Prácticas de Tención Gram

UNIVERSIDAD NACIONAL DE HUANCAVELICA
FACULTAD DE CIENCIA DE INGENIERIA

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA
PRÁCTICAS DE TENCIÓN GRAM

INTRODUCCION
De gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes grupos
de bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción. El fundamento
radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias
Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias
Gram- tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica
externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado
con etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram
(+) el colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram
(-) se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan
observarse.
La tinción de Gram es un tipo de tinción empleado en microbiología para la
visualización de las bacterias, debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram que
desarrolló un método de tinción en 1884.[ CITATION PRM09 \l 10250 ]
Por más de una centuria las bacterias han sido clasificadas a la reacción de Gram, la
habilidad de retener un complejo de iodo violeta cuando se trata con un solvente
orgánico tal como el alcohol o la acetona, las bacterias Gram positivas retienen la
tintura y aparecen de color violeta, mientras que las Gram negativas no lo pueden
retener y se tiñen de color rojo para ser vistas con el microscopio.[ CITATION Ade08 \l
10250 ]
I. OBJETIVOS:
 Utilización de técnicas sencillas para la observación de microorganismos

 Conocer o manejo del microscopio óptico para la observación de bacterias
(importancia del objetivo de inmersión)
 Reconocimiento de distintos modelos de pared bacteriana.
MICROBIOLOGIA Página 1
II. FUNDAMIENTO TEORICO

2.1. Tinción:
Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una superficie.
El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos
y poder realizar la observación en microscopio óptico. Dado que las bacterias son
casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran
suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo. De
acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:
a) Tinción simple: El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología
celular.
b) Tinción diferencial: El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre

células bacterianas o entre partes de una misma célula. Estas técnicas utilizan más
de un colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la tinción. Ejemplos:
Tinción de Gram, Tinción de Ziehl-Neelsen, etc.
2.2. Colorantes Los colorantes más utilizados: azul de metileno, cristal violeta,
safranina, son catiónicos y se combinan fuertemente con componentes celulares
cargados negativamente, como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos (las
envueltas externas de los microorganismos están por lo general cargadas
negativamente). [ CITATION PRM09 \l 10250 ]
2.3. Tinción diferencial de Gram: Esta tinción se denominada así por el
bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su
reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram
positivas y gramnegativos (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene
nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos
morfológicos distintos de bacterias). Descripta en forma breve, la secuencia de la
tinción es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se
lava con agua, se cubre con solución Yodada durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo
con agua, decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con
Safranina (color de contraste) durante 1 – 2 min. Lavar y secar.
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la
célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para
prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere
rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste
en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido técnico.
Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano.
La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más
delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la
pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano. [ CITATION Ade08 \l 10250 ]
Descripción de la tinción de GRAM: Las células fijadas al calor sobre un

portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes
básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de
colorante. En este estado, todas las células, tanto las grampositivas como las
gramnegativos, están teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una
solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente activo es aquí el I2; el KI
simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un
complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células
grampositivas como las gramnegativos se encuentran en la misma situación. Se lleva
a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias
en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (Gram
positivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La
diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la
decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de
bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y
disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la
membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de
peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula
se decolora. Las células grampositivas, a causa de sus paredes celulares más espesas
(tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente,

provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la
pared celular. Después de la decoloración las células grampositivas son todavía
azules, pero las gramnegativos son incoloras. Para poner de manifiesto las células
gramnegativos se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante
de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de
contraste las células gramnegativos son rojas, mientras que las grampositivas
permanecen azules.
III.MATERIALES Y METODOS
III.1. Materiales
 Placa Petri
 Asa bacteriológica
 Tubos de ensayo
 Vaso de vidrio
 Mechero de bunsen
 Lujol
 Safranina
 Cristal violeta
 Agua oxigenada
 Ron de quemar
 Porta objeto y cubre objeto
III.2. Los Métodos.
 Primero paso: utilizar la placa

Petri con el asa bacteriológica.
 Segundo paso: empezamos por el cultivo de

microorganismos por superficie
 Sacamos un poco del agar y lo

mezclamos con el agua destilada para
poder de ahí sacar un poco de muestra y
poner en la porta objeto.
 Pasó tres: Al poner en el porta objeto

unas cuantas gotas y hacerlo secar
echamos sobre la muestra el cristal de
violeta.
 Paso cuatro: Tercero ya al echar el

cristal de violeta esperamos en dos
minutos y luego pasamos con un
chorro de agua lento a enjuagar
 Paso Cinco: Al pasar los un

minutos lo enjuagamos con alcohol
acetona.
 Paso seis: Echamos el lugol en la

muestra y esperamos que pase 30s y
lo enjuagamos
 Paso siete: Por último echamos el

colorante de contraste y lo hacemos
secar en el mechero de alcohol para
llevar al microscopio
 Pasó ocho: Por último paso

llevamos al microscopio y
observamos.
IV. RESULTADOS
 Primeramente se terminó de aprender y conocer: la tercera técnica de siembra,
que es por estría.
TÉCNICA DE SIEMBRA POR

ESTRIA
Es usada para aislar cepas puras en una placa Petri a partir de un

inóculo o muestra con diferentes especies. La técnica consiste en,
mediante un asa de siembra previamente esterilizada, rayar la
superficie de cultivo de una placa Petri de forma que en cada pasada
sea menor el número de células depositado, las últimas pasadas
deberán depositar un número tan bajo de células que, una vez
incubadas, se formen colonias puras.
 Después de haber aprendido la técnica de siembra, se aprendió hacer

coloraciones Gram por lo cual se obtuvo las siguientes imágenes:
V.
DISCOSIONES
 La dictaminarían que dé el químico al dar los resultados sobre un estudio de
Gram positiva o negativa es realmente importante para el diagnóstico y buen
tratamiento de la patología relacionada microorganismos es necesario saber
cómo influyen en las manifestaciones clínicas las diferencias existentes entre
la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas en su
detección y en el tratamiento. Porque existen componentes de la pared celular
que contribuyen a la virulencia delas bacterias protegiéndolas de las
respuestas inmunitarias. En el laboratorio se desearía eliminar de forma
selectiva las bacterias Gram positivas de una mezcla de bacterias Gram
positivas y Gram negativas.
 La tinción de Gram no es una prueba fiable de tinción de bacterias en medios
de cultivo con escasos nutrientes (p. ej., cultivos viejos o en fase estacionaria)
o tratados con antibióticos debido a la degradación del peptidoglicano por
parte de estos fármacos.
VI. CONCLUSIONES
Aunque las bacterias no aparecen en diferentes medio que las rodea, difieren
mucho químicamente esta diferencia química es los que permite distinguir las
bacterias por Tinción, pues generalmente, el colorante reacciona con
la célula bacteriana, pero no reacciona con su medio exterior.
Debido a eso la Tinción es importante para la microbiología debido a que:
 Proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea,

permitiendo diferenciar varios tipos morfológicos.
 Permite el estudio de las estructuras internas de la célula bacteriana, tales como
paredes celulares, vacuolas o cuerpos celulares.
 Permite el empleo de mayores amplificaciones.
VII. RECOMENDACIONES
 manejar con cuidado las láminas porta objetos al momento de

manipularlas y llevarles al fuego ya que son frágiles y de fáciles de
romperse.
 Las mesas deberán estar siempre limpias y desocupadas, tu mochila
debe ser colocada en el lugar indicado por el profesor.
 Que las condiciones ambientales durante el proceso sean lo más
próximas a la esterilidad para evitar contaminaciones durante el
manejo del instrumental y de los medios de cultivo.
 Tener cuidado con los materiales de laboratorio.
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
 Adelberg, J. M. (2008). Microbiologia. (M. M. Ed., Ed.) 70 - 89.
 microbiología, D. y. (2009). Zárate, Mariela Soledad Dadamio, Jesica Alí,

Susana . Red Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana.
 PR, M. (2009). Microbiologia Medica. 24 - 34.
 Valencia, U. (2009 ). Observación de grupos microbianos . El Cid Editor |

apuntes.
 Valencia, U. (2009). Observación de grupos microbianos . El Cid Editor |

apuntes.
 Zárate, M. S. (2009). Desarrollo y evaluación de una muestra para control de

calidad en microbiología . Red Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana.

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PRÁCTICAS DE TENCIÓN GRAM

 Utilización de técnicas sencillas para la observación de microorganismos

II. FUNDAMIENTO TEORICO

b) Tinción diferencial: El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre

Descripción de la tinción de GRAM: Las células fijadas al calor sobre un

(tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente,

III.2. Los Métodos.

 Primero paso: utilizar la placa

 Segundo paso: empezamos por el cultivo de

 Sacamos un poco del agar y lo

 Pasó tres: Al poner en el porta objeto

 Paso cuatro: Tercero ya al echar el

 Paso Cinco: Al pasar los un

 Paso seis: Echamos el lugol en la

 Paso siete: Por último echamos el

 Pasó ocho: Por último paso

TÉCNICA DE SIEMBRA POR

Es usada para aislar cepas puras en una placa Petri a partir de un

 Después de haber aprendido la técnica de siembra, se aprendió hacer

Debido a eso la Tinción es importante para la microbiología debido a que:

 Proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea,

 manejar con cuidado las láminas porta objetos al momento de

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

 Adelberg, J. M. (2008). Microbiologia. (M. M. Ed., Ed.) 70 - 89.

 microbiología, D. y. (2009). Zárate, Mariela Soledad Dadamio, Jesica Alí,

 PR, M. (2009). Microbiologia Medica. 24 - 34.

 Valencia, U. (2009 ). Observación de grupos microbianos . El Cid Editor |

 Valencia, U. (2009). Observación de grupos microbianos . El Cid Editor |

 Zárate, M. S. (2009). Desarrollo y evaluación de una muestra para control de

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