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14/12/2005
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Ch 7: Stratégie de séquençage d’une protéine
Étapes impliquées (il faut des aliquots pour chaque étape) :
1. Détermination du nombre de chaînes polypeptidiques (sous-unités) dans la
protéine
a) Par analyses des résidus N-terminal (ex., chlorure de dansyl) et C-terminal (ex.,
carboxypeptidase)
2. Coupure des liens disulfures (inter- ou intramoléculaires)
a) Dénaturation de la protéine (ex., avec hydrochlorure de guanidine ou des surfactants
comme SDS)
b) Réduction avec du DTT (ex., dithiothréitol) suivi par alkylation avec iodoacétate
3. Détermination de la composition des acides aminés
a) Hydrolyse acide (HCl, 6M, 24h, 100ºC) ou basique
b) Dérivation avec un fluorophore (marquage): ex, OPA
c) Séparation des OPA-aa par chromatographie (HPLC)
4. Coupeur des chaînes polypeptiques trop longues en des plus petits fragments
peptidiques par des réactions spécifiques
a) Digestion enzymatique (ex., trypsine et chymotrypsine)
b) Clivage chimique avec du CNBr
5. Séquençage des fragments peptidiques par la dégradation d’Edman
a) Réaction avec du PITC suivi par séparation des PTH-aa par HPLC
6. Élucidation de la séquence par recouvrement des séquences des différents
fragments
7. Détermination des positions les liens disulfures entre les sous-unités
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1. Détermination du nombre de chaînes polypeptidiques (sous-
unités) dans la protéine: analyses des résidus terminaux
O R H H O R H
H N
R N N COO-
NH3+ H O H R H
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2. Coupure des liens disulfures
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2. b) Réduction avec du dithiothréitol (DTT) ou du 2-mercaptoéthanol:
Cystine
H N N H CH 2 SH
H C CH 2 S S CH 2 C H + 2 HSCH 2 CH 2 OH ou CH 2 OH
C O O C CHOH
CH 2 SH
DTT
Cystéines
H N N H HO
SCH 2 CH 2 OH S
H C CH 2 SH HS CH 2 C H + ou
SCH 2 CH 2 OH S
C O O C HO
Alkylation
H N H N
alkylation
H C CH2 SH + ICH2COO- H C CH2 SCH2COO- + HI
C O Iodoacétate C O
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b) Dérivation
– OPA :
o-phtaldialdéhyde
– NDA : naphtalène-2,3-
dicarboxaldéhyde
– CBQCA : 3-(4-
carboxybenzoyl)-quinoline-
2-carboxaldéhyde
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c) Séparation après dérivation pré-colonne des acides aminés avec
l’OPA
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4. Coupure spécifique des liens peptidiques
a) Fragmentation enzymatique
Endopeptidases:
Coupure spécifique de liens
peptidiques à l’intérieure
d’une chaîne
Exopeptidases:
Coupure d’un acide aminé
N- ou C-terminal d’une chaîne
peptidique
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a) Fragmentation enzymatique par la trypsine
trypsine
Br-
H2O
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5. Dégradation d’Edman (analyse séquentielle):
N- -C
(séquençage de peptides
constitués de 40 à 60 résidus)
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Séparation des acides aminés de phénylthiohydantoin (étalons) par
chromatographie liquide à haute performance
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6. Détermination de l’ordre des fragments peptidiques
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Ch 8: Amplification et séquençage des
acides nucléiques
Rupture cellulaire
Isolation et purification
des acides nucléiques
Concentration et amplification et
séquençage de l’ADN ou de
l’ARN isolé
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L’amplification des acides nucléiques par réaction de
polymérisation en chaîne
Une seule molécule d’ADN suffit pour l’ACP. Avec l’ACP, plusieurs
tâches qui avant étaient impossible sont maintenant devenues de
routine (ex. identification d’un coupable avec un seul cheveu ou
spermatozoïde et l’identification rapide de maladies infectieuses).
Principes de l’ACP
ACP en temps réel (mesure semi-quantitative des produits de l’ACP
durant la réaction)
Transcription inverse de l’ARN en ADN complémentaire
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La réaction d’amplification ACP est constituée de 3 étapes principales:
• La réaction d’amplification est effectuée dans un seule éprouvette qui est placée dans un
thermocycleur
5' 3'
amorce 42°C
5' 3'
3' 5'
transcriptase
inverse
5' 3'
5'
5' 3'
ARNm
3' 5' ADN
94°C
ACP de l'ADN 20
Séquençage des acides nucléiques
Méthodes de séquençage:
9 microréseaux d’ADN (pour des oligonucléotides courts)
- méthode de Maxam-Gilbert
9 méthode de Sanger
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Enzymes de restriction
• L’ADN doit avant être coupé (« digéré ») en plus petits fragments de jusqu’à 800
paires de bases.
• Après digestion et séparation par électrophorèse sur gel, les fragments d’ADN à
simple brin peuvent être séquencés.
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Méthode de Sanger
(méthode didéoxy ou méthode de terminaison de chaîne)
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Exemple de séquençage d’un fragment d’ADN par la méthode de Sanger
Électrophorèse
sur gel
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Exemple de séquençage d’ADN par la méthode de Sanger marqueurs
fluorescents
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(D’après http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/bcintro/list_of_figures.htm)
Marquage avec 32P versus marquage avec 4 fluorophores
Question: Quelle est la séquence des acides nucléiques dans cet échantillon
analysé par le marquage avec 32P et par le marquage fluorescent où les amorces
« primers » ont été marqués comme: pour réaction avec ddATP,
- pour réaction avec ddTTP, pour réaction avec ddCPT et pour réaction
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avec ddGTP?
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Question: Quelle est la séquence de l’échantillon d’ADN si les 4 amorces
« primers » ont été marqués pour les réaction avec les ddNTP comme:
vert: A, rouge: T, bleu: C et noir: G ?
(D’après http://www.sars.no/facilities/sequencing.php)
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