Transferencia de DNA ocurrida durante el contacto celular del

factor sexual F mediante conjugación bacteriana

Bacteria donante que contienen JCFL39, un mutante del gen traD sensible a la temperatura del factor sexual F, fueron
utilizados en una temperatura no permisiva para acumular pares de acoplamiento estables con las células receptoras. En
esta etapa en la conjugación, el pili extracelular F fue quitado por el tratamiento con 0.01% Dodecil sulfato de sodio.
Entonces al cambiar la temperatura permisiva para JCFL39, la transferencia del plásmido F fue observada. Los pares de
acoplamiento que fueron acumulados con JCFL39 en la temperatura no permisiva fue observada fácilmente por
microscopia electrónica en contacto de pared a pared con las bacterias receptoras. Estos resultados demuestran que el
producto del gen traD, es requerido para la transferencia del DNA a una bacteria receptora, actúa después de la etapa en la
que se requiere el pili extracelular F. Además, concluimos que ocurre la transferencia de DNA mientras que las células
donantes y receptoras están en contacto y no necesariamente se necesita el canal extendido del pilus F según lo previsto en
algunos modelos de la conjugación bacteriana.

La conjugación es el proceso por el cual el DNA se
transfiere de un donante a una bacteria receptora por un
mecanismo que implique el contacto entre las células. La
mayoría de los estudios sobre la conjugación se han
realizado con bacterias Gram (-) y particularmente se han
centrado en Escherichia coli y el factor sexual F. Una
característica central de F medida en la conjugación es la
función del pili F, un filamento extracelular largo y
delgado que es producida una o muchas copias por el
plásmido F que contiene la bacteria donante (9). Aunque
haya prueba evidente de que el pilus F es esencial para la
formación del contacto inicial entre la bacteria receptora y
la donante (4, 7), sigue existiendo un grado de
incertidumbre en cuanto al papel que este organelo
desempeña en la transferencia conjugativa del DNA. Las
Observaciones más tempranas (5, 16) indicaron la
posibilidad del contacto directo de la superficie celular de
las bacterias en conjugación, pero puesto que estos estudios
precedieron el estudio del pili F, ningún experimento
crítico fue realizado en aquel momento para distinguir los
papeles posibles del pilus sexual. Los estudios de Brinton
en el pili F lo llevo a proponer una clase de modelos en los
cuales el pilus F está implicado directamente en la
transferencia conjugativa del DNA (6). Sin embargo, no se
ha vislumbrado ninguna evidencia directa que muestre una
asociación entre el pili F y el DNA que se está
transfiriendo conjugativamente en la literatura. Como
alternativa, Curtiss (10), Marvin y Hohn (18) han sugerido
que el pili F puede funcionar contrayendo y de tal modo
dibujando las superficies de las células donante y receptora
juntas, en las cuales puede ocurrir el punto de transferencia
del DNA. Esta idea es central al modelo actualmente
favorecido para la transferencia conjugativa por F como
plásmidos. Las características centrales de este modelo han
sido repasadas recientemente por Willets y Skurray (26) y
se presentan en la FIG. 1.
El modelo prevé la conjugación procediendo como
una serie de etapas ordenadas de los acontecimientos de la
superficie celular y del metabolismo del DNA. Mucha de la
evidencia de este modelo se basa en los fenotipos de los
mutantes del plásmido F que son deficientes en la
transferencia (tra) (26). Los mutantes en los genes traA, L,
E, K, B, V, C, U, F, G, o la primera parte del gen traG no
sintetizan pili F y son defectuosos en todas las etapas de la
conjugación. Los mutantes en el gen traN y la segunda
parte del gen traG sintetizan pili F y lo hacen inestable,
pero no estable (resistente a ser cortado), contacto en la
superficie celular (17).
Las bacterias receptoras que carecen de la proteína
membranal externa ompA también no pueden formar pares
de acoplamiento estables (21). Los mutantes en los genes
traM, D, I, Z, (y probablemente traY) están cubiertas por
pilis y pueden formar los pares de acoplamiento estables
(26); los productos del gene se han implicado en la síntesis
y transferencia conjugativa del DNA en la célula donante
(15).
Un defecto de estos estudios es que no permiten
ordenar definitivamente las etapas deducidas de la
conjugación. Según lo descrito anteriormente, un área de
preocupación especial es la colocación del paso de la
transferencia del DNA en un momento en el que las células
donante y receptora están en contacto, y en que amplio
punto el pili F probablemente no se requiere más. Quizás la
mejor tentativa de demostrar este punto implico el tratar
mezclas de acoplamiento con concentraciones bajas de
detergente Dodecil sulfato de sodio (SDS), que des
polimeriza filamentos del pilus F (24) Achtman y otros (3)
encontraron que el tratamiento con SDS no causo la
desagregación de los pares de acoplamiento realizados
incluyendo al donante Hfr, y que el numero de
recombinantes continuo aumentando durante la incubación
adicional en presencia de SDS. Este resultado es
claramente constante con la noción de que el pili F no es
esencial para la transferencia del DNA, una vez que se
establece el contacto de la superficie celular. Sin embargo,
los pares de acoplamiento estables no fueron aislados como
intermedio, ni era demostrada la transferencia subsecuente
de DNA. El uso de la formación recombinante como el
análisis para la transferencia del DNA mas futura introdujo
una complicación no presente en un acoplamiento del
plásmido F.
 Desde un punto de vista genético, el método de
mayor alcance para analizar el orden de acontecimientos en
la vía biológica es el ideado por Jarvik y Botstein (13). Su
prueba emplea un par de mutantes condicionales, uno
sensible a altas temperaturas y otro sensible al frio; con
cambio en la temperatura apropiada es posible que se
experimente un cambio para determinar inequívocamente
los tiempos relativos en los cuales se requieren las
funciones correspondientes del gene. Para aplicar esta
teoría en la conjugación bacteriana de F, se ah empleado
SDS y el mutante lac traD (Ts) de F como los pares
indispensables de bloques condicionales. Como en los
experimentos de Achtman y otros (3), el SDS fue empleado
para eliminar los filamentos extendidos del pili F. El
análisis de los fenotipos de varios mutantes del gene tra
que afectan el metabolismo conjugativo del DNA sugiere
que el producto de traD desempeña un papel directo en la
transferencia del DNA (15). Hemos utilizado SDS y el
mutante traD (Ts) para demostrar que el producto del gene
traD puede actuar en la conjugación en una etapa después
de que se requiera la función del pili extendido F. Los
resultados futuros consolidan la sugerencia (3, 26) de que
la transferencia de DNA ocurre normalmente durante una
etapa de la conjugación en la cual las superficies de las
células donante y receptora están en contacto real.
FIG. 1. Modelo para la transferencia conjugativa de
plásmidos como el F. La figura se modifica de Willets y
Skurray (26) y los puntos culminantes son el contacto del
pili F en la superficie de la célula del ciclo de acoplamiento
y el requisito de la función del gen traD para la
transferencia del DNA. El pili F es extremadamente
sensible a bajas concentraciones de SDS (24), y el
filamento extendido del pili F desaparece rápidamente de la
superficie de la célula bacteriana tratada con detergente,
destruyendo de tal manera la eficacia de la actividad de la
célula donante (3). Los detalles del metabolismo
conjugativo del DNA se han simplificado
considerablemente en la figura, y los lectores interesados
deben consultar la revisión de Willets y Wilkins (27). Para
simplificarlo, se indica la bacteria donante como una barra
mientras que la receptora es esférica. El factor sexual F se
indica como un círculo en la bacteria donante y el DNA
cromosómico no se muestra para ninguna bacteria.
MATERIALES Y METODOS
Plásmidos y cepas. Los plásmidos usados serán JCFLO (F
lac tra+) JCFL8 [F lac traD8 (Am)], y JCFL39 [F lac
traD39 (Ts)] de la colección de Achtman y otros (4). Estos
fueron usados en un fondo de JC3272 (F- lactosa galactosa
histidina triptófano lisina λr dtr) para dar al donante cepas
JC3273, JC6129 y JC6140 respectivamente (4). La cepa
receptora usada es XK1502 (F- ∆lacU169 nalA) (19).
Determinación de la eficacia del acoplamiento a
32 y 42 °C. JC6140, JC3273, y XK1502 fueron crecidos
por duplicado en 32 y 42°C colocándose durante toda la
noche en cultivo de 10 mL de caldo LB en matraces
Erlenmeyer de 125 mL. Las muestras (0.1 mL) del cultivo
del donante (JC6140 o JC3273) fueron subcultivadas en
2.4 mL de caldo LB y se le permitió acoplarse por 2 hrs. a
cualquier temperatura. Luego 0.4 mL de las muestras de
cultivo de células donantes fueron mezcladas suavemente
con 0.4 mL de los cultivos que estuvieron incubándose
durante toda la noche de XK1502 (creciendo en 32 o 42
°C), y la mezcla de acoplamiento se le permitió acoplarse
por 2 hrs. a 32 o 42°C. Al principio del acoplamiento, las
muestras fueron diluidas y sembradas sobre placas de agra
MacConkey lactosa que contenían 100 µg/mL de
estreptomicina sulfato para las cuentas de células donantes.
En el final del acoplamiento, las muestras de la mezcla de
acoplamiento fueron diluidas y sembradas sobre placas de
agar lactosa mínimo que contenían 20 µg/mL de acido
naldixico para determinar el número de transconjugantes.
Cinética de la inactivación y reactivación del
gene traD39. Para seguir el curso del tiempo de
inactivación del producto del gen traD39 en términos de
capacidad para transferir, un cultivo de los que se dejaron
toda la noche de las bacterias donantes JC6140 fue crecido
a 32°C, diluido 25 veces en 10 mL de caldo LB en un
matraz Erlenmeyer de 125 mL, y sacudido suavemente en
un baño de agua a 32°C. Cuando la densidad óptica a 550
nm (OD550) del cultivo alcanzo 0.4, una muestra de 0.4 mL
fue mezclada con 0.4 mL de un cultivo de toda la noche de
receptoras XK1502 que habían sido crecidos a 32°C, y a
las bacterias se les permitió acoplarse por 30 min a 32°C
con agitación suave. Mientras tanto, el resto del cultivo de
donantes fue cambiado y puesto a 42°C, y una segunda
muestra de 0.4 mL fue agregada inmediatamente a 0.4 mL
de un cultivo de XK1502 que había sido crecido a 42°C
durante toda la noche; a estos se les permitió acoplarse
durante 30 min a 42 °C. En varios de los intervalos después
del cambio de la temperatura, muestras de JC6140 fueron
tomadas y el procedimiento de acoplamiento fue repetido.
Siempre que el OD550 del cultivo de donantes alcanzara
0.8, se diluía dos veces en caldo LB precalentado para
mantener el crecimiento exponencial. Los acoplamientos
fueron detenidos después del minuto 30 de flujo turbulento
y enfriados en hielo. Las mezclas fueron diluidas y
sembradas en placas de agar lactosa minimo que contenían
acido naldixico para probar los transconjugantes y sobre
placas de agar MacConkey lactosa que contenían
estreptomicina sulfato para las cuentas de donantes.
La reactivación de traD39 fue seguida de una
manera similar, usando un cultivo de JC6140 crecida
durante la noche a 42°C y después cambiada de puesto a
32°C.
Experimentos de cambio de temperatura. Las
bacterias JC6140 (donante) y XK1502 (receptora) fueron
crecidas en 2.5 mL de cultivos que se colocaron toda la
noche a 42°C en 18 tubos de cultivo de 150 mm. Una
muestra de 0.1 mL del cultivo de JC6140 fue subcultivada
en 2.5 mL de caldo LB en un tubo similar al del cultivo e
incubada a 42°C por 1 hr. Una muestra de 0.25 mL de este
cultivo de donantes fue agregada a 0.25 mL del cultivo de
XK1502 de toda la noche, mezclada suavemente, e
incubada a 42°C por 30 min sin agitación. En este tiempo,
los cultivos fueron diluidos diez veces en caldo LB que
contenía SDS 0.01% y 20 µg/mL de acido naldixico fue
agregado a algunas de las mezclas de acoplamiento. Los
cultivos eran incubados a 32 o 42°C durante 2 hrs. Los
números de transconjugantes fueron obtenidos sembrando
varias diluciones sobre las placas de agar lactosa mínimo
que contenían 20 µg/mL de acido naldixico.
Microscopia Electrónica. Las cepas de JC6140 y
XK1502 fueron crecidas en 2.5 mL de caldo LB que se
colocaba en 18 tubos de 150 mm a 42°C durante toda la
noche. Cada uno de estos era diluido 25 veces en caldo LB
y crecido a 42°C durante 1 hr. Muestras del donante,
receptora o una mezcla igual de donante y recipiente fue
incubada a 42°C durante 20 min, después del cual 9
volúmenes de caldo LB que contenían SDS 0.01% y 1% de
glutaraldehido (recién preparado) fueron agregados a cada
tubo con agitación suave. Los cultivos fueron incubados a
42°C por 20 min adicionales y centrifugados a 5100 x g
por 10 min, y las pastillas celulares fueron suspendidas en
0.5 mL de solución salina. Las células eran preparadas para
microscopia electrónica manchando una muestra sobre los
300 acoplamientos, 0.2% de rejilla de carbón revestida de
Formvar. Las rejillas fueron manchadas con el acetato
acuoso de uranilo al 1% y examinadas en un microscopio
electrónico de Philips 300 a 60 kV. Se utilizaron dos
rejillas por muestra, y más de 200 células fueron
examinadas para determinar el grado de agregación.
Análisis Immunoblot. Anti proteína traD (traDp)
el suero inmune fue criado en conejos blancos femeninos
de Nueva Zelanda usando traDp purificado (descrito en la
preparación): las cepa individuales para el immunoblot
fueron crecidas colocando los cultivos en caldo LB y
después diluidas 50 veces en caldo LB para obtener las
células en crecimiento exponencial. Se recogieron muestras
de 3 mL cuando la OD550 alcanzo 0.6 a 0.8. Las células
eran recogidas por centrifugación y suspendidas en gel
SDS amortiguador e incubados en agua hirviendo por 3
minutos. Cantidades equivalentes de material fueron
cargadas sobre 11 a 14 cm de SDS poliacrilamida al 9.5%
y se realizo electroforesis según lo descrito anteriormente
(19). El immunoblot fue realizado por una modificación
del procedimiento de Burnette (8). Las proteínas fueron
transferidas electroforéticamente a 11.5 por 14.5 cm en
hoja de nitrocelulosa a 50mA durante toda la noche en un
aparato Hoeffer Transphor con un amortiguador de la
transferencia de 25 mM de clorhidrato de Tris (pH 8.4) 192
mM metanol glicina 20%. La hoja de nitrocelulosa fue
lavada con agua destilada e incubada por 1 hr con 50 mL
de albumina de suero vacuno con 3% de PBSa (10 g de
NaCl, 0.25g de KCl, 2.71g de Na2HPO4 por litro de agua
destilada con un pH final de 7.6), seguido de otra
incubación de 1 hr con suero normal vacuno y 1% de
albumina normal de cabra en PBSa. Inmunoglobulina G
(IgG) enriquecida con el suero anti traDp fue utilizada en
una dilución 1:50 para eliminar el amortiguador (véase
abajo) y 2 mL de suero por cada cm de anchura del carril
en el gel, se les permitió incubarse durante 2 hrs. Esto fue
seguido por 4 lavados en el minuto 15 cada uno para
eliminar el amortiguador. El anticuerpo del conejo Fc el de
la cabra conjugado con la peroxidasa de rábano picante fue
diluido 1:200 para eliminar el amortiguador y 2 mL por
carril en el gel fueron incubados en el papel por 2 hrs. La
hoja de nitrocelulosa entonces fue lavada 3 veces para
borrar el amortiguador a los 15 min cada uno seguido con 5
lavadas mínimo con PBSa. El amortiguador de la
peroxidasa contenía el sustrato cromogenico 4-cloro-
1naphtol (véase abajo) entonces fue agregado sobre la
nitrocelulosa. Después de que las bandas corrieran el papel
fue aclarado en agua destilada permitiéndole secarse a
temperatura ambiente.
RESULTADOS
Futura caracterización de JCFL39. El plásmido JCFL39
fue aislado por Achtman y otros (4) es un derivado no
suprimible que transfiere el derivado de un tipo de F lac
(JCFL0) silvestre, y el defecto de la mutación fue trazado
en el gene traD (traD39) de F. En su acoplamiento mínimo
de los 40 min estándar, JCFL39 tenía una eficacia de
transferencia de 10 a 2 a 42°C y de 100 a 32°C,
concerniente a JCFL0 como 100 (4). En primer lugar al
usar su mutante, determinamos la eficacia de la
transferencia de JCFL39 bajo condiciones que serian
utilizadas en los experimentos del cambio de temperatura.
Los datos demostraron que en la transferencia de un
JC3272 anfitrión a una receptora de XK1502, JCFL39 era
6 veces menos eficiente que JCFL0 a 32°C y 7.8 x 104
veces menos eficiente que JCFL0 a 42°C. Así existe una
diferencia de 3.2 x 104 veces en la capacidad de
transferencia de JCFL39 a 32 y 42°C.
Para realizar los experimentos de cambio de
temperatura, era también necesario determinar el tiempo en
el cual un JCFL39 donante contenía actividad cuando es
cambiado de lugar de 42°C a 32°C. Para aumentar la
sensibilidad de este experimento cinético, un tiempo de
acoplamiento de 30 min fue utilizado. La eficiencia de
acoplamiento de JCFL39 aumento exponencialmente sobre
el desplazamiento a la temperatura permisiva, levantándose
aproximadamente 100 veces en 4 hrs. (FIG. 2A). En este
punto todavía no había alcanzado el valor para las células
crecidas continuamente a 32°C. El índice de aumento
inicial correspondió a doblar cada53 minutos, comparado
con el doble de tiempo de 50 a 60 minutos de crecimiento
de las células. De acuerdo con este resultado, elegimos 2
hrs. como el periodo de acoplamiento para el experimento
de cambio de temperatura descrito más abajo (y el
experimento de la tabla 1).
a
JCFL0 es F lac tra. JCFL39 es F lac traD39 (Ts).
b
El recipiente fue XK1502. anotaron a las colonias como
transconjugantes después de acoplar por 2 horas en la
temperatura indicada.
c
La Eficacia del acoplamiento fue calculada como número
de transconjugantes obtenidos por 100 donantes.
Como corolario a este experimento, determinamos
el índice de inactivación de la actividad traD39 cuando se
cambio de lugar a un donante JCFL39 de 32 a 42°C. La
cinética diferencia substancialmente de la activación (FIG.
2B). El incremento inicial de la eficacia del acoplamiento
era reproductivo y podía ser debido a la transferencia
conjugativa que es intrínsecamente más eficiente a 42°C.
Esto fue seguido por un rápido declina miento en la
actividad exponencial durante la primera hora (t1/2 del
minuto 8 al 10) y quizás una declinación más lenta después
de eso. El valor alcanzado después de 2 a 4 hrs de acuerdo
con la eficacia del acoplamiento para el donante JCFL39
crecido continuamente a 42°C. Así del 95 al 99% del
producto traD39 parece ser inactivado rápidamente como
una solo especie con el cambio de temperatura; puede ser
una fracción activa residual que se diluye hacia fuera más
lentamente.
Etapa especifica de la implicación de traD en la
conjugación bacteriana. Ahora nos encontrábamos en una
posición para preguntar si la etapa de la conjugación en la
cual la función extendida del pili F se podía separar
físicamente de la etapa en la cual ocurre la transferencia
conjugativa del DNA. Usando la adición de SDS y el alelo
termo sensible traD39 como el aire indispensable de
bloques condicionales. Para hacer esto, JCFL39 que
contenían donantes y a Lac-, receptora resistente al acido
naldixico, ambos crecidos continuamente a 42°C, eran

FIG. 2. (A) Cinética de la reactivación de la actividad traD39 (Ts) en un cultivo en crecimiento exponencial de JC6140
que se cambio de 42 a 32°C.
(B) Cinética de la inactivación de la actividad traD39 (Ts) de un cultivo en crecimiento exponencial de los donantes
JC6140 cambiados de 32 a 42°C. Los cultivos fueron crecidos y los transconjugantes fueron probados según lo descrito en
el texto. El cuadrado en el panel B es el valor obtenido por 30 minutos que se acopla entre JC6140 y XK1502 crecido
continuamente y acoplado a 32°C.
hrs estos cultivos fueron probados para transconjugantes de
mezclados e incubados a 42°C por 30 minutos. Entonces Lac+ y Nalr. El producto traD se puede reactivar y puede
fue agregado SDS 0.01% para quitar el pili extracelular F funcionar después de la adición de SDS; Los
(3) y para prevenir la formación posterior de pares de transconjugantes aumentan 100 veces en la incubación
acoplamiento estables. Una porción del cultivo fue continua en relación la temperatura permisiva con la
cambiada a 32°C y otra mantenida en 42°C. Después de 2 temperatura no permisiva (Tabla 2). En un experimento de
control, el SDS estaba presente a través del periodo inicial
de 30 min (tabla 2). Esto demostró la importancia del paso
de pre incubación y confirmo la sensibilidad al SDS de una
etapa en la conjugación en la cual el pili extracelular F
actúa en la formación de un par de acoplamiento estable. El
acido naldixico inhibe la DNA girasa (22) y se sabe parar
para la transferencia de DNA inmediatamente cuando esta
agregado a una mezcla de acoplamiento (12), pero no
afectara a la receptora que es resistente al acido naldixico.
Constante con el papel de traD en la transferencia de DNA,
cuando el acido naldixico fue agregado en el momento en
que se cambio la temperatura, no se observo un aumento en
los transconjugantes en presencia de SDS en 32 o 42°C
(Tabla 2). Esto indica que la transferencia de DNA todavía
no había ocurrido durante la pre incubación a 42°C y debe
haber ocurrido a 32°C cuando la actividad de traD fue
recuperada.
La eficacia de la transferencia de JCFL39 en este
experimento (Tabla 2) era cerca de 4. Aunque este valor no
se pueda relacionar directamente con la Tabla 1 o FIG. 2ª,
indica que un alto porcentaje de los donantes de JCFL39
tienen actividad traD potencialmente recuperada a 32°C
puede, de hecho, transferir DNA a una bacteria receptora.
Esta formación sugerida de que el acoplamiento estable se
aparea durante el periodo de pre incubación a 42°C y la
resistencia de estos pares de acoplamiento a la disociación
por el SDS (3). Puesto que con el SDS se podía esperar una
disminución en el nivel de agregación no especifica de las
células donantes y receptoras (3), decidimos mirar en el
microscopio electrónico las bacterias en acoplamiento que
fueron acumuladas por el procedimiento en la Tabla 2.
a traD8 (Am). Los resultados indicaron que los niveles de
Toda la segunda incubación se efectuó por 2 hrs.
b traDp en las células de traD y traD39 eran esencialmente
Todos los acoplamientos usados son JC6140 donantes y
XK1502 receptoras y fueron realizados según lo descrito
en el texto. El número de donantes introducidos fue 1.0 X
107 por mL.
c síntesis no termo sensible de la proteína.
El SDS fue agregada a la mezcla de acoplamiento durante
la incubación inicial.
Microscopia electrónica de pares de
acoplamiento. Las bacterias donantes JCFL39 se les
permitió formar el agregado de acoplamiento con las
bacterias receptoras en la temperatura no permisiva.
Después del minuto 30 de incubación a 42°C, el SDS y el
glutaraldehido fueron agregados, y el cultivo fue
examinado en el microscopio electrónico. Las células
tratadas de este modo eran consideradas raramente en
contacto en los cultivos individuales de donantes y
receptoras, mientras que en la población de acoplamiento
mezclada virtualmente todas las bacterias fueron
encontradas en una cierta clase de agregado con la
superficie celular en contacto (FIG. 3). En este
experimento, no era posible identificar las bacterias
donantes y receptoras en los agregados de acoplamiento,
puesto que son morfológicamente similares. Así la
correlación de células agregadas a las bacterias en
acoplamiento se basa sobre la distribución estadística
observada. Los agregados de acoplamiento observados de
este modo eran similares en aspecto a los divulgados por
Atchman y otros (3). Aunque la coloración negativa de
células enteras demostraba fácilmente la existencia de tales
pares, no podía proporcionar el detalle adicional sobre la
naturaleza exacta de la región en contacto de pared a pared.
Que el análisis requería cuidadosamente preparo esto las
secciones de pares de acoplamiento, tales como estos, para
ser visto en el microscopio electrónico. Tal análisis está en
curso a otra parte.
Análisis de los niveles de proteína traD en
donantes JCFL39. La rápida declinación en la actividad
detectada en el experimento de la FIG. 2B es constante con
la función termo sensible. Sin embargo, El coeficiente de
incremento en eficacia de acoplamiento durante la
activación de traD39 fue paralelo al crecimiento de la
célula (FIG. 2A) y sugiere que el producto funcional de
traD39 puede tener que ser sintetizado nuevamente. El
nivel de producto traD39 en células de F+ es muy bajo, y la
proteína ah sido observada previamente solamente usando
un alto número de copias del plásmido o transduciendo el
bacteriófago λ llevando el gene conjuntamente con un
protocolo de etiquetado especifico (14, 20). Puesto que
ahora tenemos disponible antisuero de conejo contra la
proteína traD purificada, podíamos determinar
directamente el nivel de traDp en el donante JCFL39 en
temperaturas permisivas y las no permisivas, usando
Immunoblot como análisis altamente sensible. Los
resultados con JCFL39 que contiene las células crecidas
exponencialmente a 32 y 42°C se demuestran en la FIG. 4,
junto con F-, F lac tra+ y las manchas de control de F lac
idénticos en ambos tipos crecidos a 42°C. Esto indica que
el defecto se asocio a los resultados del alelo traD39 de una
perdida de función en la temperatura no permisiva, y la
DISCUSION
Estos resultados proporcionan evidencia directa para
ordenar dos acontecimientos en la conjugación bacteriana
mediada por el factor sexual F. Con la adición del SDS y
un mutante de F lac traD (Ts) era posible determinar que el
paso de sensibilidad al SDS en la conjugación (La función
del pili extendido F) precede el paso en el cual la función
de traD es coincidente con la sensibilidad al acido naldixic,
proporcionar la evidencia adicional para el papel directo el texto. Por lo menos 200 células fueron examinadas para
del producto de traD en la transferencia de DNA. obtener cada histograma. Las barras verticales representan
Combinando estos resultados con la microscopia el número de células de cada tipo de agregado contra el
electrónica de acoplamiento de pares, concluimos, según lo porcentaje total de células examinadas.
también propuesto por otros que el papel del pili F en la
conjugación sea la generación de pares de acoplamiento
estables que estén en contacto mediante la superficie
celular, y que una vez que estos se forman no es necesaria
mas el filamento extendido del pilus F. La transferencia del
DNA ocurre de la bacteria donante a la bacteria receptora
mientras que las superficies de las células están en
contacto. Aunque sea obvio que el juego del pili F es el
papel esencial para establecer el primer contacto entre las
células bacterianas en acoplamiento, los acontecimientos
subsecuentes de la superficie celular de la transferencia de
DNA.
FIG. 4. Análisis Immunoblot de los niveles de proteína
traD en células con crecimiento exponencial a 32°C y
42°C. Anti traDp IgG de conejo y peroxidasa de rábano
picante conjugado esto como segundo anticuerpo fueron
utilizados para visualizar la proteína traDp entera de la
célula en un gel de losa de poliacrilamida SDS (véase el
texto). Carriles; a y b, JC3273 (F lac tra+) a 32 y 42°C,
respectivamente, c y d, JC3272 (F-) a 32 y 42°C,
respectivamente; e y f, JC6140 [F lac traD39 (Ts)] a 32 y
42°C, respectivamente; g ay h, JC6190 [F lac traD8 (Am)]
a 32 y 42°C, respectivamente. Cada carril obtuvo la
proteína en aproximadamente 3 x 108 células.

La comparación de estos resultados con los

experimentos anteriores destaca las ventajas inherentes en
el acercamiento de Jarvik y Boenstein a los
acontecimientos que ordenan la ruta biológica (13). Para
obtener un alto porcentaje de los agregados de
acoplamiento (el 70% de todas las células), Achtman y
otros (3) utilizaron un periodo de incubación de 20 minutos
antes de agregar el SDS. Sin embargo, para obtener
razonablemente niveles de la formación recombinante,
emplearon a un donante de HfrC y probados para los genes
lac que se transfirieron en el minuto 7 (23). El uso de un
último marcador habría podido proporcionar evidencia más
convincente, pero el gradiente de HfrC de la transmisión
habría reducido perceptiblemente el número de
recombinantes. Incluso entonces, la base de su experimento
es cinética, y no había así una discusión concluyente para
una etapa discreta en la conjugación donde el pili
extendido F no se requiera. Ponemos mayor confianza en el
uso del mutante de traD (Ts), donde se acumula un
intermedio que se puede aislar y caracterizar y después
demostrar para proceder a travez de las etapas subsecuentes
de la transferencia conjugativa.
La caracterización anterior de mutantes traD puso
FIG. 3. Histogramas de los estados de agregación de las
la etapa de acción de traD después de la formación de un
bacterias donantes JC6140, las bacterias receptoras
par de acoplamiento estable, sin embargo, la demostración
XK1502, o una mezcla de ambas, después de la incubación
de que un mutante traD puede formar un par de
a 42°C por 30 minutos. Las células fueron preparadas y
acoplamiento estable no elimina la posibilidad de que la
observadas al microscopio electrónico según lo descrito en
función traD requerida realmente en un primer tiempo en la
conjugación y que los pares de acoplamiento estables
observados representan realmente una etapa abortada o sin
salida en la transferencia conjugativa. De hecho, se ha
divulgado que el mutante lac F de JCFL60, que lleva una
mutación sin sentido de traD, hace 2.5 veces tanto pili F al
igual que la cepa tipo lac F (2). También, las células que
llevan un mutante lac F traD son resistentes a la infección
del bacteriófago F2. Las partículas bacteriófagas fijan por
adsorción a los lados del pili F, pero ningún RNA penetra
en la célula (4). Estos fenotipos traD adicionales sugieren
la validez de preguntar si la sincronización de la función de
traD bien puede estar en un primer tiempo en la
conjugación, por ejemplo cuando un pili extendido F este
presente. Sin embargo, por lo que la conjugación, nuestro
experimento elimina explícitamente esta posibilidad.
El producto de traD es una proteína interna de la
membrana de peso molecular cercano a 78 000 (14, 20;
observaciones inéditas). Puesto que es una proteína de la
membrana, la respuesta de la proteína traD39 (Ts) a la
temperatura es potencialmente interesante. El immunoblot
demostró que la proteína no está conforme a síntesis termo
sensible. En el experimento de cambio de temperatura la
proteína mutante de traD39 demostró una rápida
inactivación en la temperatura no permisiva, pero la
recuperación extremadamente lenta de la actividad cuando
fue cambiada a la temperatura permisiva. El tiempo de
recuperación de la proteína traD39 (mas de 4 hrs para
recuperar su actividad máxima) es especialmente notable
en comparación con el intervalo de 30 minutos durante el
cual toda una población de receptoras nuevamente
acopladas hace competente como bacterias donantes
(observación inédita). Una posibilidad de esta discrepancia
es que la proteína traD39 sintetizada en 42°C se inactivo
irreversiblemente y que la regulación aprieta el nivel de
resultados de la expresión de la proteína tra en una bacteria
donante existente puesta a 32°C. Una segunda posibilidad
es que la proteína traD39 inactiva está incorporada en una
estructura celular (por ejemplo, el cuerpo basal del pili F),
y toma varias generaciones de crecimiento a 32°C para
diluir hacia el exterior las moléculas de traD inactivas
presentes en estos sitios. Una tercera posibilidad es que
incluso en la temperatura permisiva la mayor parte del
producto de traD39 sintetizado es inactivo; puede entonces
tomar muchas generaciones para acumular un nivel
suficiente de la forma activa de la proteína para que ocurra
la transferencia conjugativa. Esta última sugerencia es
constante con que la eficacia de la transferencia de los
donantes de JCFL39 en la temperatura permisiva.
Los experimentos en curso actualmente en este
laboratorio sugieren actualmente que la función de la
proteína traD en la conjugación puede ser, servir como un
ancla en la membrana para la DNA helicasa 1, el producto
del gen F lac (1). De esta manera, la energía de la hidrólisis
del ATP es usada para desenrollar el círculo del plásmido F
y para desplazar la enzima, el desenrollar con respecto a la
DNA que es enrollada seria convertida directamente en la
fuerza motiva para el transporte de un soporte del DNA de
los plásmidos en la bacteria receptora. El hecho de que
hayamos demostrado que la función de traD es requerida
cuando las bacterias de acoplamiento están en contacto con
su superficie celular es constante con los requisitos de este
modelo.
Aunque estos experimentos ayuden a aclarar
ciertos aspectos de las etapas implicadas en la conjugación
bacteriana, todavía sigue siendo un número de pasos (FIG.
1) para los cuales hay menos que evidencia definitiva.
Primero, no hay ninguna evidencia convincentemente de
que la función del pili F sea la contracción para traer las
células de acoplamiento y ponerlas en contacto superficial.
En segundo lugar, poco se sabe sobre la naturaleza de
conversión de un par de acoplamiento inestable en un par
de acoplamiento estable. Y tercero, según lo observado
acentuando en una revisión reciente, mucho queda
aprender sobre la bioquímica de los productos de tra
implicados en el metabolismo conjugativo del DNA (27).
Finalmente, los experimentos hacen posible una
comparación interesante de la conjugación mediada por F a
la transferencia conjugativa de plásmidos que ocurre en
bacterias Gram (+), tales como Streptococcus faecalis,
donde no se ha encontrado pili sexual. En el S. faecalis,
hay evidencia de que una feromona sexual induce que la
célula se agrupe y transfiera el DNA del plásmido,
mientras que las bacterias están en contacto superficial
(11). Puesto que no creemos que el pili F no desempeñe un
papel directo en la transferencia del DNA, una
comparación se puede hacer entre la función del pili sexual
encontrado en las bacterias Gram (-) y la de las células
agrupadas inducidas por la feromona sexual en bacterias
Gram (+). Es posible que los acontecimientos subsecuentes
de la transferencia del DNA que ocurren se puedan
relacionar más directamente el uno con el otro.