El presente trabajo fue realizado bajo la dirección de la Dra. D.

Silvia Solís Mendiola en el

Área de Biofisicoquímica del Departamento de Química de la División de Ciencias Básicas
e Ingeniería de la Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa.
 INDICE

PARTE I
1. Introducción
2. Objetivos
2.1 Objetivo general
2.2 Objetivos particulares
3. Purificación de la tirosinasa de hongo A. bisporus
3.1 Antecedentes
3.2 Materiales y método
3.3 Obtención del cromatograma de la purificación
4. Ensayos de actividad enzimática
4.1 Corrección por dispersión de luz como una herramienta para evaluar agregados de
proteínas.
4.2 Actividad monofenolasa
4.3 Actividad difenolasa
5. Resultados y conclusiones
6. Referencias

PARTE II
1. Introducción
2. Objetivos
2.1 Objetivo general
2.2 Objetivos particulares
3. Reactivos y suplementos
4. Actividad Experimental
4.1 Deshidroxilación del SiO2 utilizado como soporte para la inmovilización
4.2 Adsorción de la tirosinasa de hongo A. bisporus sobre un soporte de SiO2 seguida
por unión covalente con glutaraldehído al 0.1 %.
4.3 Adsorción de la tirosinasa de hongo A. bisporus sobre un soporte de SiO2 en
presencia de 1 mM de Ca2+ seguida por unión covalente con glutaraldehído al 0.1 %.
4.4 Adsorción de la tirosinasa de hongo A. bisporus sobre un soporte de SiO2 en
presencia de 1 mM de Mg2+ seguida por unión covalente con glutaraldehído al 0.1%.
4.5 Ensayo enzimático del biomaterial
4.6 Caracterización de la enzima-soporte a diferentes condiciones a través de FTIR.
5. Resultados y conclusiones
6. Referencias
PARTE I

1. Introducción

La tirosinasa (EC 1.14.18.1), es una metaloenzima glicosilada que pertenece a las

proteínas de cobre tipo 3. Esta enzima cataliza la ο-hidroxilación de monofenoles (actividad
monofenolasa) y la oxidación de o-difenoles a sus correspondientes o-quinonas derivadas
(actividad difenolasa). Ambas reacciones involucran oxígeno molecular. La segunda
reacción típicamente sigue una cinética de Michaelis-Menten, mientras el análisis de la
primera reacción es complicada por la aparición del periodo de latencia que depende de la
concentración de sustrato y enzima en el medio de reacción [1], del pH [2] y fuente de la
enzima [3]. Ambas actividades de tirosinasa parecen tener amplias especificidades de
sustrato, aunque la enzima tiene una alta afinidad por los isómeros L de los sustratos que
por los correspondientes isómeros D [3].

Esta enzima ubicua cataliza los dos primeros pasos en la melanogenesis de los mamíferos
y es responsable del pardeamiento enzimático que ocurre al golpear o al almacenar
durante largo tiempo vegetales, frutas, y hongos [3]. El fenómeno de pardeamiento en
frutas y hongos es también usualmente relacionado a polimerización oxidativa,
conceptualmente similar a melanogenesis. En mamíferos, la tirosinasa no solamente es
responsable del pardeamiento del cabello y de la pigmentación de la piel [4,5], sino también
de anormalidades en la piel tales como hipopigmentación (vitíligo) e hiperpigmentación
(pecas) [6].
Además, la tirosinasa puede jugar un rol en cáncer y enfermedades neurodegenerativas,
tales como la enfermedad de Parkinson [7].

El sitio activo de la enzima contiene un par de iones de cobre(II) acoplados

antiferromagnéticamente. Tres formas existen en el sitio catalítico de la tirosinasa: E m (met-
tirosinasa), con el cobre como Cu2+Cu2+, Ed (deoxi-tirosinasa), con el cobre en la forma
Cu+Cu+ y Eox (oxi-tirosinasa), con el cobre en la forma Cu2+Cu2+O22- [8]. Estos estados
intermedios dependen de la valencia del ion cobre y la unión con el oxígeno molecular.
Además determinan la habilidad de la tirosinasa para unirse a sus sustratos y por ende
determinan la cinética de la reacción.

La forma deoxi es una especie reducida, la cual une oxígeno molecular para dar la forma
oxi. En la forma oxi, el oxígeno molecular está rodeado como un complejo μ-1,2-peroxo, el
cual desestabiliza el enlace O-O y la activa. La forma met es asumida como una forma
enzimática en descanso, donde los iones Cu(II) están normalmente puenteados a un
ligando pequeño, tales como una molécula de agua o ion hidróxido [9].
Las tirosinasas mejor caracterizadas son derivadas de Streptomyces glausescens, los
hongos Neurospora crassa y Agaricus bisporus. Una notable característica observada en
tirosinasas de diferentes fuentes es que el dominio de unión de cobre central está
conservado, el cual contiene estrictamente residuos de aminoácidos conservados,
incluyendo tres histidinas [3].

2. Objetivos

El presente trabajo consiste en purificar la metaloenzima tirosinasa de hongo A. bisporus a

partir de una muestra comercial y posteriormente medir sus actividades enzimáticas.

2.1 Objetivo general

Purificación de la metaloenzima tirosinasa de hongo A. bisporus a partir de una muestra

comercial.

2.2 Objetivos particulares

 Purificación de la metaloenzima tirosinasa de hongo A. bisporus a partir de una

muestra comercial.
 Medición de actividad difenolasa
 Medición de actividad monofenolasa

3. Purificación de la tirosinasa de hongo A. bisporus.

3.1 Antecedentes

Varias tirosinasas, como las de mamíferos [10], plantas [11] y hongos [12], se comportan
como equilibrios de asociación-disociación, dependientes de la concentración de enzima
(sistemas auto-asociantes). Algunas preparaciones de enzima de la misma fuente (hongo o
Neurospora crassa) tienden a disociarse unas más que otras [12]. En el caso de la
tirosinasa de hongo, las masas moleculares mínimas observadas por métodos de
sedimentación han sido 26,000 – 32,000 [12] y la más alta de 120,000-128,000 [13].

La enzima es comúnmente encontrada como una proteína tetramérica con una masa
molecular de ~120 kDa, compuesta de dos subunidades de ~43 kDa (subunidad H) y dos
subunidades de ~14 kDa (subunidad L) [14].
El descubrimiento de una tirosinasa monomérica activa de 43 kDa aislada del hongo [15]
sugiere que la subunidad H es dominio tirosinasa. La identidad, función y origen de la
subunidad L son todavía desconocidas [16]. Aunque se sabe que no ejerce un efecto
dramático sobre la actividad de la enzima, se requiere investigación adicional para
establecer el rol biológico de la subunidad L, si es que hay alguno, así como también su
importancia para el funcionamiento de la subunidad H [19].

En 2011 Ismaya et al. lograron la purificación y posteriormente la cristalización de la

tirosinasa de hongo A. bisporus empleando iones calcio para estabilizar la estructura
tetramérica de la proteína. De hecho desde 1969 Jolley et al. hablaban acerca de que los
cationes divalentes (Ca2+ o Mg2+) favorecen fuertemente el estado asociado de esta
enzima. Teniendo estos antecedentes se procedió a realizar la purificación.

3.2 Materiales y método

La tirosinasa de hongo (EC 1.14.18.1) utilizada en este trabajo fue obtenida de un lote
comercial de Sigma-Aldrich. El resto de los reactivos fueron de grado analítico. Se
disolvieron aproximadamente 1.2 mg de polvo de tirosinasa de hongo en 1 ml de regulador
de fosfatos (100 mM de NaPi, pH 6.50) conteniendo 10 mM CaCI 2, la muestra se filtró en
membranas Millipore con diámetro de poro de 0.45 μm, la cual se inyecto en una columna
de filtración en gel 10/300 GL Superdex S-200, en un cromatógrafo de líquidos (FPLC) GE
Healthcare. Los contenidos de la proteína fueron eluidos de la columna a un flujo de 0.2
ml/min. La elución de los componentes protéicos fue determinada por absorción de luz de
280 nm, los cuales se colectaron del volumen de elución de 14 a 21 ml del cromatograma
adjunto (Fig.1). Siete fracciones de 1 ml cada una, fueron reunidas y concentradas con
buffer concomitante a 100 mM NaPi (pH 6.50) sobre una membrana Amicon (Millipore) de
10 kDa de corte molecular. La concentración de la muestra fue realizada a 3 400xg a 4 °C
durante 15 min. El concentrado fue vertido a un tubo Eppendorf y refrigerado hasta la
realización de las pruebas de actividad mono y difenolasa.
 3.3 Obtención del cromatograma de la tirosinasa de hongo A. bisporus

Fig. 1 Los volúmenes colectados y concentrados fueron desde 14-21 ml del presente
-1
cromatograma a una velocidad de flujo constante de 0.20 ml min .

4. Ensayos de actividad enzimática

4.1 Corrección por dispersión de luz como una herramienta para evaluar
agregados de proteínas.

La precisión de la determinación espectroscópica UV de proteína puede ser decrecida por

la dispersión de la luz por el espécimen de prueba. Si las proteínas en solución existen
como partículas comparables en tamaño a la longitud de onda de la medición de la luz
(250-300 nm), la dispersión del haz de luz resulta en un aparente incremento en
absorbancia del espécimen de prueba. Para calcular la absorbancia a 280 nm debido a la
dispersión de la luz, se determinan las absorbancias de la solución prueba a las longitudes
de onda de 320, 325, 330, 335, 345, y 350 nm. Usando el método de regresión lineal se
grafica el log de la absorbancia observada versus el log de la longitud de onda, y se
determina la curva de calibración que mejor ajuste los puntos graficados. De la gráfica
obtenida, se extrapola el valor de la absorbancia debida a la dispersión de la luz a 280 nm.
Se sustrae la absorbancia de la dispersión de la luz de la absorbancia total a 280 nm para
obtener el valor de absorbancia de la proteína en solución.

4.1 Actividad monofenolasa

La actividad monofenolasa se determinó usando la L-Tirosina como sustrato, fue seguida

su o-hidroxilación al medir el incremento de absorbancia a 480 nm, a la cual la especie
detectable tiene una absortividad molar de 3,300 M-1cm-1 [18]. El ensayo enzimático fue
realizado en duplicado en una celda de cuarzo de 1 cm de longitud de paso óptico con un
volumen de reacción de 1000 μl a 25 °C usando un espectrofotómetro Shimadzu UV160U.
Se tomó solamente la parte lineal de la curva exponencial tipo Michaelis-Menten debido a
que se requiere calcular la velocidad inicial, la cual está relacionada a la actividad de la
enzima.

Antes de seguir la cinética de reacción, se hizo un blanco con buffer 100 mM NaPi (pH
6.50). La enzima y el buffer se equilibran durante 1 min en la celda de reacción antes de
agregar el sustrato y el tiempo de ciclo para el ensayo fue 45 s durante 1200 s.

Tabla 1. Condiciones del ensayo de formación de la especie detectable a partir de L-

Tirosina

Enzima 9 μg
Buffer 100 mM NaPi (pH 6.50)
Sustrato 0.30 mM L-Tirosina

La absorbancia de la solución de proteína ya concentrada y corregida debido a la

dispersión de la luz fue de 0.08734. Ahora tomando el valor del coeficiente de extinción
molar de 132,000 M-1cm-1 [17] y una masa estructural de 125,307.5 Da [19] para la proteína
ya purificada y aplicando la ley de Beer-Lambert se procede a encontrar la alícuota
correspondiente para la celda de reacción.

Se disolvió 2.5 mg/ml de L-Tirosina en buffer 100 mM NaPi (pH 6.50) y se agitó
moderamente en un vortex durante dos minutos. Después se procedió a tomar la alícuota
correspondiente.
De acuerdo a Gracía-Molina et al. [18] en el estado estacionario tenemos que:
[DC]=V0t –[I]ss
Siendo:
DC Especie detectable derivada de L-Tirosina
I Intermediario
SS Estado estacionario

Por lo tanto la velocidad inicial (Vo) es 75 nMs-1 para la actividad monofenolasa.

4.3 Actividad difenolasa

La actividad difenolasa se determinó usando la L-DOPA como sustrato, fue seguida su

oxidación al medir el incremento de absorbancia a 475 nm, a la cual la especie detectable
tiene una absortividad molar de 3 600 M-1cm-1 [18]. El ensayo enzimático se realizó por
triplicado en una celda de cuarzo de 1 cm de longitud de paso óptico, con un volumen de
reacción de 1000 μl a 25 °C, usando un espectrofotómetro Shimadzu UV160U. Se tomó
solamente la parte lineal de la curva exponencial tipo Michaelis-Menten debido a que se
requiere calcular la velocidad inicial, la cual está relacionada con la actividad de la enzima.

Antes de seguir la cinética de reacción, se hizo un blanco con buffer 100 mM NaPi (pH
6.50). La enzima y el buffer se equilibraron durante 1 min en la celda de reacción antes de
agregar el sustrato y el tiempo de ciclo para el ensayo fue 20 s durante 600 s.

Tabla 2. Condiciones del ensayo de formación de la especie detectable a

partir de L-DOPA.

Enzima 3.5 μg
Buffer 100 mM NaPi (pH 6.50)
Sustrato 0.30 mM L-DOPA

La absorbancia de la solución de proteína ya concentrada y corregida debido a la

dispersión de la luz fue de 0.09934. Se tomó el valor para el coeficiente de extinción molar
de 132 000 M-1cm-1 [17] y una masa estructural de 125,307.5 Da [19] para la proteína ya
purificada y aplicando la ley de Beer-Lambert se procede a encontrar la alícuota
correspondiente para la celda de reacción.
Se disolvió 2.5 mg/ml de L-DOPA en buffer 100 mM NaPi (pH 6.50) y se agitó
moderadamente en un vortex durante dos minutos. Después se procedió a tomar la
alícuota correspondiente.
De acuerdo a García-Molina et al. [18] en el estado estacionario tenemos que:
[DC]=(V0t)/2 –([QH]ss + [Q]ss)/2
Siendo:
DC Especie detectable derivada de la oxidación de L-DOPA
QH Quinona protonada
Q Quinona
SS Estado estacionario

Por lo tanto la velocidad inicial (Vo) es 290 nMs-1 para la actividad difenolasa.

Gráfica 1. Acción de la tirosinasa de hongo A. bisporus purificada sobre L- DOPA

y L-Tirosina.

80
70
[Especie detectable]/µM

60 y = 0.145x - 0.9032
R² = 0.9931
50
40
30
20 y = 0.0752x - 2.6964
10 R² = 0.9939
0
0 100 200 300 400 500 600 700
Tiempo/s

Actividades mono y difenolasa en presencia de 0.30 mM de L-Tirosina y L-DOPA respectivamente en buffer 100 mM NaPi pH
6.50. Los círculos corresponden a la actividad difenolasa medida a 475 nm y los triángulos corresponde a la actividad
monofenolasa medida a 480 nm.
5. Resultados y conclusiones

Para la purificación de la metaloenzima tirosinasa de hongo A. bisporus se debe tomar en

cuenta la concentración y el pH, ya que esta proteína presenta un equilibrio de asociación-
disociación dependiente de estos parámetros. Por lo tanto, se usaron cationes Ca2+ para
estabilizar la estructura cuaternaria H2L2 (notación de Strothkamp et al., 1976) en solución
acuosa y así poder lograr su purificación. Durante la purificación se uso 10 µM CuCI 2 para
suprimir la perdida de Cu2+ durante la purificación de la misma.

La actividad mono y difenolasa de la enzima purificada se logró medir y corroborar que la

primera actividad es más lenta que la segunda. La velocidad inicial (Vo) para la actividad
difenolasa fue 290 nMs-1 y para la actividad monofenolasa fue 75 nMs-1 a las condiciones
antes mencionadas.

6. Referencias

[1] García-Cánovas F., García-Carmona F., Lozano, J.A. Phytochemistry 20 (1981)

1215-1217.
[2] Devi, C.C., Tripathi, R.E., Ramaiah, A. Eur. J. Biochem. 166 (1987) 705-711.
[3] Te-Sheng Chang. An updated review of tyrosinase inhibitors. Int. J. Mol. Sci. 10
(2009) 2440-2475.
[4] Marmol V del, Beerman F. Tyrosinase and related proteins in mammalian
pigmentation. FEBS Lett 381 (1996) 165-168.
[5] Marusek CM, Trobaugh NM, Flurkey WH, Inlow JK. Comparative analysis of
polyphenol oxidase from plant and fungal species. J. Inorg. Biochem. 100 (2006)
108-123.
[6] Piamphongsant T. Treatment of melasma: a review with personal experience. Int J
Dermatol 37 (1998) 897-903.
[7] Cavalieri EL, Li K-M, Balu N, Saeed M, Devanesan P, Higginbotham S, et al.
Catechol ortho-quinones: the electrophilic compounds that form depurinating DNA
adducts and could initiate cancer and other diseases. Carcinogenesis 23 (2002)
1071-1077.
[8] R.L. Jolley, L.H. Evans, N.Makino, H.S. Mason, J. Biol. Chem. 249 (1974) 335-345.
[9] Matoba Y., Kumagai T., Yamamoto A., Yoshitsu H., Sugiyama M., Crystallographic
evidence that the dinuclear copper center of tyrosinase is flexible during catalysis.
The Journal of Biological Chemistry 281 (2006) 8981-8990.
[10] Hearing, V.J.,Jr., Ekel, T.M., Montagne, P.M., Hearing, E.D., Nicholson, J.M. Arch.
Biochem. Biophys. 185 (1978) 407.
[11] Harel, E., Mayer, A.M., Lehman, E. Phytochemistry 12 (1973) 2649.
[12] Duckworth, H.W., Coleman, J.E. Journal Biol. Chem. 245 (1970) 1613-1625.
[13] Bouchilloux, S., McMahill, P., Mason, H.S. Journal Biol. Chem. 238 (1963) 1699.
[14] Strothkamp, K. G., Jolley, R.L. Mason, H.S. Quaternary structure of mushroom
tyrosinase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 70 (1976) 519-524.
[15] Wichers, H.J., Gerritsen, Y.A.M., Chapleton, C.G.J. Tyrosinase isoforms from the
fruitbodies of Agaricus bisporus. Phytochemistry 43, (1996) 333-337.
[16] Flurkey, W.H., Inlow, J.K. Proteolytic processing of polyphenol oxidase from plants
and fungi. J. Inorg. Biochem. 102 (2008) 2160-2170.
[17] W. T. Ismaya, H. J. Rozeboom, M. Schurink, C. G. Boeriu, H. Wichers and B. W.
Dijkstra Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of tyrosinase
from the mushroom Agaricus bisporus Acta Cryst. F67 (2011) 575-578.
[18] F. García-Molina, J. L. Muñoz, R. Varón, J. N. Rodríguez-López, F. García-Cánovas
and J. Tudela A review on spectrophotometric methods for measuring the
monophenolase and diphenolase activities of tyrosinase. J of Agricultural and Food
Chemistry 55 (2007) 9739-9749.
[19] W. T. Ismaya, H. J. Rozeboom, A. Weijn, Juriaan J. Mes, Fabrizia Fusetti, H. J.
Wichers, and B. W. Dijkstra. Crystal structure of Agaricus bisporus mushroom
tyrosinase: Identity of the tetramer subunits and interacction with tropolone.
Biochemistry 50 (2011) 5477-5486.
[20] R.L. Jolley, Jr., Donald A. Robb, and H. S. Mason. The multiple forms of mushroom
tyrosinase-Association-Dissociation phenomena. The J. Biological Chemistry 244
(1969) 1599-1599.
[21] Marloes Scurink, Willem, J. H. van Berkel, Harry J. Wichers, Carmen G. Boeriu.
Novel peptides with tyrosinase inhibitory activity. Peptides 28 (2007) 485-495.
[22] J.L. Muñoz-Muñoz, F. García-Molina, P.A. García-Ruiz, R. varon, J. Tudela, F.
García-Cánovas, J.N. Rodriguez-López. Some kinetic properties of deoxytyrosinase.
J. Molecular Catalysis B: Enzymatic 62 (2010) 173-182.
[23] Martin P. Jackman, Marcel Huber, Alex Hajnal and Konrad Lerch. Stabilization of the
oxy form of tyrosinase by a single conservative amino acid substitution. Biochem. J.
282 (1992) 915-918.
PARTE II

1. Introducción

La primera aplicación industrial de una enzima inmovilizada en una biotransformación es el

proceso Tanabe [1], el primero comercializado hace más de 40 años, para la producción de
ʟ-aminoácidos por resolución de ácidos acilamino racemicos usando una aminoacilasa de
Aspergillus oryzae.

La inmovilización de una proteína puede ser definida como la unión de enzimas solubles o
libres sobre diferentes tipos de soportes resultando en la reducción o perdida de movilidad
de la enzima. La selección de una estrategia de inmovilización influye mucho en las
propiedades del biocatalizador. Los métodos para inmovilizar proteínas pueden ser
divididos en tres principales categorías [2]:
 Unión a un soporte prefabricado (portador)
 Atrapamiento en matrices poliméricas orgánicas e inorgánicas
 Entrecruzamiento de enzimas

Cabe señalar que está clasificación es arbitraria para cada autor o autores. Los métodos
para inmovilizar pueden clasificarse de manera general como físicos (donde interacciones
débiles existen entre el soporte y la enzima) y químicos (donde enlaces covalentes son
formados con la enzima).

Los niveles de variación en la actividad y las limitaciones de difusión que ocurren con la
inmovilización son principalmente dependientes de las propiedades del material de soporte
y el método de inmovilización. Los materiales de soporte juegan un rol muy importante en
la utilidad de una enzima inmovilizada, por lo que deberían ser de bajo costo y proveer un
área superficial grande adecuada junto con la menor limitación de difusión en el transporte
de sustrato y producto para las reacciones enzimáticas [3].

Es sorprendente que no hay un método general aplicable universalmente para la

inmovilización de enzimas. Las condiciones de inmovilización óptimas para una enzima
dada y su aplicación son encontradas empíricamente por un proceso de ensayo y error
para asegurar la más alta retención posible de la actividad de la enzima, su estabilidad
operacional y durabilidad [4,5].

La principal tarea es seleccionar un portador apto, la condición (pH, temperatura, etc.) y la

enzima (fuente, pureza, etc.) para inmovilizar un biocatalizador. El método seleccionado
debería cumplir tanto con las necesidades catalíticas (expresadas en productividad,
rendimiento espacio-tiempo, estabilidad y selectividad) y las no catalíticas (separación,
control, proceso down-streaming) que son requeridas para la aplicación dada. Una enzima
inmovilizada puede ser etiquetada como `robusta´ cuando cumple ambas funciones
(catalíticas y no catalíticas) para una aplicación específica [6,7].
El uso de enzimas libres comparadas a sus formas inmovilizadas muestran algunos
inconvenientes tales como inestabilidad térmica, susceptibilidad a ataques por proteasas,
inhibición de actividad, alta sensibilidad a varios agentes desnaturalizantes y la dificultad de
separar o reusar el catalizador libre al final de la reacción de la mezcla de reacción [8].

Ahora, algunos beneficios de usar enzimas inmovilizadas son [9]:

 Reusabilidad de los biocatalizadores heterogéneos con el objetivo de reducir el costo
de producción por reciclaje eficiente y control del proceso.
 Como dispositivos analíticos estables y reusables para aplicaciones médicas y
analíticas.
 Como adsorbentes selectivos para la purificación de proteínas y enzimas.
 Como herramientas fundamentales para la química de proteínas en fase sólida.
 Como microdispositivos para la liberación controlada de proteínas como fármacos.

2. Objetivos

El propósito de este trabajo es encontrar o explorar variantes para la inmovilización de la

metaloenzima tirosinasa de hongo A. bisporus a las ya reportadas en la literatura
previamente y analizar su eficiencia.

2.1 Objetivo general

Inmovilización de la tirosinasa de hongo A. bisporus sobre un soporte de SiO2.

2.2 Objetivos particulares

 Deshidroxilación del SiO2 utilizado como soporte para la inmovilización.

 Adsorción de la tirosinasa de hongo A. bisporus sobre un soporte de SiO2 seguida
por unión covalente con glutaraldehído al 0.1 %.
 Adsorción de la tirosinasa de hongo A. bisporus sobre un soporte de SiO2 en
presencia de 1 mM de cationes divalentes como Ca2+ y Mg2+ seguida por unión
covalente con glutaraldehído al 0.1 %.
 Ensayo enzimático del biomaterial.
 Caracterización de la enzima-soporte a diferentes condiciones a través de FTIR.
3. Reactivos y suplementos

La tirosinasa de hongo (EC 1.14.18.1) utilizada en este trabajo fue obtenida de un lote
comercial de Sigma-Aldrich. Los reactivos Glutaraldehído Grado III (solución al 70 %,
ρ=1.143 gml-1) y L-DOPA fueron adquiridos de la misma casa comercial Sigma-Aldrich (St
Louis, Mo.). Los reactivos CaCI2, MgCI2·6H2O, CuSO4·5H2O, KH2PO4, K2HPO4, y glicerina
fueron de grado analítico.
La sílice mesoporosa fue sintetizada por el proceso sol-gel usando tetraetilortosilicato
(TEOS Aldrich 98%), etanol (Baker 99%), y agua desionizada en un cociente molar 1:4:2.5.
La solución fue calentada desde 30 °C hasta 60 °C y agitada hasta que un gel fue obtenido
a pH 6.50. El resto de los reactivos fueron de grado analítico.

4. Actividad Experimental

4.1 Deshidroxilación del SiO2 utilizado como soporte para la inmovilización

La superficie de la sílice bajo condiciones normales está cubierta con grupos hidroxilos
(grupos silanol: Si-OH) que ejercen importantes funciones en los procesos de adsorción,
mientras que en el interior del sólido presenta puentes siloxano (Si-O-Si) [10] cuyas
concentraciones relativas dependen de la temperatura de calcinación también como de la
humedad ambiente y el tiempo de almacenaje [11]. El principal adsorbente inorgánico
usado como soporte es la sílice gel, debido principalmente a su comportamiento químico
determinado por la reactividad de los grupos silanol presentes en la superficie. Estos
grupos no solamente hacen capaz la adsorción física de varias sustancias sino también de
reacciones químicas con otros grupos orgánicos o inorgánicos, modificando completamente
las propiedades originales de la sílice gel [12]. La estructura y reactividad de la sílice son
fuertes funciones de la historia térmica y química de la muestra. De acuerdo a Zhuravlev
[13,14], la temperatura umbral correspondiente a una completa deshidratación y el
comienzo de la deshidroxilación está estimada en 190±10°C, así una pequeña cantidad de
agua adsorbida físicamente permanece sobre la superficie hasta aproximadamente 200°C.
La muestra fue calcinada a 550 °C, porque el área superficial no cambia significativamente
debajo de 600 °C para la mayoría de la sílices [11].

Tabla 1. Condiciones de calcinación del SiO2

R1 0.5 °C/min R2 0.5 °C/min R3 0.5 °C/min
T1 115 °C T2 550 °C T3 50 °C
H1 6 h H2 40 h H3 ---------

R: Velocidad de la rampa para alcanzar la temperatura deseada, T1: Temperatura inicial, T2: Temperatura máxima a alcanzar, T3:
Temperatura mínima al enfriarse, H: Tiempo que permanecerá a cierta temperatura (T1, T2, T3) una vez alcanzada está última.
4.2 Adsorción de la tirosinasa de hongo A. bisporus sobre un soporte de SiO2
seguida por unión covalente con glutaraldehído al 0.1 %.

En un tubo Falcon® se disolvió enzima tirosinasa de hongo (EC 1.14.18.1) en 3 ml de buffer

100 mM KPi pH 6.80, obteniéndose una concentración de 63 µgml-1 tomando como
referencia E1%=24.9 a 280 nm [17], posteriormente se añadió 337 mg de sílice gel y se
cubrió la solución con parafilm. Se utilizó agitación manual moderada durante todo el
proceso y se mantuvo en refrigeración a 4 °C. La adsorción fue seguida a través de
lecturas de absorbancia en función del tiempo, usando un espectrofotómetro UV-Vis
Shimadzu UV160U, y utilizando como blanco la misma cantidad de sílice gel en otro tubo
Falcon® en presencia de la misma cantidad de buffer. La adsorción simple fue realizada
durante 11 h, posteriormente para realizar el entrecruzamiento, la enzima-soporte
permaneció durante 2 h remojándose en buffer 100 mM KPi pH 6.80 / 0.1 % glutaraldehído,
se cubrió con parafilm y se dejó a temperatura ambiente.

Una vez finalizado este último paso la enzima-soporte fue sacada de la solución y
enjuagada en buffer 100 mM KPi pH 6.80 y posteriormente se vertió en otra solución que
contiene buffer 100 mM KPi pH 6.80 / 20 % glicerol / 20 μM CuSO 4 y se mantuvo en
refrigeración a 4 °C para su uso posterior.

4.3 Adsorción de la tirosinasa de hongo A. bisporus sobre un soporte de SiO2 en

presencia de 1 mM de Ca2+ seguida por unión covalente con glutaraldehído al 0.1 %.

En un tubo Falcon® se disolvió cierta cantidad de tirosinasa de hongo (EC 1.14.18.1). en 3

ml de buffer 100 mM KPi pH 6.80 / 1mM CaCI2 obteniéndose una concentración de 83
µgml-1 tomando como referencia E1%=24.9 a 280 nm [17], posteriormente se añadió 363 mg
de sílice gel y se cubrió la solución con parafilm. Se utilizó agitación manual moderada
durante todo el proceso y se mantuvo en refrigeración a 4 °C. La adsorción fue seguida a
través de lecturas de absorbancia en función del tiempo, usando un espectrofotómetro UV-
Vis Shimadzu UV160U, y utilizando como blanco la misma cantidad de sílice gel en otro
tubo Falcon® en presencia de la misma cantidad de buffer. La adsorción simple fue
realizada durante 4 h, posteriormente para realizar el entrecruzamiento, la enzima-soporte
permaneció durante 2 h remojándose en buffer 100 mM KPi pH 6.80 / 0.1 % glutaraldehído,
se cubrió con parafilm y se dejó a temperatura ambiente.

Una vez finalizado este último paso la enzima-soporte fue sacada de la solución y
enjuagada en buffer 100 mM KPi pH 6.80 y posteriormente se vertió en otra solución que
contiene buffer 100 mM KPi pH 6.80 / 20 % glicerol/ 20 μM CuSO4 y se mantuvo en
refrigeración a 4 °C para su uso posterior.
4.4 Adsorción de la tirosinasa de hongo A. bisporus sobre un soporte de SiO2 en
presencia de 1 mM de Mg2+ seguida por unión covalente con glutaraldehído al 0.1 %.

En un tubo Falcon® se disolvió cierta cantidad de tirosinasa de hongo (EC 1.14.18.1) en 3

ml de buffer 100 mM KPi pH 6.80 /1 mM MgCI2, obteniéndose una concentración de 73
µgml-1 tomando como referencia E1%=24.9 a 280 nm [17], posteriormente se añadió 354 mg
de sílice gel y se cubrió la solución con parafilm. Se utilizó agitación manual moderada
durante todo el proceso y se mantuvo en refrigeración a 4 °C. La adsorción fue seguida a
través de lecturas de absorbancia en función del tiempo usando un espectrofotómetro UV-
Vis Shimadzu UV160U, y utilizando como blanco la misma cantidad de sílice gel en otro
tubo Falcon® en presencia de la misma cantidad de buffer. La adsorción simple fue
realizada durante 8 h, posteriormente para realizar el entrecruzamiento, la enzima-soporte
permaneció durante 2 h remojándose en buffer 100 mM KPi pH 6.80 / 0.1 % glutaraldehído,
se cubrió con parafilm y se dejó a temperatura ambiente.

Una vez finalizado este último paso la enzima-soporte fue sacada de la solución y
enjuagada en buffer 100 mM KPi pH 6.80 y posteriormente se vertió en otra solución que
contiene buffer 100 mM KPi pH 6.80 / 20 % glicerol / 20 μM CuSO 4 y se mantuvo en
refrigeración a 4 °C para su uso posterior.

4.5 Ensayo enzimático del biomaterial

Tabla 2. Condiciones del ensayo enzimático

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

Soporte-
enzima 0.600 g 0.607 g 0.650 g
†
Buffer 2199.3 μL 2199.3 μL 2199.3 μL
‡
Sustrato 80.7 μL 80.7 μL 807. μL
100 mM KPi pH 6.80†, 0.30 mM L-DOPA ‡ . Muestra 1 adsorción simple, Muestra 2 adsorción simple en presencia de 1 mM de CaCI2,
Muestra 3 adsorción simple en presencia de 1 mM de MgCI2. Todas las muestras contienen 0.1 % de glutaraldehído. Se utilizó un
espectrofotómetro UV-Vis Shimadzu UV160U para la adquisición de los espectros.
Gráfica 1. Ensayo enzimático del biomaterial.

12.0

10.0
[DOPAcromo]/ µM

8.0 y = 0.0064x + 1.1471

R² = 0.997
6.0

4.0
y = 0.0025x + 1.7425
R² = 0.984
2.0

0.0
0 500 1000 1500 2000
Tiempo/s

Medio de reacción: 100 mM KPi pH 6.80, 0.30 mM L-DOPA . Muestra 1: adsorción simple (triángulos rojo), Muestra 2: adsorción simple
en presencia de 1 mM de CaCI2 (triángulos azul) y Muestra 3: adsorción simple en presencia de 1 mM de MgCI2 (triángulos verde). Todas
las muestras fueron unidas covalentemente con glutaraldehído al 0.1%.

4.6 Caracterización del biomaterial a diferentes condiciones a través de FTIR.

120
100
% Transmitancia

% Transmitancia

90
90
m1 90 min después de reaccionar
m1 adsorción simple m3 adsorción simple en presencia de MgCI2
m2 90 min después de reaccionar
m0 sílice calcinada
m2 adsorción simple en presencia de CaCI2
m3 90 min después de reaccionar

80
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

Número de onda (cm-1) Número de onda (cm-1)

Todas muestras después de la adsorción simple se unieron covalentemente por medio de glutaraldehído al 0.1 % excepto la
muestra 3 que está en color negro.
Tabla 3. Asignación de bandas de absorción de los espectros de IR

Frecuencia de grupo(cm-1) Asignamiento

3580 (m)† O-H estiramiento(enlazado por puente de H, muy

amplio)
3400‡ O-H estiramiento
1635 (m)† H-O-H inclinación
1645‡ H-O-H inclinación
1210-1150† Amina terciaria, C-N estiramiento
1190-1130† Amina secundaria, C-N estiramiento
1090-1020† Amina primaria, C-N estiramiento
1200 (sh)† Si-O estiramiento
1095 (vs)† Si-O estiramiento
m=medio, sh=hombro, vs=muy fuerte, [15]†, [16]‡. Se utilizo un espectrofotómetro FTIR Shimadzu para la adquisición de los espectros.

5. Resultados y conclusiones

La adsorción de la tirosinasa de hongo A. bisporus (muestra 1) tuvo una eficiencia del 20%,
la adsorción en presencia de 1mM de CaCI2 (muestra 2) obtuvo una eficiencia del 70% y la
adsorción en presencia de 1 mM de MgCI2 (muestra 3) obtuvo una eficiencia del 90 %. El
glutaraldehído al 0.1 % fue usado como un agente de entrecruzamiento para unir
covalentemente la enzima al soporte y así evitar su desorción del mismo durante la catálisis
enzimática.

Se calculó la velocidad inicial (Vo), la cual está relacionada a la actividad de la enzima para
las tres muestras, obteniéndose una Vo para la muestra 1 de 4 nMs-1, una Vo para la
muestra 2 de 12 nMs-1 y para la muestra 3 no fue posible calcularse debido a una tendencia
que no fue posible explicar.

La conclusión a la que llegamos es que la enzima es eficiente al adsorberse sobre un

soporte de SiO2 en presencia de cationes divalentes como Ca2+ y Mg2+, presentando un
rendimiento bajo al catalizar el sustrato L-DOPA. Lo anterior se debe probablemente a que
el soporte cambia sus propiedades en presencia de estos cationes divalentes.

Consideramos que la adición de glutaraldehído al 0.1 %, para la unión covalente de la

enzima al soporte, no influyó en una pérdida significativa de actividad, ya que se preparó a
una concentración muy baja. Además observamos la disminución de la actividad de la
enzima cada vez que se ponía a reaccionar en presencia de su sustrato L-DOPA,
probablemente intervinieron los productos finales de la reacción, los cuales se están
adhiriendo al soporte de la enzima, porque va tomando un color negruzco al mismo tiempo
que va perdiendo actividad.

6. Referencias

[1] I. Chibata, T. Tosa, T. Shibatani, in. Chirality in Industry, (Eds.: A. N. Collins, G. N.

Sheldrake, J. Crosby), Wiley, New York, 1992, pp.351-370; T. Tosa, T. Mori, N.
Fuse, I. Chibata, Enzymologia 1996, 31, 214.
[2] Sheldon, R. A., Enzyme Immobilization: The Quest for Optimum Performance. Adv.
Synth. Catal. 349 (2007) 1289-1307.
[3] Krajewska, B., Application of chitin- and chitosan- based materials for enzyme
immobilization: A review. Enz. Microbial Technol. 35 (2004) 126-139.
[4] Khan, A. A., S. Akhtar and Q. Hussain, Adsorption of polyphenol oxidases on Celite
545 directly from ammonium sulphate fractionated proteins of brinjal (Solanum
melongena). J. Sci. Ind. Res. 64 (2005b) 621-626.
[5] Krajewska, B., Ureases. II: Properties and their customizing by enzyme
immobilizations: A review. J. Mol. Catal. B Enz. 59 (2009) 22-40.
[6] Bornscheuer UT: Immobilizing enzymes: how to create more suitable biocatalysts.
Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42 (2003) 3336-3337.
[7] Dyal A, Loos K, Noto M, Chang SW, Spagnoli C, Shafi KV, Ulman A, Cowman M,
Gross RA: Activity of Candida rugosa lipase immobilized on gamma-Fe2O3 magnetic
nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 125 (2003) 1684-1685.
[8] Ali Khan, A., Alzohairy, M. A., Recent advances and Applications of Immobilized
enzyme Technologies: A review. Research J. Of Biol. Sci. 5(8) (2010) 565-575.
[9] Cao, L., Immobilised enzymes: science or art? Current Opinion in Chemical Biology
9 (2005) 217-226.
[10] Armistead, C.G., Tyler, A. J., Hambleto, F. A. The surface hydroxylation of silica. J.
Phys. Chem. 73(11) (1969) 3947-3952.
[11] Ek S., Roo A., Peussa M., Niinisto L., Determination of the hydroxyl group content in
silica by thermogravimetry and a comparison with 1H MAS NMR results.
Thermochimica Acta 379 (2001) 201-212.
[12] Iler, R. K. The Chemistry of Silica. John Wiley & Sons: New York, 1979; 15-70.
[13] L.T. Zhuravlev, React. Kinet. Catal. Lett. 50 (1993) 15.
[14] L.T. Zhuravlev, Pure Appl. Chem. 61 (1989) 1969.
[15] H.A. Benesi and A.C. Jones, An infrarred study of the water-silica gel system, 1959.
[16] John Coates, Interpretation of infrarred spectra, a practical approach, Encyclopedia
of analytical Chemistry, R.A. Meyers(Ed.) pp. 10815-10837, John Wiley & Sons Ltd,
Chichester, 2000.
[17] Duckworth, W.H., and Coleman, E. J. Physicochemical and Kinetic Properties of
Mushroom Tyrosinase. The J. Of Biol. Chem. 245(7) (1970) 1613-1625.