinas
Las cepas productoras gram negativa, producen endotoxinas y Lipopolisacáridos (LPS). Estos
pueden generar reacciones adversas si las concentraciones son elevadas en el producto de
consumo final. Se realizará un análisis de las concentraciones de endotoxinas encontradas en el
producto final diluido.
Esto se realiza mediante ensayos de LAL (Lisado de amebocitos de limulus), que consisten en
usar amebocitos provenientes del cangrejo Herradura; el lisado de amebocitos reacciona con
algunos β-glucanos además de reaccionar con las endotoxinas
Los microorganismos a los que se enfoca Bactroy son: ​Listeria monocytogenes, Bacillus cereus,
Staphylococcus y Pseudomonas fluorescens; ​de los cuales la única bacteria gram negativa es P.
fluorescens, y​ es no patogénica.
Tomando en cuenta las concentraciones de endotoxinas en saliva humana como 1mg/mL
(Leenstra, 1996), podemos hacer un análisis del consumo máximo de endotoxinas que podría
llegar al consumidor si las limpiezas posteriores no se llevarán a cabo correctamente. El límite
crítico para esta fase es de < 25,000 EU/mL.

h) Esterilidad
 La presencia de microorganismos, patógenos o no patógenos, en las soluciones fágicas podría
afectar severamente el rendimiento del producto final. Por este motivo, es necesario corroborar
su ausencia mediante el enriquecimiento de una muestra de solución fágica con caldo nutritivo.
Tras 24 horas de incubación a 37°C, un hisopo es usado para esparcir una muestra de la mezcla
en cajas Petri que contienen agar nutritivo. Para acreditar esta prueba, es necesario que no haya
crecimiento de ningún microorganismo en durante 14 días.
Uno de los principales requisitos es la garantía de condiciones asépticas. La implementación de
sistemas cerrados de cultivo (automatizados) ha sido sugerida como una estrategia para apegar
el proceso a BPM (Sensebé, 2013). Adicionalmente este tipo de producción previene la
diseminación de bacterias y bacteriófagos (patógenos) dentro de las instalaciones, evitando
contaminación en pasos posteriores.

4.3 Puntos Críticos de Seguridad

4.3.1 Manejo de Riesgo biológico

A pesar de que se ha demostrado que los bacteriófagos son inocuos para el ser humano, incluso
cuando se administran vía oral (Bruttin, 2005) es importante recalcar que son organismos altamente
dinámicos que interactúan con el ambiente y su hospedero bacteriano. La clasificación de agentes
biológicos-infecciosos en México se encuentra regulada por la Norma NOM-087-ECOL-SSA1-2002, sin
embargo únicamente considera los elementos patogénicos de origen humano. Para establecer las
condiciones de nuestros trabajadores haremos referencia a la Directiva Europea 2000/54/EC (Agencia
Europea para la Seguridad y la Salud en el Trabajo, 2000) relacionada a la exposición de trabajadores y
a “Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories” publicada por el Centro de Control de
Enfermedades en Estados Unidos (CDC, 200). De acuerdo a estos parámetros una cepa de fago bien
caracterizado y un organismo de producción no patógeno para un individuo inmunocompetente requiere
un Nivel de Biocontención de 1 (BL-1).
MEPS Solutions contempla dentro de sus operaciones cumplir con las recomendaciones hechas
por la Organización Mundial de la Salud en “Manual de Bioseguridad en el laboratorio” (OMS, 2005) para
BL-1. A continuación se presentan algunos puntos críticos a seguir en esta reglamentación:

Protección personal ● Se usarán en todo momento uniformes especiales para el trabajo

(Planeado en conjunto
con la
NOM-017-STPS-2008)
en el laboratorio
● Se usarán guantes protectores apropiados cuando se entre en
contacto con materiales potencialmente infecciosos. Una vez
utilizados se retirarán de forma aséptica y a continuación se
lavarán las manos.
● Cuando sea necesario proteger los ojos se utilizarán gafas de
seguridad, especialmente durante el proceso de manejo de buffer
TMN

Procedimientos ● Los procedimientos y protocolos realizados quedarán asentados en

un manual al alcance de todos los involucrados durante el proceso.
● Los derrames accidentales de sustancias químicas serán
 reportadas al supervisor del laboratorio y debidamente
documentadas
● Los documentos escritos que habrán de salir del laboratorio se
protegerán de contaminación mientras se encuentren en este.
● Se establecerán documentos escritos en los que se detallen
metodologías de limpieza tanto de espacios de trabajo como de
equipos.

Gestión de la ● Habrá un programa de control de plagas en el espacio de

bioseguridad laboratorio.
● El supervisor del laboratorio deberá asegurarse de que todo el
personal haya leído y comprendido los riesgos especiales que se
pueden encontrar en la zona de trabajo.

Material de laboratorio ● Se seleccionarán para uso en el laboratorio aquellos materiales

que cumplan con un diseño que limite o evite el contacto entre el
trabajador y el material infeccioso.
● No debe presentar rebabas, bordes cortantes o partes móviles sin
proteger.
● Cuando sea posible se evitará emplear vidrio u otro material
rompible.

4.3.2. Características generales de la estructura

A nivel nacional, la NOM-001-STPS-2008 “ Edificios, locales, instalaciones y áreas en los
centros de trabajo Condiciones de seguridad.” Va a indicar a una empresa los niveles de seguridad
requeridos para proteger la integridad física y la vida de los trabajadores en edificios, locales y áreas en
los centros de trabajo. En la norma se especifican tanto las características como las evidencias que debe
presentar el patrón a la Secretaría del Trabajo y Previsión Social cuando así sea requerido para
comprobar que las condiciones de trabajo cumplen con lo predispuesto. Entre las especificaciones de
esta norma se cubren diseño de escaleras, ventilación, materiales de recubrimiento de muros y suelos,
entre otros.
Dentro de este rubro también se tienen que considerar las especificaciones para un laboratorio
de BL-1 (OMS, 2005). Se puede consultar el listado completo en el documento de referencia, pero
algunas de las más importantes son:
● La distribución del espacio debe garantizar que no haya aglomeración, en nungún
momento, de personas o material.
● Las superficies de las mesas de trabajo deberán ser impermeables y resistentes a los
tipos de sustancias utilizados normalmente en el laboratorio.
● Se preverán espacios designados para la manipulación y almacenamiento seguro de
reactivos.
● En cada sala de laboratorio debe haber, por lo menos, un lavabo con agua corriente,
instalado de preferencia cerca de la salida.
 ● Las puertas contarán con mirillas y tendrán un sistema de cierre automático, así como
resistencia contra incendios.
● Debe disponerse de un suministro de electricidad seguro y de suficiente capacidad, así
como de un sistema de iluminación de emergencia que permita salir del laboratorio en
condiciones de seguridad.

4.3.3. Prevención y reacción a incendios.

De acuerdo a las categorías marcadas en la NOM-002-STPS-2010 el principal tipo de fuego que
se puede presentar en nuestras instalaciones de trabajo es Fuego Clase C, relacionado a las
instalaciones eléctricas energizadas. Alguna de las recomendaciones de diseño de la OMS y la
NOM-001-SEDE-2012 ​“Instalaciones eléctricas (utilización)” para prevenir situaciones de riesgo son (OMS,
2005):
● Planear la distribución de los equipos para prevenir la sobrecarga de las líneas eléctricas.
● Mal mantenimiento de instalaciones eléctricas, como cables mal aislados o aislante deteriorado.
● Cables eléctricos demasiado largos.
● Evitar dejar conectado equipo de laboratorio sin necesidad.
● Es indispensable que todas las instalaciones y equipos eléctricos sean inspeccionados y
probados con regularidad, incluyendo tomas de tierra.
● Se debe disponer de interruptores de circuito e interruptores por fallo de la toma de tierra. Los
interruptores de circuito protegerán a los cables de sobrecarga eléctrica, por tanto de incendios.
● Todos los equipos eléctricos debe tener tomas de tierra, preferiblemente mediante enchufes de
tres espigas.

La NOM-154-SCFI-2005, “Equipos contra incendio-extintores servicios de mantenimiento y

recarga” indica las categorías de extintores que se pueden emplear en una planta. Al haber identificado
que nuestra principal fuente de incendio proviene de instalaciones eléctricas se ha optado por tener
extintores de Categoría 2 “Recipiente del extintor presurizado permanentemente, conteniendo como
agente extinguidor polvo químico seco, agentes limpios, químico húmedo”.

4.3.4. Otras normas relevantes

Adicionales a los puntos descritos ampliamente en las secciones pasadas MEPS Solutions se
apegará a lo estipulado en las siguientes normas y documentos:

Norma Objetivo

NOM-026-STPS-2008​​. Colores y señales de Establecer los requerimientos en cuanto a los colores y

seguridad e higiene, e identificación de señales de seguridad e higiene y la identificación de
riesgos por fluidos conducidos en tuberías. riesgos por fluidos conducidos en tuberías.

NOM-029-STPS-2005​​, Mantenimiento de las Establecer las condiciones de seguridad para la

instalaciones eléctricas en los centros de
trabajo - Condiciones de seguridad.
realización de actividades de mantenimiento de las
instalaciones eléctricas en los centros de trabajo, a fin
de evitar accidentes al personal responsable de
llevarlas a cabo y a personas ajenas a dichas
actividades que pudieran estar expuestas.

NOM-003-SEGOB-2002​​, Señales y avisos Implementación de señales y avisos sobre protección

para protección civil - Colores, formas y
símbolos a utilizar
civil, que permitan a la población identificar y advertir
áreas o condiciones que representen riesgo para su
salud e integridad física, así como ubicar equipos para
la respuesta a emergencias, e instalaciones o servicios
de atención a la población en caso de desastre

NOM-154-SCFI-2005,​​ Equipos contra Establece los requerimientos y procedimientos con que

incendio - Extintores - Servicio de
mantenimiento y recarga.
se debe cumplir en el servicio de mantenimiento y
recarga de extintores portátiles y móviles sobre ruedas
sin locomoción propia, a fin de garantizar su correcto
funcionamiento durante el combate de fuegos
incipientes de acuerdo a su diseño.

4.4 Certificaciones y distintivos

Rubro Certificado Beneficios

CALIDAD ISO 9001-2015 Esta certifica que la empresa tiene un sistema de gestión
de la calidad con lo que de manera continua se verifica
que todos los procesos se lleven a cabo de manera
adecuada en todas las fases de la cadena y que así el
producto resulte óptimo para las necesidades de los
clientes

Buenas Otorgada por la Entidad Mexicana de Acreditación,

Prácticas de proporcionan pautas recomendadas para la gestión de
Laboratorio estos ensayos y representan un sistema de calidad
relacionado con los procesos organizativos y las
condiciones bajo las cuales los ensayos son planificados,
realizados, controlados, registrados, archivados e
informados, para garantizar la calidad y validez de los
datos obtenido​s.

AMBIENTAL ISO 14001-2015 Apoya la aplicación de un plan de manejo ambiental en

 cualquier organización del sector público o privado.
Proporciona un ahorro de costos mediante la reducción de
residuos, evita el pago de penalizaciones legales.

LABORAL OHSAS 18001 Pudiendo ser adquirido por un acreditador gubernamental

o privado va a demostrar que la organización tiene un
sistema estandarizado para asegurar la seguridad
ocupacional de sus empleados.

ISO 45001 Elaborado con base en la OHSAS 18001, varios

estándares nacionales y en colaboración con cerca de 70
expertos de 70 países diferentes. La ISO 45001 adopta el
desarrollo de estrategias basadas en identificación de
riesgos que aseguren la seguridad de empleados
reduciendo incidentes, costo de primas de aseguradoras y
mejorar la reputación de la empresa. Se trata de una
ampliación de la OHSAS 18001

IDENTIDAD “Hecho en Certificación otorgada por el Instituto Mexicano de

DE MARCA México” Normalización y Certificación, A.C. Permite dar una
identidad a la marca, promoviendo su consumo a nivel
nacional. Crea un distintivo para que los productos
mejoren su acceso a mercados internacionales

Sello Orgánico SAGARPA proporciona un listado de entidades

SAGARPA certificadoras aprobadas para emitir el sello orgánico. Si
México bien se basa en requisitos para agricultura, hay
antecedentes donde productos fágicos han obtenido la
certificación en otros países.

MÓDULO 5: Análisis Financiero

Indicadores financieros del proyecto

 Indicador Valor

TIR 2.85 %

TREMA 3

VPN $14,014,539.36

ROI 1.2%

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