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1. ¿Cuál es el tema principal del artículo?

La miel de manuka es un producto producido esencialmente en Nueva Zelanda, y ha sido ampliamente


reconocido por sus propiedades antibacterianas y su sabor específico. En este estudio, se analizaron 264
mieles de Nueva Zelanda y Australia utilizando espectroscopia de RMN de protones junto con quimiometría.

2. ¿Por qué la miel manuka ha tenido impacto internacional recientemente?


En los últimos años, una miel en particular ha tenido un impacto internacional debido a sus excepcionales
propiedades antisépticas: la miel de manuka. Manuka (Leptospermum scoparium) es un árbol de tipo matorral
que crece solo en Nueva Zelanda y en algunas partes de Australia. Su néctar contiene una molécula
específica, dihidroxiacetona (DHA), que se convierte en metilglioxal (MGO) durante la maduración y el
envejecimiento de la miel. Esta última molécula es la principal responsable de la fuerte actividad
antimicrobiana de la miel.

3. ¿Cómo se lleva a cabo típicamente las pruebas de control de calidad de la miel manuka?
La prueba de control de calidad de la miel de manuka es básicamente la misma que para cualquier otra miel,
pero presenta algunas particularidades: la miel de manuka con mayor contenido de MGO (por encima de 250
mg / kg) tiene una tendencia a mostrar resultados positivos falsos para la adulteración del azúcar cuando se
prueba con La prueba de detección de azúcar AOAC 998.12 C4 (Método oficial AOAC 998.12, 2013): Rogers,
Grainger y Manley-Harris (2014) han propuesto una explicación para este fenómeno. Descubrieron que los
ingredientes bioactivos en la miel de manuka podrían fraccionar la proteína de miel postulada, lo que podría
resultar en una mayor diferencia isotópica medida entre la miel entera y su proteína correspondiente, inflando
artificialmente el cálculo del azúcar C4. Otro problema es el análisis de polen, que es la técnica principal para
determinar el origen botánico y geográfico de las mieles. El polen de Manuka es morfológicamente similar a
otra planta que crece y florece al mismo tiempo en las mismas áreas: kanuka (Kunzea ericoides). Aparte de
sus similitudes en el polen y el nombre común, los dos néctares no tienen la misma composición química, ya
que el néctar de kanuka no contiene ningún DHA (Adams et al., 2009), lo que hace que la miel de kanuka esté
libre de MGO.

4. ¿Qué técnica analítica proponen los autores utilizar para caracterizar la miel manuka?
Un artículo anterior de nuestro equipo sobre la aplicación general de los perfiles de RMN para las pruebas de
autenticidad de miel (Spiteri et al., 2015) mostró su capacidad para detectar simultáneamente la adición de
jarabe de azúcar y las discrepancias de calidad misceláneas, como el sobrecalentamiento o la fermentación.
Presentamos aquí un trabajo integral en un gran conjunto de mieles provenientes de Oceanía, utilizando el
análisis de 1 H NMR, que muestra que esta tecnología se puede usar como un método conveniente para
caracterizar mieles monoflorales de esta parte del mundo, calificar y cuantificar el Miel de manuka mono-floral
versus otros tipos florales.

5. ¿De dónde se obtuvieron las muestras y los estándares?


Se recolectaron 264 muestras de miel auténticas de Nueva Zelanda (254) y Australia Gresley et al., 2012. El
etiquetado de las muestras se basó en el análisis de polen, pruebas físicas y organolépticas e información
sobre el cuidador de abejas. Las muestras fueron etiquetadas como provenientes de varios orígenes
botánicos, entre ellos manuka (Leptospermum scoparium) y kanuka (Kunzea ericoides), pero también kamahi
(Weinmannia racemosa), pohutukawa (Metrosideros excelsa), trébol (Trifolium repens), pohutukawa
(Metrosideros excelsa), trébol (Trifolium repens)), y varias mieles etiquetadas como multiflorales. Los
estándares de 1,3-dihidroxiacetona (DHA, pureza> 97%) y metilglioxal (MGO, solución al 40% en H2O) se
adquirieron de Sigma-Aldrich

6. ¿Cómo se prepararon las muestras de miel antes del análisis?


Para la preparación de la RMN, el procedimiento se adaptó de Ohmenhaeuser, Monakhova, Kuballa y
Lachenmeier (2013). La miel debe ser líquida y homogénea antes de su preparación. Todas las muestras de
miel se agitaron durante unos 30 s antes del muestreo para asegurar una mezcla homogénea. Si la miel no
era líquida, se colocó en un horno a 50 ° C durante 2 h, hasta que se disolvieron todos los cristales; luego, la
miel se enfrió colocando muestras en un baño de agua a 20 ° C. El contenido de humedad se obtuvo para
cada miel según el método "Determinación de la humedad, método refractométrico" (International Honey
Commission, 2009). Se pesaron exactamente 200 mg de miel sin humedad (correspondiente a
aproximadamente 240 mg de una muestra de miel con aproximadamente 20% de agua) y se combinaron con
300 l de tampón de RMN. La solución de tampón de RMN se preparó utilizando 10,21 g de KH2PO4 (Sigma-
Aldrich, pureza> 99,5%) y 9,8 mg de azida de sodio (NaN3, Sigma-Aldrich, pureza> 99%) disueltos en 50 ml
de agua pura. El pH se ajustó a 4,5 con H3PO4 al 85% (Sigma-Aldrich) o NaOH 5 M (preparado disolviendo
200 g de gránulos de NaOH Riedel-de Haën en 1 l de agua pura). Luego se agregaron 700 litros de agua
ultrapura tipo I y 100 litros de la solución de bloqueo de RMN. La solución de bloqueo de RMN se preparó
combinando 50 mg de propionato de trimetilsililo (TSP, Sigma-Aldrich, pureza> 98%) disuelto en 50 ml de D2O
(Sigma-Aldrich, pureza> 99.8%).

7. ¿Qué otra técnica analítica fue utilizada en el análisis?


Método LC-TOF
Para los análisis LC-TOF, 26 de las 264 muestras se prepararon utilizando el método QuEChERS (Quick Easy
Cheap Efficient Rugged and Safe) (Lehotay, 2007) basado en Cotton et al. (2014) utilizando MgSO4 anhidro
(Sigma-Aldrich, pureza P99.5%) y NaCH3COO (Sigma-Aldrich, pureza P99.0%) como sales. Los extractos
finales en agua / metanol 90/10 (Sigma-Aldrich, ultra chromasolv) se analizaron mediante UPLC-TOF-MS en
un Xevo G2-S TOF (Waters, Manchester, Reino Unido) equipado con un Acquity I Class UPLC (Waters,
Manchester, REINO UNIDO). Los análisis se llevaron a cabo utilizando ionización por electropulverización
positiva. La resolución de la masa fue de 30.000 FWHM en masa de leucina encefalina (556.2771 Da) en
modo de ionización positiva. Los ajustes instrumentales fueron: fuente capilar 1 kV, cono de muestreo 20,
fuente offset 80, temperatura de fuente 120 C, temperatura de desolvatación 550 C, flujo de conegas 50 L / h,
flujo de gas de desolvatación 1000 L / h, rango dinámico extendido, rango de adquisición 50– 1000 Da, tiempo
de escaneo 0.2 s, modo centroide, energía de colisión 4 eV. El valor de masa se corrigió continuamente
utilizando una solución de leucina encefalina a 1 ng / ml (Sigma-Aldrich, pureza> 95%). La separación
cromatográfica se logró con una columna BEH C18 de 1.7 lm, 2.1 mm, 100 mm (Waters, Manchester, Reino
Unido) utilizando un gradiente lineal de metanol del 2% al 100% con NH4CH3COOH 5 mM (Sigma-Aldrich,
pureza P99.0%) y 0,02% de ácido fórmico (Fisher Chemical, grado Optima LC / MS) durante 14 minutos (la
otra fase fue agua con los mismos aditivos). El flujo de elución se estableció en 0,45 ml / min y la temperatura
de la columna se mantuvo a 45 ° C. Los archivos de datos se adquirieron con el software MassLynx versión
4.1 (Waters, Manchester, Reino Unido).

8. ¿Cuáles fueron los resultados obtenidos?


La RMN permite la cuantificación simultánea de ambas moléculas. Esto podría servir como un primer control
para el origen botánico, y el contenido de MGO también confirma las afirmaciones de la etiqueta y proporciona
a los consumidores una correlación directa de la capacidad antiséptica. Sin embargo, estas moléculas pueden
comprarse individualmente a proveedores químicos y podrían agregarse fraudulentamente a miel más común
y más barata para producir miel de manuka falsa. Por lo tanto, se investigaron otras señales para proporcionar
una confirmación de la evaluación. Se encontró que el ácido feniláctico es común tanto para manuka como
para kanuka, como ya se mencionó por Stephens et al. (2010). Para mejorar la selección de la señal, se
calcularon los coeficientes de correlación entre las proporciones asociadas con la señal DHA y la intensidad
de cada variable en los espectros.
La RMN nos permitió observar y detectar un marcador (aún no identificado) para este tipo floral (Fig. 5) y, por
lo tanto, detectar mezclas de esta fuente con otras mieles, especialmente manuka puro. Otra observación
notable sobre el uso de los perfiles de RMN fue la clara discriminación entre la miel de manuka procedente de
Australia y Nueva Zelanda, debido a las señales coexistentes en el primero que se identificaron como
marcadores de mieles de eucalipto. Aunque Nueva Zelanda no puede importar miel para mezclar, esta sería
una aplicación útil para evitar que la miel de Nueva Zelanda se mezcle con miel australiana y se etiquete de
manera fraudulenta como Hecho en Nueva Zelanda.

9. ¿Qué concluyen los autores?


Este estudio utilizó los perfiles de RMN de protones como una forma conveniente de caracterizar los
honorarios monoflorales específicos de Nueva Zelanda y Australia (especialmente la miel de manuka), sin la
necesidad de otras técnicas analíticas que consumen más tiempo, como el análisis de polen. La RMN se usó
como un método de detección rápido y de bajo costo para identificar y cuantificar tres marcadores conocidos
de miel de manuka: DHA, MGO (Donarski, Roberts y Charlton, 2010) y, por primera vez, mediante RMN,
leptosperina. A pesar de una gran variabilidad en las concentraciones observadas, el uso simultáneo de estos
tres compuestos en un modelo estadístico permite confirmar la presencia de la miel de "Leptospermum
scoparium", pero también para diferenciar "manuka puro". De las mezclas. Además, demostramos que otros
orígenes botánicos típicos de Nueva Zelanda también pueden identificarse por este método. A diferencia de
los enfoques analíticos convencionales, estos parámetros y más información acerca de la adulteración
potencial (Spiteri et al., 2015) se pueden obtener a través de un análisis único, rápido y de bajo costo. Por lo
tanto, el perfil 1H NMR parece ser una herramienta analítica muy conveniente para una prueba de detección
completa y eficiente para controlar la integridad de la miel de Nueva Zelanda.

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