CHM3102-A2005

Révision: séquençage des protéines et

d’ADN

14/12/2005

1
 Ch 7: Stratégie de séquençage d’une protéine
Étapes impliquées (il faut des aliquots pour chaque étape) :
1. Détermination du nombre de chaînes polypeptidiques (sous-unités) dans la
protéine
a) Par analyses des résidus N-terminal (ex., chlorure de dansyl) et C-terminal (ex.,
carboxypeptidase)
2. Coupure des liens disulfures (inter- ou intramoléculaires)
a) Dénaturation de la protéine (ex., avec hydrochlorure de guanidine ou des surfactants
comme SDS)
b) Réduction avec du DTT (ex., dithiothréitol) suivi par alkylation avec iodoacétate
3. Détermination de la composition des acides aminés
a) Hydrolyse acide (HCl, 6M, 24h, 100ºC) ou basique
b) Dérivation avec un fluorophore (marquage): ex, OPA
c) Séparation des OPA-aa par chromatographie (HPLC)
4. Coupeur des chaînes polypeptiques trop longues en des plus petits fragments
peptidiques par des réactions spécifiques
a) Digestion enzymatique (ex., trypsine et chymotrypsine)
b) Clivage chimique avec du CNBr
5. Séquençage des fragments peptidiques par la dégradation d’Edman
a) Réaction avec du PITC suivi par séparation des PTH-aa par HPLC
6. Élucidation de la séquence par recouvrement des séquences des différents
fragments
7. Détermination des positions les liens disulfures entre les sous-unités
2
1. Détermination du nombre de chaînes polypeptidiques (sous-
unités) dans la protéine: analyses des résidus terminaux

O R H H O R H
H N
R N N COO-
NH3+ H O H R H

résidu N-terminal résidu C-terminal

™ Puisque chaque chaîne polypeptidique possède un résidu N-terminal et C-

terminal, le nombre de sous-unités distinctes dans une protéine peut être
déterminé en identifiant le nombre de chacun des résidus terminaux.

3
2. Coupure des liens disulfures

COO- COO- COO- COO-

+ + + + +
H3N CH H3N CH H3N CH H3N CH
CH2 SH HS CH2 CH2 S S CH2

Cystéine Cystéine Cystine

Insuline Les liens disulfures

doivent être coupés
avant le séquençage
pour séparer et déplier
les sous-unités.

4
2. b) Réduction avec du dithiothréitol (DTT) ou du 2-mercaptoéthanol:
Cystine

H N N H CH 2 SH
H C CH 2 S S CH 2 C H + 2 HSCH 2 CH 2 OH ou CH 2 OH
C O O C CHOH
CH 2 SH

DTT

Cystéines
H N N H HO
SCH 2 CH 2 OH S
H C CH 2 SH HS CH 2 C H + ou
SCH 2 CH 2 OH S
C O O C HO

Alkylation

H N H N
alkylation
H C CH2 SH + ICH2COO- H C CH2 SCH2COO- + HI
C O Iodoacétate C O

Cystéine Cystéine protégée 5

3. Détermination de la composition d’acides aminés d’une
protéine

™ Le nombre de chaque acide aminé dans une chaîne polypeptidique est un

paramètre caractéristique de chaque protéine. Une protéine inconnue peut
souvent être identifiée en mesurant le pourcentage relatif des différents
acides aminés et en comparant avec des bases de données.
™ Premièrement, les liens peptidiques dans une protéine sont hydrolysés par
traitement acide, basique ou enzymatique. Les acides aminés libérés sont
ensuite séparés et quantifiés.
a) Ex., Traitement acide: polypeptides + 6 M HCl, reflux à 100-120°C pour 24
hrs sous vide.
ƒ Des temps de réaction plus long sont nécessaires pour une hydrolyse complète
des résidus Leu, Val et Ile.
ƒ Trp est considérablement dégradée. La vitesse de dégradation de certains
résidus, tels que Thr, Tyr et Ser peut être mesurée et un facteur de correction
peut être inclut pour tenir compte de la perte de ces acides aminés en fonction
du temps d’hydrolyse.
ƒ l’hydrolyse acide convertit Asn à Asp et Gln à Glu, respectivement (du NH4+ est
éliminé).
ƒ Les méthodes enzymatiques sont surtout utilisées pour la détermination de
l’Asn, de la Gln et du Trp

6
 b) Dérivation

• Dérivation pré-colonne des

amines (acides aminés)
– Fluorescamine

– OPA :
o-phtaldialdéhyde

– NDA : naphtalène-2,3-
dicarboxaldéhyde

– CBQCA : 3-(4-
carboxybenzoyl)-quinoline-
2-carboxaldéhyde

7
c) Séparation après dérivation pré-colonne des acides aminés avec
l’OPA

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4. Coupure spécifique des liens peptidiques

a) Fragmentation enzymatique

Endopeptidases:
Coupure spécifique de liens
peptidiques à l’intérieure
d’une chaîne

Exopeptidases:
Coupure d’un acide aminé
N- ou C-terminal d’une chaîne
peptidique

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a) Fragmentation enzymatique par la trypsine

trypsine

b) Fragmentation chimique: Le CNBr coupe les liens peptidiques du côté C-terminal

d’un résidu Met.

Br-

H2O

10
5. Dégradation d’Edman (analyse séquentielle):

phényl isothiocyanate (PITC)

N- -C

(séquençage de peptides
constitués de 40 à 60 résidus)

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Séparation des acides aminés de phénylthiohydantoin (étalons) par
chromatographie liquide à haute performance

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6. Détermination de l’ordre des fragments peptidiques

™ La séquence des fragments peptidiques individuels est déterminé en

établissant l’ordre dans lequel ils étaient connectés.

™ La séquence des acides aminés dans un 1er set de fragments est

comparé avec celui d’un 2è set de fragments pour lequel les points de
coupure sont différents.

™ Un recouvrement de quelques résidus est généralement suffisant pour

identifier un point de connexion.
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7. Détermination des positions des liens disulfures
™ Le mélange des fragments peptidique est analysé par
électrophorèse sur gel en 2D en utilisant les mêmes conditions de
séparation dans les deux directions.
ƒ Après séparation dans la 1ère direction, la matrice est exposée à
l’acide performique pour couper tout les liens disulfures existants.
™ Ensuite la séparation est effectuée dans la 2è direction.
ƒ Les fragments qui ne contiennent pas de liens disulfures sont
positionnés sur la diagonale puisque leur vitesse de migration dans le
deux directions est identique.
ƒ Les fragments contenant des liens disulfures montrera 2 points pour
les fragments produits par oxydation qui sont positionnés on dehors
de la diagonale.
™ Les fragments liés par des ponts disulfures peuvent être isolés du
gel et identifiés par séquençage.

14
Ch 8: Amplification et séquençage des
acides nucléiques

ADN chromosomique, plasmides

(ADN bactérien), ARN messager

Rupture cellulaire

Isolation et purification
des acides nucléiques

Concentration et amplification et
séquençage de l’ADN ou de
l’ARN isolé
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L’amplification des acides nucléiques par réaction de
polymérisation en chaîne

™ La quantité d’ADN dans un échantillon est souvent insuffisante pour

le séquençage et l’analyse.

™ L’amplification en chaîne par polymérase (ACP) est un procédé

d'amplification enzymatique in vitro d'une séquence définie d'ADN
(Kary Mullis, Prix Nobel 1993).

™ Une seule molécule d’ADN suffit pour l’ACP. Avec l’ACP, plusieurs
tâches qui avant étaient impossible sont maintenant devenues de
routine (ex. identification d’un coupable avec un seul cheveu ou
spermatozoïde et l’identification rapide de maladies infectieuses).

™ Principes de l’ACP
™ ACP en temps réel (mesure semi-quantitative des produits de l’ACP
durant la réaction)
™ Transcription inverse de l’ARN en ADN complémentaire

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La réaction d’amplification ACP est constituée de 3 étapes principales:
• La réaction d’amplification est effectuée dans un seule éprouvette qui est placée dans un
thermocycleur

Étape 1- dénaturation de l'ADN (séparation

des deux brins de la double hélice) à
température élevée (95°C).

Étape 2- positionnement des 2 amorces

(présentent en excès) en face de leurs
séquences complémentaires, sur les
brins d'ADN, et fixation sur ces cibles
(hybridation) à 50-60°C. 5’

Étape 3- phase d'extension à 72°C dans

laquelle l'ADN polymérase synthétise,
à partir des amorces, le brin
complémentaire de celui qui sert de
matrice et un excès des 4 acides
désoxyribonucléiques (dATP,
dCTP, dGTP et dTTP). 17
18
™ La réaction d’amplification atteint éventuellement un plateau, le nombre
de copies n’augmente plus. Ceci est dû à l’épuisement de réactifs (amorces
et nucléotides), à l’inhibition enzymatique par des phosphates libérés
durant la réaction, à la détérioration thermique de l’ADN polymérase et à
l’hybridation des brins plus long d’ADN à des températures élevées au
dépit de l’hybridation de l’ADN à simple brin avec des amorces.

(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 19

Transcription inverse de l’ARN
5' 3' ARNm
72°C

5' 3'

amorce 42°C

5' 3'
3' 5'
transcriptase
inverse

5' 3'
5'

5' 3'
ARNm
3' 5' ADN

94°C

ACP de l'ADN 20
Séquençage des acides nucléiques

™ Puisque la séquence des nucléotides dans une molécule d’ADN ou

d’ARNm détermine sa fonction, le séquençage des acides
nucléiques est une tâche bioanalytique importante.

™ Le développement de méthodes rapides et automatisées pour le

séquençage des acides nucléiques a attiré beaucoup d’intérêt dans
les dix dernières années, surtout dans le contexte du projet du
génome humain.

™ Méthodes de séquençage:
9 microréseaux d’ADN (pour des oligonucléotides courts)
- méthode de Maxam-Gilbert
9 méthode de Sanger

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 Enzymes de restriction
• L’ADN doit avant être coupé (« digéré ») en plus petits fragments de jusqu’à 800
paires de bases.
• Après digestion et séparation par électrophorèse sur gel, les fragments d’ADN à
simple brin peuvent être séquencés.

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Méthode de Sanger
(méthode didéoxy ou méthode de terminaison de chaîne)

™ La méthode de Sanger est basée sur la synthèse d’un brin complémentaire

de l’ADN en utilisant les oligonucléotides à séquencer comme matrices (tel
que pour l’ACP).
™ Contrairement à l’ACP, la synthèse du brin complémentaire est effectuée
en présence d’un nucléotide de terminaison de chaîne.
™ L’échantillon d’ADN à simple brin est divisé en 4 portions. Chaque portion
est incubée avec de l’ADN polymérase, les quatre désoxyribonucléotides
triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) et une amorce appropriée.
ou du fluorophore
™ Le brin complémentaire synthétisé est marqué en incorporant du 32P, soit
dans l’amorce ou dans un des désoxyribonucléotides triphosphates, ou
marqué avec les fluorophores pour détection par la fluorescence.
™ Dans chacun des 4 mélanges réactionnels, O O O
-
O P O P O P O Base
est ajouté un 2’,3’-didéoxynucléotide O
O- O- O- H H
triphosphate (ddNTP) en petite quantité. H 3' H
H H
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ddNTP
™ Dès que un ddNTP est incorporé dans la chaîne croissante, la réaction se
termine puisqu’il n’y aura pas de 3’-OH libre pour l’incorporation d’un autre
nucléotide.
™ L’incorporation d’un ddNTP résulte dans une série de chaînes tronquées,
chacune terminée par un analogue didéoxy dans la position de la base
correspondante.
™ Les produits de chacune des 4 réactions sont séparés selon leur taille par
électrophorèse sur gel dans des voies parallèles.
™ La séquence du brin complémentaire d’ADN est déterminée par
autoradiographie. Cette séquence est ensuite utilisée pour identifier la
séquence de l’ADN original.

24
Exemple de séquençage d’un fragment d’ADN par la méthode de Sanger

Électrophorèse
sur gel

25
Exemple de séquençage d’ADN par la méthode de Sanger marqueurs
fluorescents

26
(D’après http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/bcintro/list_of_figures.htm)
 Marquage avec 32P versus marquage avec 4 fluorophores

Question: Quelle est la séquence des acides nucléiques dans cet échantillon
analysé par le marquage avec 32P et par le marquage fluorescent où les amorces
« primers » ont été marqués comme: pour réaction avec ddATP,
- pour réaction avec ddTTP, pour réaction avec ddCPT et pour réaction
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avec ddGTP?
28
Question: Quelle est la séquence de l’échantillon d’ADN si les 4 amorces
« primers » ont été marqués pour les réaction avec les ddNTP comme:
vert: A, rouge: T, bleu: C et noir: G ?

(D’après http://www.sars.no/facilities/sequencing.php)
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