INTRODUCCIÓN.

La cromatografía de intercambio iónico es un método que permite la separación de moléculas

basada en sus propiedades de carga eléctrica. Se compone de dos fases: la fase estacionaria o
intercambiador iónico, y la fase móvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas
electrostáticas fijas, que retienen contraiones móviles que pueden intercambiarse por iones de la
fase móvil, la cual suele ser una disolución acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro
disolvente orgánico miscible con agua que contiene especies iónicas generalmente en forma de
buffer. Los iones de ésta compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria.

FUNDAMENTO

El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que las moléculas cargadas se

adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas moléculas pueden ser
asociadas o disociadas cambiando el ambiente iónico. La separación mediante intercambiadores
iónicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al
intercambiador utilizando condiciones que originan una unión fuerte y estable; a continuación, se
eluye de la columna con buffers de diferentes pH o diferente fuerza iónica, compitiendo los
componentes del buffer con el material por los sitios de unión.

R+ A- es un intercambiador aniónico en la forma A- y B- representa a los aniones en la disolución.

INTERCAMBIADORES ANIÓNICOS: Son portadores de grupos con cargas positivas que unen
aniones de forma reversible. Si el grupo cargado es positivo, es un intercambiador de aniones. Los
intercambiadores débilmente básicos más corrientes son los grupos aminos alifáticos o
aromáticos.

La resina utilizada en la columna de intercambio aniónico fue de CAPTO DEAE, la cual presenta un
coeficiente dinámico de enlace de 0.03 g/ml. La muestra fue cargada y se favoreció su pegamento
a la columna debido a su pH de 8 (Punto isoeléctrico 6.1), posteriormente se cambiaron las
condiciones para favorecer la elución de la muestra, esto se realizó con la solución de lavado a pH.

La muestra se diluyó 1 a 1 con Tris/HCl 100 mM y sulfato de amonio 2M, pH 8.0, con el objetivo de
ajustar la conductividad, obteniendo un volumen final de: 72 mL. El sulfato de amonio es una sal
que presenta una alta polaridad y con ello, se une fuertemente al agua, lo que induce la exclusión
del agua.

Sumado a lo anterior se establece como ideal trabajar en un rango de pH de entre 5.0 y 8.5, ya que
si excede de 8.5 la interacción hidrofóbica es muy débil.

La muestra fue homogenizada y posteriormente centrifugada durante 15 minutos a 4000 rpm, una
vez finalizada la centrifugación, se recuperó el sobrenadante, que es donde se localiza la proteína
de interés. También se realizó una filtración, se obtuvo un volumen final de: 52 ml.

El gel de electroforesis de poliacrilamida (PAGE) es uno de los métodos más usados en el

laboratorio para separar macromoléculas biológicas como por ejemplo proteínas y ácidos
nucléicos. Las macromoléculas son diferenciadas de acuerdo con la movilidad que tengan en el gel
en función de la longitud, conformación y carga de la molécula. El SDS (sodium dodecyl sulfate) es
usado para linealizar las proteínas, además de también cargarlas negativamente. La unión del SDS
a la cadena polipeptídica imparte una distribución equitativa de la carga por unidad de masa.
Como resultado, las proteínas cargadas negativamente migran hacia el electrodo positivo y se van
fraccionando de acuerdo a su tamaño.