Pembuatan Tissue Plasminogen Activator (tPA)

1.1 Pengenalan tentang tPA

Tissue Plasminogen Aktivator (disingkat tPA atau PLAT) merupakan protein yang
bertanggung jawab pada pemecahan bekuan darah. Protein ini merupakan serine protease yang
terdapat dalam sel endotel, sel yang mengelilingi pembuluh darah. Sebagai sebuah enzim, tPA
mengkatalisis perubahan plasminogen menjadi plasmin, enzim yang memecah bekuan darah.
Karena enzim ini bekerja pada sistem pembekuan darah, sehingga sering digunakan dalam
pengobatan stroke trombogenik atau embolik, tetapi dikontraindikasikan pada stroke
hemoragik. Obat ini adalah obat intravena atau IV yang biasanya diberikan melalui kateter yang
dimasukkan ke pembuluh darah di lengan.

Gambar 1.1 Cara kerja tPA

Dalam pembuatan obat-obatan, mempertimbangkan produksi aktivator plasminogen, yang
merupakan enzim yang kuat yang memicu proteolitik atau kelompok enzim yang mampu
memecah rantai panjang molekul protein menjadi molekul-molekul yang lebih kecil disebut
peptida (peptides) dan bahkan sampai menjadi komponen-komponen terkecil penyusun protein
yang disebut Asam Amino (Amino Acid), degradasi pembekuan darah yang menyebabkan stroke
dan serangan jantung.
Sejak pertengahan 1980-an, Genentech, perusahaan AS, telah diproduksi aktivator
plasminogen jaringan (TPA), yang mereka dijual seharga $2.000 per dosis 100 mg pada awal tahun
2000, dengan penjualan tahunan sebesar $ 300 MM / yr dosis 100 mg pada awal tahun 2000,
dengan penjualan tahunan sebesar $ 300 MM / yr dosis 100 mg pada awal tahun 2000, dengan
penjualan tahunan sebesar $ 300 MM / yr (MM dalam satuan rekayasa Amerika adalah ribu-ribu,
atau 1 juta). Mengingat bahwa paten mereka ditetapkan untuk berakhir pada tahun 2003,
Genentech mengembangkan generasi berikutnya, Food and Drug Administration (FDA) yang
disetujui, plasminogen activator disebut TNK-tPA, yang lebih mudah dan lebih aman bagi dokter
untuk menggunakan. Dengan pasar yang berkembang pesat, muncul pertanyaan apakah
kesempatan ada untuk perusahaan lain untuk memproduksi generik (yaitu, tanpa merek) bentuk
tPA yang bisa bersaing baik dengan TNK-tPA. Untuk menguji kemungkinan ini, tim desain
mengidentifikasi dua alternatif potensial :
1. Alternatif pertama
Generik tPA yang dibuat mungkin kurang dapat bersaing dengan TNK-tPA di Amerika
Serikat, memiliki harga jual yang rendah yaitu hanya dengan $200 / dosis, tetapi dapat
mengakibatkan peningkatan risiko pendarahan. Analisis pasar menyarankan bahwa tingkat
produksi meningkat hingga 80 kg/tahun untuk memenuhi kebutuhan lima tahun ke depan.
2. Alternatif kedua
Adanya kemungkinan bahwa penggantian biaya perawatan kesehatan yang lebih rendah,
akan diterima oleh rumah sakit di Amerika Serikat, maka mungkin masuk akal untuk
mengembangkan proses serupa yang bersaing secara menguntungkan dengan TNK-tPA di
Amerika Serikat.
Namun, seiring perkembangan penelitian terhadap pembuatan tPA, bukan tidak mungkin
alternatif lainnya dapat muncul. (tPA) adalah protein terapi rekombinan yang terdiri dari 562 asam
amino. Berikut strukturnya :

Gambar 1.1 Skema tPA

 Gambar 1.3 Struktur kimia tPA
Untuk menghilangkan bekuan darah, tPA mengaktifkan plasminogen menjadi plasmin, suatu
enzim, yang melarutkan formasi fibrin yang menahan bekuan darah di tempatnya. Dengan cara
ini, aliran darah dibangun kembali setelah penyumbatan gumpalan larut, efek penting bagi pasien
yang menderita serangan jantung (infark mikro) atau stroke. Contoh ini menunjukkan langkah-
langkah dalam mensintesis proses untuk mengatasi tantangan yang ditimbulkan oleh peluang yang
disarankan dalam alternatif 1: yaitu, untuk memproduksi bentuk-bentuk tPA yang lebih murah
yang dapat dijual seharga $200 per dosis 100 mg. Perhatikan bahwa ini mengarah ke proses batch
yang melibatkan banyak proses kecil yang harus dijadwalkan untuk pembuatan tPA, daripada
proses kontinu skala besar seperti untuk pembuatan vinil klorida.
1.2 Proses Sintesis tPA
tPA diproduksi menggunakan sel mamalia [mis., Ovarium hamster Cina (CHO)] yang
memiliki tPA-DNA sebagai bagian dari konten genetik (genom) mereka. Dalam operasi bioreaksi
aerob, sel tPA-CHO tumbuh dalam media nutrisi, HyQ PF-CHO— Hyclonemedia,
ablendofnutrients, garam (termasuk NaHCO3), asam amino, insulin, faktor pertumbuhan, dan
transferrin, khusus untuk pertumbuhan sel CHO.Bahan lainnya termasuk air steril, udara, dan CO2.
Selain tPA, endotoksin dapat menjadi kontaminan produk, yang harus dihilangkan karena
menimbulkan berbagai respons inflamasi pada hewan. Produk sampingan lainnya termasuk debris
sel, air limbah, dan emisi gas, terutama N2 dari udara, O2 yang tidak dikonsumsi dari udara, dan
CO2, yang mengatur pH. Sumber data penting, selain yang diambil di laboratorium biokimia,
adalah paten A.S., yang diajukan oleh Genentech (Goeddeletal., 1988), yang memberikan
informasi kualitatif dan kuantitatif yang cukup besar. Lihat juga laporan desain oleh Audette et al.
(2000).
Langkah Pertama : Hilangkan Perbedaan Jenis Molekuler
Dalam pembuatan makromolekul seperti tPA melalui pertumbuhan sel, serangkaian reaksi
kimia yang kompleks sering digunakan, daripada reaksi yang didefinisikan dengan baik untuk
pembuatan monomer sederhana, seperti vinil klorida. Umumnya, untuk membuat tPA, dua jalur
reaksi utama disediakan oleh ahli biokimia, sebagai berikut :
1. Sel mamalia
Ke dalam sel CHO, urutan tPA-DNA harus dimasukkan dan diekspresikan. Sel-sel tPA-
CHO yang dihasilkan adalah sel-sel CHO yang dipilih secara khusus dengan banyak salinan tPA-
DNA yang dimasukkan ke dalam genomnya, dan yang menghasilkan tPA tingkat tinggi. Langkah
penyisipan tPA-DNA ini diringkas dalam reaksi :
tPA−DNA sequence + CHO cells → selected high-expressing tPA − CHO cells
Produk nya berupa setumpuk sel-TPA, yang disiapkan untuk laboratorium dan disimpan dalam
wadah pada suhu -70∘ dilakukan dengan okulasi untuk bioreaksi :
tPA−CHO cells + HyQPF−CHO media + O2 → peningkatan jumlah sel
Seperti sel-sel tumbuh dalam budidaya aerobik ini pada tingkat 0,39 × 106 sel / ( ml-hari),
oksigen dari udara dikonsumsi pada tingkat 0,2 x 1012 mol O 2 / ( sel-hr) dan tPA diproduksi pada
tingkat 50 picogram tPA / ( sel-hari). Yang terakhir ini disekresikan secara bertahap ke dalam
larutan media yang cair.

Gambar 1.4 Operasi reaksi menggunakan sel mamalia

2. Sel bakteri
Adalah dengan memasukkan urutan tPA-DNA ke dalam genom Escherichia coli (E. coli)
sel, seperti yang dirangkum oleh reaksi:
tPA - urutan DNA + E.coli seltPA - urutan DNA → selected high−expressing tPA − E.
coli cells
Kemudian, tPA E. coli sel bakteri, yang tumbuh di laboratorium, dibekukan di dalam wadah pada
suhu -70∘C untuk digunakan sebagai inokulum untuk reaksi fermentasi:

tPA - E. coli sel + Media bubuktPA + HAI 2 → peningkatan jumlah sel

Sebuah fermentasi batch tPA E. coli dapat menghasilkan 5-50 mg tPA / L- kaldu. Escherichia
coli mungkin saja terdapat kesulitan untuk melepaskan tPA, yang kemudian lebih sulit untuk
memisahkan dan harus melalui proses sintesis. Tidak seperti sel CHO, E. coli tidak menambahkan
kelompok gula (glikosilasi) ke TPA. Seperti sel-sel CHO, tPA E. coli Sel-sel yang diproduksi,
beku selama penelitian dan pengembangan fase.

Langkah Kedua : Distribusi Kimia

Pada langkah ini, sumber-sumber dan media untuk setiap spesies pada Gambar 1.4 dilakukan
perhitungan sehingga laju aliran massa input reaksi sama dengan laju aliran massa keluar. Hal ini
sering memerlukan pengenalan operasi pencampuran, seperti digambarkan dalam contoh
sebelumnya untuk vinil klorida. Operasi pencampuran yang dapat digunakan yaitu, di mana media
bubuk HyQ PF-CHO dicampur dengan air, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1.5.

Gambar 1.5 Flowsheet menunjukkan distribusi bahan kimia untuk proses tPA
Langkah Ketiga : Mengeliminasi Komposisi yang berbeda
Untuk sebagian besar distribusi bahan kimia, perbedaan komposisi ada di antara aliran yang
keluaran sebagai produk dari hasil reaksi. Pada Gambar 1.5, limbah dari pertumbuhan sel produksi
tPA harus dipisahkan. Ada banyak kemungkinan sistem pemisahan, dengan satunya yaitu pada
Gambar 1.6. Perhatikan bahwa karena protein kehilangan aktivitasnya pada suhu di atas ∼0∘C,
proses centrifuge, dan semua operasi persiapan lainnya, dioperasikan pada suhu 4oC.

Gambar 1.6 Flowsheet operasi pemisahan untuk proses produksi tPA

Langkah Keempat : Mengeliminasi perbedaan suhu, tekanan dan fasa
Dalam pembuatan tPA, bahan diasumsikan untuk tersedia pada 20∘C, air dicampur dengan
media bubuk HYQ PF-CHO di 4∘C, budidaya (operasi produksi sel) terjadi pada 37∘C, dan
pemisahan terjadi pada 4∘C. Panas eksotermik dari kultivasi dihilangkan pada suhu 37∘C. Hanya
tekanan kecil yang dapat berubah dan dapat diproyeksikan pada tahap sintesis proses ini. Demikian
pula, tidak ada operasi perubahan fase yang ditambahkan ke lembar alur. Oleh karena itu, hanya
beberapa operasi perubahan suhu yang ditambahkan pada Gambar 1.6, dengan flowsheet yang
dihasilkan pada Gambar 1.7.
 Gambar 1.7 Flowsheet dengan operasi perubahan suhu dalam proses tPA
Langkah Kelima : Task Integration
Pada tahap ini berbagai item peralatan dipilih, dengan menggabungkan dua operasi yang
berdekatan menjadi item peralatan tunggal; yaitu, dalam task integration. Kondisi yang harus
diperhatikan pertama adalah kondisi operasi, apakah dalam mode kontinu atau batch. Untuk skala
kecil, seperti 80 kg/tahun, hampir selalu menggunakan metode batch. Pilihan ukuran batch dan
peralatan, dan waktu batch, biasanya didasarkan pada operasi yang paling lambat, biasanya proses
penanaman (atau fermentasi). Lebih lanjut, ditentukan dengan menggunakan tingkat pertumbuhan
eksperimental sel TPA-CHO [0,39 × 106sel ∕ (mL-hari)], konsentrasi sel inlet dan outlet, dan
tingkat eksperimental pertumbuhan tPA [50 pg tPA ∕ (hari-sel)], di mana pg ≡ pikogram ≡ 10-12 g.