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Carmen Fidalgo
Agustí Gonzalez
Alba Martínez
Alejandro Guillén
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 3
OBJETIVOS .......................................................................................................................... 3
PROTOCOLO ........................................................................................................................ 4
1. Transformación de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 por el método triparental mating ............... 4 Formatted: Font: 9 pt
(REFERENCI
REFERENCIAS ................................................................................................................ 9
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PRESENTACIÓN DEL CASO
A HUMAN COLONY IS ESTABLISHED ON A NEW, RECENTLY DISCOVERED PLANET. AFTER A SHORT TIME OF LIVING
THERE, PEOPLE BEGIN TO FEEL DIZZY AND SICK, AND PART OF THE POPULATION BECOMES BED-RIDDEN. THEY
CONTACT EARTH AND EXPLAIN THE SYMPTOMS TO A DOCTOR, WHO TELLS THEM THEY SHOULD TAKE 1 MG
SCOPOLAMINE DAILY. UNFORTUNATELY, WHEN THE FIRST AID KIT WAS PACKED, SCOPOLAMINE WAS CONFUSED
WITH ANOTHER ALKALOID, HYOSCYAMINE, WHICH HAS A SIMILAR STRUCTURE BUT DIFFERENT THERAPEUTIC
EFFECTS.
AFTER CONTACTING BASE CAMP AGAIN, THE COLONISTS ARE INFORMED BY THE DOCTOR THAT HYOSCYAMINE HAS
SOME UNDESIRABLE SECONDARY EFFECTS, AND THAT THE BIOTECHNOLOGY LABORATORY WOULD INSTRUCT
THEM HOW TO TRANSFORM HYOSCYAMINE INTO SCOPOLAMINE. IN THE NEW PLANET, THERE IS A LABORATORY
BIOLOGICAL MATERIAL
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RESOLUCIÓN DEL CASO
INTRODUCCIÓN
El caso plantea la resolución de una misión en un nuevo planeta. Esta misión consiste
en proporcionar las instrucciones necesarias para la transformación del compuesto
hiosciamina en escopolamina, el fármaco requerido en el nuevo planeta.
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PROTOCOLO
1. Transformación de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 por el método triparental
mating (REFERENCIAdescrito por Hoekema et al., 1983).
1.1 Obtención de células E.coli DH5α competentes. Protocolo descrito por Sambrook Formatted: Font: Italic, Font color: Background 2,
Spanish (Spain)
et al., 1989.
Formatted: Font: Italic, Font color: Background 2,
Spanish (Spain)
● Inocular una sola colonia bacteriana en 5 ml de LB durante unala noche a 37 ° C con
agitación vigorosa.
● Transferir 1 ml del cultivo del cultivo generado en 100 ml de LB e incubarción a 37 ° C
con agitación vigorosa hasta que el OD600 alcance 0,4.
● Enfriar los cultivos a 0 ° C durante 10 min y recuperar las células por centrifugación a
4500 rpm durante 10 min a 4 ° C. Decantar el medio del sedimento celular.
● Resuspender el sedimento por agitación o vórtex suave en 30 ml de la solución de
MgCl2-CaCl2 enfriado y recuperar las células por centrifugación a 4500 rpm durante 10
min a 4 ° C. Decantar el medio.
● Resuspender el Pellet por agitación o vórtex suave en 1 ml de CaCl2 0,1 M y 1 ml de
glicerol al 40%.
1.2 Introducción del plásmido pHY8 en la cepa donadora E.coli DH5α mediante el
método conde CaCl2. (Protocolo de Vadawale, A. et al., 2011).
● Mezclar en un tubo estéril en agitación 100-200 µl de células tratadas con CaCl2 con
hasta 5 µl del plásmido. Enfriar el tubo 30 min en hielo.
● Incubar a 42ºC en un bañnyo de agua 90 segundos exactos y rápidamente enfriar en
hielo 2 min.
● Añadir 400-800 µl de LB al tubo e incubar durante 45 min a 37 ° C.
● Sembrar las células en placas con LB líquido con 50 μg/ml de kanamicina.
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● Incubar a 37 ° C durante 16-18 horas.
1.3 Triparental mating con E. coli DH5a con pHY8 (kanR) como cepa donante, E. cColi Formatted: Font: (Default) +Headings (Calibri Light),
Italic, Font color: Background 2, Spanish (Spain)
DH5a con pRK2013 (kanR) como la cepa ayudante y Agrobacterium tTumefaciens
Formatted: Font: (Default) +Headings (Calibri Light),
LBA4404 (RifR, TetR) como cepa receptora. El procedimiento fue está descrito por Italic, Font color: Background 2, Spanish (Spain)
● Sembrar en una placa de agar Luria (sin ningún antibiótico) una colonia de estaba
preparado una colonia de cada cepa en posiciones separadas como se muestra en la Commented [B2]: Esta frase no tiene sentido
figura 2.
● Mezclar las tres cepas bacterianas y dejar a 30 ° C durante 12-18 horas. Por
● Suspender las bacterias deen la placa de agar Luria en 1 ml de LB. Hacer una dilución en
serie de 0,1 ml de suspensión bacteriana en 0,9 ml de LB seguida de otras diluciones de
hasta 10-4 -10-5.
● Mezclar100 µl de cada dilución en medio de agar de Luria con los antibióticos
Kanamicina, TetraciclinaTet y RifampicinaRif y esparcir uniformemente en las placas.
● Incubar las placas durante 4-5 días.
r realiza por los marcadores de resistencia a antibióticos de las distintas cepas (tabla 1). Sólo las Formatted: Font: 11 pt, Highlight
células de Agrobacterium transformadas pueden crecer en un medio con rifampicina, Formatted: Font: 11 pt, Italic
Formatted: Font: 11 pt, Italic
tetraciyclinae y kanamiciyna, de manera que las colonias que crezcan s obteniden esas
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condiciones as pasados los 4-5 días, serán las colonias generadas de las células de
Agrobacterium tumefaciens correctamente transformadas, es decir laos que contengan los tres Formatted: Font: 11 pt, Italic
genes de resistencia. Estas colonias se deberán emplearusados para infectar las células s cálleles
vegetales en procesos posteriores.
Para asegurar que estas colonias son de Agrobacterium transformado se puede realizar una
validación de la transformación mediante PCR y electroforesis.Para validar que las colonias de
Agrobacterium tumefaciens seleccionadas están transformadas, se puede realizar una PCR para Formatted: Font: (Default) +Body (Calibri), 11 pt, Italic,
Font color: Auto, Spanish (Spain)
la detección del plásmido pYH8, seguida de una electroforesis en gel de Agarosa al 0,8%.
Para llevar a cabo la transformación del gen H6H en la Línea BY2 de tabaco, se transfiere la
bacteria a suspensiones celulares y se hace una selección positiva basándonos en el trabajo
realizado por Ketchum et al. (2007).
Seleccionar una colonia de Agrobacterium tumefación LBA4404 en una placa con medio
YM y kanamicina 50 mg/L. Transferir y crecer durante 2 días a 28ºC en agitación a 250rpm
en 2mL de medio líquido YM con kanamicina.
Coger 250 μL del cultivo de A. tumefaciens en medio líquido y transferir a 25 mL de medio
YM suplementado con kanamicina 50 mg/L y acetosiringona 50 μM. Incubar overnight a
28ºC en agitación a 250 rpm. (OD600 ~ 1.3).
Centrifugar este último cultivo de A. tumefaciens a 3000 g durante 15 min. Descartar el
sobrenadante y resuspender el pellet en 40 mL del cultivo celular de 7 días de la línea BY2
de tabaco.
La suspensión celular con A. tumefaciens se incuba 24 h a 23º C y 125 rpm.
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Una vez transcurridas las 24 h, aspiramos el medio con una pipeta de 5 mL y
resuspendemos el cultivo celular transformado con medio MS con vitaminas y 300mg/L
claforam. Incubar durante 15 minutos en agitación (125 rpm) y 23ºC.
Repetir este proceso de lavado tres veces.
Una vez realizado el cuarto lavado, repartir 2 g de células potencialmente transformadas
a 4 placas de Petri (150mm) que contienen 25 mL de medio MS con vitaminas y 300mg/L
claforam. Dejar creciendo durante 2 semanas a 23ºC.
Después de dos semanas de crecimiento, las células se transfieren a un medio de selección
compuesto por MS con vitaminas y 300 mg/L claforam y 2.5mg/L de kanamicina.
Comprobación de la presencia del gen H6H por qPCR.
Hacer subcultivos con los positivos en 250 mL de medio MS con vitaminas y 2.5mg/L de
kanamicina. Dejar durante 15 días en agitación de 125rpm y 23ºC.
Añadir 20 mL de la suspensión celular a 80mL de una solución de alginato de sodio estéril
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,USA).
Añadir gota a gota la solución anterior a 100 mL de una solución de cloruro de calcio estéril
para formar las perlas biocatalíticas de alginato. El cloruro de calcio ayuda a que el alginato
gelifique.
Al añadir hiosciamina al medio las células transformadas serán capaces de llevar a cabo la
bioconversión a escopolamina como se ha hecho en estudios como Gillet et al., 2000,
Moyano et al. 2007:
Transferir las perlas a un medio MS suplementado con 11.5 μM de ácido 2,4-
diclorofenoxiacético y 1μM de kinetina.
Diluir hiosciamina en agua y añadir esta disolución al medio MS con las perlas de alginato de
manera que la concentración final sea de 200mg/L.
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Cuantificar los niveles de escopolamina de cultivos celulares de 3, 7, 10 y 14 días por HPLC
como se ha hecho por Guillet et al. (2000).
Una vez se han obtenido los resultados, seleccionar las condiciones óptimas para comenzar
el escalado.
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REFERENCIAS
Cusido RM, Palazon J, Bonfill M, Navia-Osorio A, Morales C, Pinol MT. (2002). Improved
paclitaxel and baccatin III production in suspension cultures of Taxus media. Biotechnol Prog
18:418–423.
Hashimoto, T., Yukimune, Y., & Yamada, Y. (1989). Putrescine and putrescine N-
methyltransferase in the biosynthesis of tropane alkaloids in cultured roots of Hyoscyamus
albus. Planta, 178(1), 123-130.
Hoekema A, Hirsch P, Hooykass P. (1983). A binary plant vector strategy based on separation of
the vir and TDNA regions of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid, Nature 303: 179-180.
Moyano, E., Palazón, J., Bonfill, M., Osuna, L., Cusidó, R. M., Oksman-Caldentey, K. M., & Piñol,
M. T. (2007). Biotransformation of hyoscyamine into scopolamine in transgenic tobacco cell
cultures. Journal of plant physiology, 164(4), 521-524.
Sambrook J, Fritsch E. F, Maniatis T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.181.
Vadawale, A., Mihani, R., Mathew, A., & Robin, P. (2011). Transformation of Agrobacterium
Tumifascience LBA 4404 with a Cholin Oxidase-Cox Gene Conferring Salinity Tolerance. In
Proceedings of 2011 second International Conference on Agricultural and Animal Science IPCBEE
vol. 22 (2011) IACSIT Press, Singapore pp (Vol. 175).