UNIVERSIDAD DEL CAUCA

Ingeniería agroindustrial
Laboratorio de biotecnología
II Periodo 2018

EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO DE BC 126 DETERMINANDO SU

CALIDAD CON ELECTROFORESIS Y POSTERIORMENTE IDENTIFICADO
CON BASES DE DATOS GENÓMICAS.
Diego Fernando Casas. Cristhian Castaño. Francisco Bolaños. Sara Becerra.

INTRODUCCIÓN
El ácido desoxirribonucleico o ADN, es
el ácido nucleico que contiene las
instrucciones genéticas usadas en el
desarrollo y funcionamiento de todos
los organismos vivos conocidos y
algunos virus, y es responsable de su
transmisión hereditaria. El papel
principal de la molécula de ADN es el
almacenamiento a largo plazo de la
información. Desde el punto de vista
químico, el ADN es un polímero de
nucleótidos (polinucleótido).
Cada nucleótido está formado por la
desoxirribosa, una base nitrogenada que
puede ser adenina (A), timina(T),
citosina (C) o guanina (G) y un grupo
fosfato. La disposición secuencial de
estas cuatro bases a lo largo de la
cadena es la que codifica la información
genética. El ADN se presenta como una
doble cadena de nucleótidos, en la que
las dos hebras están unidas.
La microbiología molecular nos ayuda a
la caracterización de bacterias
desconocidas aisladas y de comunidades
microbianas. El ADN genómico se
refiere a todo el ADN presente en la
célula de un organismo. Para llevar a
cabo la extracción del ADN genómico
se utilizan técnicas moleculares, las
cuales se pueden utilizar para
caracterizar, aislar y manipular
componentes celulares.
Algunos ejemplos de estas técnicas
moleculares son: Reacción en cadena de
polimerasa (PCR) y Geles de
electroforesis.1 La extracción consiste
en el aislamiento y purificación de
moléculas de ADN y se basa en las
características fisicoquímicas de la
molécula.
El proceso de extracción por CTAB
permite tener mayor rendimiento de
ADN, combina procesos de lisis celular
que consiste en la acción de un
detergente aniónico para romper la
pared celular. Luego de esto se da la
eliminación de proteína y lípidos
mediante solventes orgánicos y ciclos
de centrifugación. Después se precipita
el ADN, para ello se adiciona etanol y
soluciones con alta concentraciones de
iones de sodio que se unen al grupo
fosfato y por último, la Purificación.
Estos dan como resultado variaciones
en concentración y calidad del ADN
extraído.2
Para poder visualizar el ADN debemos
recurrir a los geles de Agarosa. Una vez
extraído el ADN o hecha una reacción
de PCR debemos verificar que el ADN
está allí. La electroforesis en gel es una
técnica utilizada para separar
fragmentos de ADN (u otras
macromoléculas, como ARN y
proteínas) por su tamaño y carga. La
electroforesis consiste en aplicar una
 UNIVERSIDAD DEL CAUCA
Ingeniería agroindustrial
Laboratorio de biotecnología
II Periodo 2018

corriente a través de un gel que contiene herramientas y servicios para el análisis

las moléculas de interés. Con base en su de secuencias de genes.
tamaño y carga, las moléculas se
desplazarán por el gel en diferentes RESULTADOS
direcciones o a distintas velocidades,
con lo que se separan unas de otras. Con  Extracción de ADN
la ayuda de la electroforesis en gel de
Se describen resultados obtenidos por
agarosa se ha demostrado que es una
cinco grupos de trabajo, los cuales
forma eficiente y efectiva de separar siguen el mismo protocolo de
ácidos nucleicos. La alta resistencia del extracción CTAB y metodología de
gel de agarosa permite el manejo de trabajo, difiriendo en la cepa utilizada
geles de bajo porcentaje para la para el análisis. Los grupos 1,2 y 3
separación de grandes fragmentos de utilizaron cepa BAC-126 y los grupos 4
ADN.3 y 5 utilizaron cepa BAC-235.
Los datos de la secuenciación de ADN A continuación, se ilustran resultados
tienen un valor útil biológicamente, por obtenidos por el grupo 3, en etapas
lo que la bioinformática pasa a ser una previas al resultado final de la
etapa básica de la secuenciación del extracción de ADN como se observa en
ADN. La bioinformática es una la imagen 1,2, y 3.
herramienta que ha surgido a través de
la utilización tecnológica de la Imagen 1. Extracción por solventes.
información, para garantizar un análisis
adecuado y obtener una distribución de
la información biológica con la
finalidad de responder preguntas
complejas de carácter biológico, una
vez se ha establecido que el ADN es de
calidad se analiza las secuencias por
medio de la bioinformática, esta se basa
en el análisis de datos biológicos por
medio de herramientas
computacionales. Una de las bases de
datos más importantes en
almacenamiento y procesamiento es el
Centro Nacional para la Información Imagen 2. Ácidos nucleicos, proteínas y
Biotecnológica (NCBI) que se compone residuos.
de resultados de datos experimentales
publicados en todo el mundo.4

Por otra parte, el programa BioEdit es

uno de los programas más empleados en
estudios de biología molecular,
funciona como un editor que alinea mis
secuencias.5 Las secuencias alineadas se
suben a Ribosomal Database Project
(RDP) que proporciona datos,
 UNIVERSIDAD DEL CAUCA
Ingeniería agroindustrial
Laboratorio de biotecnología
II Periodo 2018

Imagen 3. Ácidos nucleicos

Imagen 5. Precipitado ADN, cepa BAC 126

La etapa final del protocolo corresponde

a la obtención visual de fragmentos de
ADN, representados por la formación
de un precipitado en la muestra. El
grupo 3 no registro presencia de esta
característica como se muestra en la
imagen 4.
Imagen 4. Ausencia de precipitado de
ADN, CEPA BAC-126.
Los resultados de los grupos 4 y 5,
aunque analizaron una cepa diferente
(BAC-235), son similares a los descritos
para el grupo 3, puesto que al finalizar
todo el protocolo no se observó
definidamente la formación de
precipitado de ADN.

 Electroforesis

Previamente se realizó la extracción de

ADN, como se describió anteriormente,
el posterior tratamiento que se le dio a
las muestras obtenidas fue someterlas a
electroforesis donde se verifica la
presencia de ADN.

Los resultados de los cinco grupos se

Respecto a los grupos 1 y 2
participantes en la extracción, sus
resultados obtenidos en la etapa final, se
observan en la imagen 5, donde si se
aprecia la formación de precipitado de
ADN, a través de una pequeña especie
de bola algodonosa.
presentan en la imagen 6, donde se
observa que las muestras provenientes
de la cepa BAC-126 presentan banda
fluorescente en los grupos, 1 y 2, y sin
presencia de banda en el grupo 3. Las
muestras provenientes de la cepa BAC-
235 no presentan bandas fluorescentes
en ninguno de los dos grupos.
 UNIVERSIDAD DEL CAUCA
Ingeniería agroindustrial
Laboratorio de biotecnología
II Periodo 2018
Imagen 6. Resultado de electroforesis para
todos los grupos.
 Análisis de secuencias
Una vez el ADN ha sido purificado,
cuantificado y analizado mediante
electroforesis, se procede a la
secuenciación del ADN, la información
obtenida de este proceso es utilizada
para un análisis de datos biológicos, los
resultados para este análisis
corresponden a una serie de 12
secuencias.
Las secuencias fueron comparadas con
el Centro Nacional para la Información
Biotecnológica (NCBI) y Ribosomal
Database Project (RDP), como se
describe en el anexo 1.
La comparación de secuencias permitió
hacer una descripción filogénica, para
determinar la clasificación de las cepas
analizadas, como se observa en el anexo
2 a través de un árbol filogenético; que
se desarrolló haciendo uso de un
programa tecnológico conocido como
MEGA 5.2, este programa nos permite
realizar análisis moleculares
relacionados con filogenia,
proporcionando herramientas para
explorar y analizar secuencias, de
proteínas o nucleótidos, con
perspectivas evolutivas.
ANALISIS DE RESULTADOS
 Extracción de ADN
Las cepas BAC 126 de los grupos 1 y 2
presentaron estructura fibrilar visible,
en forma sólida y de color blanco como
se observa en la imagen 5, mientras que
en el grupo 3 no se observó ningún
precipitado con esta bacteria, esto puede
atribuirse a la purificación del ADN
después de la separación de los ácidos
nucleicos de las proteínas y lípidos,
puesto que en la purificación puede que
hayan quedado restos de solventes
orgánicos y esto haya contaminado la
muestra.
El cloroformo desnaturaliza las
proteínas y facilita la separación de las
fases acuosa y orgánica. La fase acuosa
suele constituir la fase superior. No
obstante, si el pH de la solución acuosa
no se ha equilibrado debidamente (pH
7,8 – 8,0), los ácidos nucleicos tenderán
a repartirse en la fase orgánica, esto
infiere directamente en los resultados
puesto que se tendría que hacer la
extracción con cloroformo dos o tres
veces más para que pudiera eliminar por
completo las impurezas de la capa
acuosa.6
Además, también se pudo alterar la
concentración iónica lo que conllevaría
a que el CTAB formara complejos con
las proteínas y polisacáridos,
ocasionando la ausencia de
precipitación de los ácidos nucleicos7,
puesto que el CTAB es un agente
quelante de iones metálicos como Ca++
y Mg++ inhibe la acción de las
nucleasas al no haber cofactores libres
para su actividad y así protege al ADN.8
También, puesto que estos métodos son
susceptibles de contaminación,
variación y errores por múltiples pasos
 UNIVERSIDAD DEL CAUCA
Ingeniería agroindustrial
Laboratorio de biotecnología
II Periodo 2018
en la manipulación, la operación en
cada uno de estos pasos debe realizarse
cuidadosamente puesto que algún error
por parte del operario altera la
extracción y aumenta la posibilidad de
contaminación del ADN.
 Electroforesis
La eficacia de la extracción del ADN
fue verificada mediante la
fragmentación por electroforesis, el
éxito de esta depende de la obtención de
fragmentos íntegros del ADN, lo cual
representa la presencia visible de
bandas fluorescentes como se observo
en la imagen 6, específicamente para el
grupo 2 y 1 que utilizaron la cepa BAC
-126, esta visualización hace referencia
a la separación por fragmentos del ADN
por su tamaño y carga, dado que la
fuerza impulsora es proporcional a la
carga eléctrica, el parámetro que rige el
avance (aceleración = fuerza/masa) es
realmente la relación carga/masa. Para
un ácido nucleico, la carga eléctrica es
proporcional a la longitud en
nucleótidos, por lo que la relación es la
misma para todas las moléculas, por lo
que las moléculas se desplazaran en
diferentes velocidades, la posición de
estas se comparan con un marcador de
peso molecular , que corresponde a un
estándar de referencia que contiene
fragmentos de ADN de longitudes
conocías, esto marcara un intervalo de
tamaño que hace referencia al número
de pares de bases correspondientes para
cada fragmento según los resultados se
aprecia que los fragmentos visualizados
son de gran tamaño puesto que no se
desplazaron consideradamente, esto se
relaciona a su vez con los grupos
fosfato que otorgan carga negativa a las
moléculas de ADN las cuales
comienzan a moverse a través de la
matriz del gel hacia el polo positivo, lo
cual se realiza de forma lenta y sin
mayor desplazamiento lo que se puede
atribuir al coeficiente de fricción el cual
mide la resistencia intrínseca, como ya
se mencionó siendo estas esencialmente
su forma y su tamaño.
El ADN del grupo 2 que se encuentra
ubicado en la parte superior de la
imagen 6 se puede observar que esta
disperso y no se encuentra definido
como una sola banda, esto conlleva a
analizar que la extracción no fue buena,
debido a que los tamaños del ADN no
son uniformes y por ende da como
resultado la electroforesis así.
En el caso contrario los resultados de
los grupos 3,4 y 5 no representaron
bandas visibles; hay diversos factores
que se deben tener en cuenta a la hora
de llevar a cabo este proceso, los cuales
pueden influir sobre la distribución y
migración a través del gel de agarosa,
como son el tamaño del ADN (a mayor
tamaño de la molécula generalmente
migra lentamente), como también la
concentración de la agarosa,
conformación del ADN, voltaje
aplicado, la dirección del campo
eléctrico, composición de las bases y
temperatura, la composición del buffer
de electroforesis, pero la mayor
influencia que se tiene al obtener
resultados nulos, es decir no observar
definidamente la presencia de bandas
fluorescentes, es la extracción
incompleta de ADN, resultado de
deficiencias o alteraciones en el
protocolo de extracción .
 Análisis de secuencias
El árbol filogenético representa las
relaciones evolutivas entre organismos,
siendo el patrón filogenético como las
especies u otros grupos evolucionaron a
 UNIVERSIDAD DEL CAUCA
Ingeniería agroindustrial
Laboratorio de biotecnología
II Periodo 2018
partir de unos ancestros comunes. Las
especies están más relacionadas si tiene
un ancestro común mas reciente y
menos relacionada si tienen un ancestro
común menos reciente.
La raíz del árbol es el nodo ancestral
que se tiene en común y las puntas de
las ramas representan los terminales o
los descendientes de la rama principal.
En el árbol filogénico (anexo 2) se
puede observar las especies más
relacionadas entre sí, son las secuencias
de la 6 a la 12 ya que tienen ancestros
comunes cercanos aunque la 6 este más
relacionada con la 7, que con la 12 pero
son del genero bacillus. En cambio, si
se relacionan con las secuencias de la 1
y 2, se encuentran muy alejadas ya que
solamente cuentan con un ancestro en
común. Las secuencias 4 y 5 son
especies que se encuentran muy
relacionadas debido a que cuentan con
un ancestro muy cercano pero al ser
relacionadas con la 1 y 2 su ancestro
común se encuentra lejano y aun más si
se relaciona con las secuencias de la 6 a
la 12.
Referente al anexo 1 se puede observar
la comparación entre ambas tablas, las
cuales hacen referencia a las dos
diferentes bases de datos, se puede
observar la similitud que hay en casi su
totalidad de las especies por secuencia,
teniendo cada una de ellas un porcentaje
alto de similitud con las bases de datos.
CONCLUCIONES
 Las condiciones por el método
CTAB fueron optimas para la cepa
BAC 126, debido que se logro ver el
precipitado de ADN, mientras que la
BAC 235 no se logro observar el
precipitado por fallos del protocolo
o por no ser el adecuado para esta
cepa.
 La definición de la banda en la
electroforesis dependen de la
extracción del ADN, si este fue
extraído integro, se lograra observar
la banda completa.
 La extracción de ADN se debe hacer
rigurosamente debido a que fallos
experimentales en cualquier paso
repercuten directamente en la
obtención del ADN.
 La electroforesis es el paso que
define si hubo una buena extracción
y por consiguiente permite realizar
la amplificación de este ADN
extraído.
 La elaboración de un árbol
filogenético permite organizar y
diferenciar las especies y géneros
basándose de un ancestro común y
como se divide a partir de este.
BIBLIOGRAFIA
[1] Universidad de Puerto Rico,
departamento de biología. Laboratorio
de microbiología general.
[2] L. J. F. Nodarse, L. J.
Rodríguez, L. O. Fuentes, L. M. Castex,
and L. A. Fernández-, “Comparación
entre 5 métodos para la extracción de
ADN de triatomíneos: su utilización en
la técnica de ADN polimórfico
amplificado al azar,” p. 6.
[3] P. Y. LEE, J. COSTUMBRADO,
C.Y. HSU, , Y. H. KIM. Electroforesis
en gel de agarosa para la separación de
los fragmentos de ADN. Department of
Molecular, Cell, and Developmental
Biology, University of California Los
Angeles. 2012.
[4] W. J. Diniz and F. Canduri,
“REVIEW-ARTICLE Bioinformatics:
 UNIVERSIDAD DEL CAUCA
Ingeniería agroindustrial
Laboratorio de biotecnología
II Periodo 2018

an overview and its applications,”

Genet. Mol. Res., vol. 16, Mar. 2017

(5) Velasco M. Reinaldo, Marcadores

moleculares y la Extracion de ADN.
Pag 3.

[6] Extracción y purificación de ácidos

nucleicos, Universidad de Santiago de
Chile.

[7]https://es.khanacademy.org/science/b
iology/biotech-dna-technology/dna

[8] J. E. Angel, E. G. Hernandez, N. A.

Herrera, L. Y. Gomez, Angela Patricia
Castro, A. M. Sepulveda, and E. E.
Ebratt, “Comparison of dna extraction
methods for detection of citrus
huanglongbing in colombia,” Agron.
Colomb. Vol. 32, num. 1 (2014); 7-13.
 UNIVERSIDAD DEL CAUCA
Ingeniería agroindustrial
Laboratorio de biotecnología
II Periodo 2018

ANEXO 1

Secuencia Nombre Identificación %ID Base de datos

Leuconostoc mesenteroides; BW2. 99
1 001_27F RDP
Leuconostoc mesenteroides; Wikim SH006. 99,4
Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum; qz-534. 100
2 002_27F RDP
Leuconostoc mesenteroides; TW53-2. 100
Weissella sp. KLDS 7.0701. 99,6
3 003_27F RDP
Weissella cibaria; DH8. 99,6
Weissella cibaria; HN79. 100
4 004_27F RDP
Weissella sp. L12. 100
Bacillus sp. clon de cultivo de enriquecimiento SYW15. 98,8
5 009_27F RDP
Bacillus sp. clon de cultivo de enriquecimiento SYW18 98,8
Bacillus methylotrophicus; Ks3-11. 100
6 010_27F RDP
Bacillus methylotrophicus; L09. 100
Bacillus amyloliquefaciens; Ba-74501. 99,2
7 011_27F RDP
Bacillus amyloliquefaciens; 261. 99,2
Bacillus methylotrophicus; Nt6-36. 99
8 012_27F RDP
Bacillus methylotrophicus; Kt8-11. 99,3
Bacillus vallismortis; WA5-12. 96,2
9 017_27F RDP
Bacillus methylotrophicus; Mo-Bm-11. 96,2
Bacillus sp. EGY-WCD3. 100
10 019_27F RDP
Bacillus subtilis; PPL-SC7. 99,6
Bacillus amyloliquefaciens; Ba-74501. 99,5
11 020_27F RDP
Bacillus amyloliquefaciens; 261. 99,5
Bacillus amyloliquefaciens; Ba-74501. 99,2
12 021_27F RDP
Bacillus methylotrophicus; R11. 99,4

Secuencia Nombre Identificación %ID Base de datos

1 001_27F Leuconostoc mesenteroides; Wikim SH006. 99 NCBI
2 002_27F Leuconostoc mesenteroides; SM3. 100 NCBI
3 003_27F Weissella cibaria; DH8. 100 NCBI
4 004_27F Weissella cibaria; zy-F2. 100 NCBI
5 009_27F Bacillus sp. N5/665. 99 NCBI
6 010_27F Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum L09. 100 NCBI
7 011_27F Bacillus amyloliquefaciens; BK7. 99 NCBI
8 012_27F Bacillus methylotrophicus; Psn214. 99 NCBI
9 017_27F Bacillus vallismortisñ; BV23. 99 NCBI
10 019_27F Bacillus sp. EGY-WCD3. 100 NCBI
11 020_27F Bacillus amyloliquefaciens; BK7. 100 NCBI
12 021_27F Bacilo amyloliquefaciens; PHODG36. 99 NCBI
UNIVERSIDAD DEL CAUCA
Ingeniería agroindustrial
Laboratorio de biotecnología
II Periodo 2018

ANEXO 2

Bacillus subtilis PPL-SC7.

Secuencia 12
Secuencia 11
Secuencia 10
Secuencia 9
Secuencia 8
Secuencia 7
Secuencia 6
Bacillus sp. EGY-WCD3.
Bacillus methylotrophicus L09.
Bacillus methylotrophicus R11.
Bacillus methylotrophicus Kt8-11.
Bacillus methylotrophicus Ks3-11.
Bacillus methylotrophicus Nt6-36.
Bacillus methylotrophicus Mo-Bm-11.
Bacillus vallismortis WA5-12.
Bacillus amyloliquefaciens Ba-74501.
Bacillus amyloliquefaciens 261.
Bacillus sp. enrichment culture clone SYW15.
Bacillus sp. enrichment culture clone SYW18.
Secuencia 5
Secuencia 3
Secuencia 4
Weissella sp. L12.
Weissella cibaria HN79.
Weissella cibaria DH8.
Weissella sp. KLDS 7.0701.
Leuconostoc mesenteroides BW2.
Leuconostoc mesenteroides Wikim SH006.
Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum qz-534.
Leuconostoc mesenteroides TW53-2.
Secuencia 1
Secuencia 2