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Autores do trabalho:
- Jéssica Lemos
- Ludovina Rebelo
Riba de Ave
Maio 2016
Fundamentos de Engenharia Genética
Definição e Função
A engenharia genética é o termo usado para descrever algumas técnicas modernas
em biologia molecular que vem a revolucionar o antigo processo da biotecnologia. Pode
também ser definida como o conjunto de técnicas capazes de permitir a identificação,
manipulação e multiplicação de genes em organismos vivos, é uma ciência recente que
tem possibilitado a realização de experiências na área da genética, com resultados
bastante surpreendentes sobre a vida.
A Engenharia Genética consiste na utilização de tecnologias que permitem alterar o
genoma de organismos, inserindo um ou mais genes no DNA, ou silenciando a expressão
de um gene já existente. O objetivo da engenharia genética é adicionar ou retirar
características de seres vivos para benefício do homem.
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Fundamentos de Engenharia Genética
Enzimas de restrição
Durante 25 anos, desde 1950 a 1975, a molécula de DNA foi considerada “intocável”. A
partir da década de 70, porém, ocorreu uma verdadeira revolução biotecnológica. Um dos
contributos mais importantes para esta revolução biotecnológica foi, sem dúvida, a
descoberta das enzimas de restrição ou endonucleases de restrição, em bactérias.
Os vírus invadem frequentemente as bactérias e afetam o seu DNA. Algumas bactérias
possuem um mecanismo de defesa contra os vírus que consiste na produção de enzimas
chamadas endonucleases de restrição, isto é, enzimas que cindem a cadeia de DNA
quando encontram uma determinada sequência de pares de bases. Atuam, portanto, em
pontos específicos, catalisando a fragmentação do DNA em porções menores.
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Enzimas ligases
As extremidades coesivas do DNA deixadas livres como resultado da atuação das
enzimas de restrição podem ligar-se por complementaridade a outro DNA. Neste processo
intervêm outras enzimas chamadas ligases do DNA que catalisam o processo que permite
que fragmentos de DNA se voltem a ligar.
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Vetores e plasmídeos
A descoberta das enzimas de restrição e das ligases do DNA forneceu aos
investigadores a oportunidade de manipular e transferir genes de uma molécula de DNA
para outra, isto é, de um organismo para outro.
Para esta transferência só faltava um vetor, isto é, uma entidade que pudesse levar o
material genético do genoma de onde foi retirado para o genoma que o fosse receber.
Existem, hoje, diferentes tipos de vetores os quais se salienta os plasmídeos das
bactérias.
Muitas bactérias possuem, para além da molécula de DNA principal pequenas
moléculas de DNA circulares que se designam por plasmídeos. Desta forma, os
plasmídeos são pequenos fragmentos de DNA que, geralmente, não possuem genes
essenciais para a sobrevivência da bactéria, que podem ser retirados e replicar-se
independentemente da molécula de DNA principal. Alguns plasmídeos são particularmente
interessantes porque possuem um único local que reconhece uma determinada enzima de
restrição, abrindo, portanto, num único ponto. Possuem genes que lhes conferem
resistência a um antibiótico, o que permite localizar as bactérias que têm o DNA
recombinante.
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Uma das primeiras técnicas utilizadas em engenharia genética foi a técnica do DNA
recombinante (rDNA).
A tecnologia do DNA Recombinante é uma técnica que permite produzir moléculas de
DNA a partir da combinação de genes com proveniências diferentes.
Existem três formas fundamentais de obtenção destes genes:
1. Criar-se uma biblioteca de genes ou banco genómico, que consiste numa coleção
de um grande número de fragmentos de DNA do genoma que são armazenados
em vetores para posteriores utilizações.
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fragmentos de restrição, em dupla hélice, mas com uma pequena extensão em cadeia
simples em cada extremidade (extremidades coesivas).
Os fragmentos de DNA que contêm os genes de interesse são, depois, incorporados
numa entidade constituída por DNA capaz de transportar o fragmento de DNA para uma
célula. Estas entidades designam-se vetores (é um espécie de “transportador” que
transfere o material genético de um genona para outro.). Os bacteriófagos, vírus que
atacam as bactérias, podem ser usados como vetores. Muitas bactérias, para além da
cadeia de DNA principal, possuem cadeias de DNA livres e de forma circular, os
plasmídeos, cujos genes, geralmente, não são essenciais à sobrevivência da bactéria,
podendo ser retirados e usados também como vetores.
Os plasmídeos podem replicar-se independentemente da molécula de DNA principal e
podem também fundir-se com ela. Para além destes vetores mais conhecidos, são usados
ainda os lipossomas. Estes são, no essencial, esferas formadas por camadas bilipídicas
preenchidas com DNA. Fundem-se espontaneamente com a membrana celular, libertando
o seu conteúdo no citoplasma. Desta forma, a mesma enzima de restrição que atua no
DNA com o gene de interesse, agora atua sobre o vetor, cortando a cadeia de DNA deste
em zonas específicas, expondo uma sequência nucleotídica complementar. As
extremidades coesivas do fragmento ligam-se, então, à cadeia exposta de DNA do vetor,
estabelecendo-se ligações de hidrogénio entre bases complementares. A enzima DNA
ligase promove a formação de ligações fosfodiéster (ligação com o fosfato – ligação entre
nucleótidos complementares entre duas cadeias) entre as extremidades coesivas de cada
uma das moléculas de DNA.
Desta forma, é produzida uma molécula híbrida estável, o DNA recombinante.
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Assim, esta técnica permite, por exemplo, introduzir porções de DNA provenientes de
vários organismos num microrganismo, e permite a produção de inúmeras cópias do gene
(que poderão ser armazenadas nas bibliotecas de genes) ou da proteína codificada por
este.
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Figura 10- Os cientistas recorrem a esta técnica quando se torna necessário clonar genes sem os seus intrões
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PCR
A PCR (Reação de Polimerização em Cadeia) é uma técnica que permite amplificar
qualquer porção de DNA de uma única célula.
O objetivo da PCR é produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico
de DNA a partir de uma quantidade mínima (exemplo: uma gota de sangue, um fio de
cabelo, …). O DNA molde sofre uma amplificação controlada por enzimas, obtendo-se
milhões de cópias do fragmento de DNA de interesse.
O procedimento de PCR envolve três etapas, cada uma repetida muitas vezes.
1. Desnaturação: O DNA genómico contendo a sequência a ser amplificada é
desnaturado por aquecimento a cerca de 95°C por cerca de 30 segundos. A dupla
fita é aberta (desnaturada), tornando-se uma fita única.
2. Hibridização: Após a separação das fitas, um par de iniciadores ou primers (uma
fita de DNA específica para o gene que se quer estudar) complementam a fita
oposta da sequência de DNA a ser amplificada. Ou seja, um deles é complementar
à sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à
sequência na outra fita. O molde é determinado pela posição dos iniciadores que
se anelam a fita. Essa etapa ocorre a uma temperatura de 60°C.
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PCR
- Diagnóstico de doenças infeciosas e genéticas;
- Amplificação de genes para posterior clonagem e expressão;
- Determinação de variabilidade genética;
- Deteção de OGMs;
- Sexagem de embriões;
- Estudo da expressão génica;
- Grande potencial na Medicina Forense (impressão digital de DNA).
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Referências
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