Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Métodos de Análisis

León Valverde Mario Santiago

Separación e identificación de los aminoácidos presentes

en el jugo de un fruto por cromatografía bidimensional en
capa fina

Profesor: Benítez Ibarra Rogelio Alejandro

Grupo: 4IM1

Sección: 2
Objetivos.
Separar los aminoácidos presentes en el jugo de mandarina por cromatografía
bidimensional en capa fina.
Identificar los aminoácidos encontrados de acuerdo a sus valores de Rf
Comparar la cromatografía unidimensional y bidimensional de acuerdo a su grado
de separación (resolución).

Resultados
1 2

3 4
 1. Placa I. Cromatografía unidimensional desarrollada con la fase móvil 1.
2. Placa II Cromatografía unidimensional desarrollada con la fase móvil 2.
3. Placa III Cromatografía bidimensional de muestras tipo de aminoácidos.
4. Placa IV Cromatografía bidimensional de muestra problema (jugo de mandarina).

1ª fase móvil 2ª fase móvil

Aminoácido Frente del Frente del Rf Frente Frente del Rf
soluto disolvente del soluto disolvente
Arg 2.5 7.7 0.33 1.2 7.2 0.16
Lys 3.3 7.5 0.44 0.8 7.1 0.11
Pro 5.3 7.7 0.68 1.9 7.1 0.26
Gly 5.9 7.7 0.76 2.2 7.1 0.31
Hys 6.8 7.6 0.89 0.8 7.1 0.11
Thr 6.8 7.6 0.89 2.3 7.2 0.32
Glu 7.0 7.8 0.89 2.4 7.2 0.33
Tyr 7.0 7.7 0.90 4.2 7.1 0.59
Met 7.4 7.8 0.94 4.0 7.2 0.55
Phe 7.4 7.6 0.97 4.4 7.2 0.61
Tabla 1. Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en las 2 fases móviles.

No. de 1ª fase móvil 2ª fase móvil Aminoácido

Mancha Frente del Frente del Rf Frente del Frente del Rf correspondiente
soluto disolvente soluto disolvente
1 2.2 7.2 0.30 1.2 7.1 0.17 Arg
2 3.3 7.6 0.43 0.9 7.2 0.12 Lys
3 4.8 7.6 0.63 2.0 7.1 0.28 Pro
4 5.4 7.6 0.71 2.1 7.2 0.29 Gly
5 6.2 7.5 0.82 4.2 7.2 0.58 Glu
6 6.0 7.1 0.84 2.4 7.1 0.33 Thr
7 6.1 7.2 0.84 1.5 7.2 0.20 Tyr
8 6.5 7.6 0.85 4.0 7.1 0.56 Met
9 6.1 7.1 0.86 1.0 7.1 0.14 Hys
10 7.1 7.6 0.93 4.5 7.1 0.63 Phe
Tabla 2. Cromatograma bidimensional tipo desarrollado en las 2 fases móviles.

No. de 1ª fase móvil 2ª fase móvil

Mancha Frente del Frente del Rf Frente del Frente del Rf
soluto disolvente soluto disolvente
1 1.8 8.1 0.22 1.2 6.9 0.17
2 3.0 8.0 0.37 2.0 6.9 0.29
3 3.2 8.0 0.40 2.3 6.9 0.33
4 3.7 7.9 0.46 2.6 6.9 0.37
 5 4.1 7.9 0.51 3.2 6.9 0.46
6 4.1 8.0 0.52 1.9 6.9 0.27
7 4.8 8.1 0.59 1.9 6.9 0.27
8 5.4 8.0 0.67 2.3 6.9 0.33
9 6.7 7.9 0.84 3.8 7.0 0.54
10 6.8 7.9 0.86 4.6 6.9 0.66
Tabla 3. Cromatograma bidimensional problema desarrollado en las 2 fases móviles.

No. de Mancha Rf en la 1ª fase Rf en la 2ª fase Aminoácido

móvil móvil correspondiente
1 0.22 0.17 Arg
2 0.37 0.29 -
3 0.40 0.33 -
4 0.46 0.37 -
5 0.51 0.46 -
6 0.52 0.27 -
7 0.59 0.27 Pro
8 0.67 0.33 Gly
9 0.84 0.54 Met
10 0.87 0.66 Phe
Tabla 4. Cromatograma bidimensional problema (IV) desarrollado en las 2 fases móviles.

Cuestionario.
1. Investigar en la literatura los aminoácidos que contiene el jugo empleado
como problema. Compare sus resultados y concluya.

Ácido aspártico, Ácido glutámico, Alanina, Fenilalanina, Glicina,

Hidroxiprolina, Isoleucina, Lisina, Metionina, Prolina, Serina, Tirosina,
Treonina, Triptofano, y Valina.

2. Escriba la reacción completa de la ninhidrina con un aminoácido

 3. ¿Es posible cambiar el orden de las fases móviles? Explique su respuesta.
Esto es posible y se puede realizar, sin embargo el orden planteado para las
fases móviles radica en que, la primer fase móvil debe ser fácil de eliminar, de
modo que no interfiera en el corrimiento de la segunda fase móvil, la segunda
no necesariamente debe ser eliminada por completo para efectos del análisis.
4. Indique las posibles fuentes de error de esta técnica.
-Trabajar sin guantes, esto debido a que nuestro cuerpo por naturaleza segrega
sustancias orgánicas que pueden interferir en el análisis al momento de revelar
las placas.
-El cromatofolio se colocó de forma incorrecta. Esto provoca que el corrimiento
no sea adecuado, puede provocar que la fase móvil avance primero por las
orillas de la placa.
-La cámara cromatográfica no se encontraba saturada por completo de la fase
móvil, o no se selló de forma adecuada.
Discusión.
Se realizaron cuatro cromatografías, 2 unidimensionales y 2 bidimensionales; se
numeraron del 1 al 4 en números romanos para poderlas identificar más fácilmente,
las placas I y II fueron las unidimensionales y cada una de ellas se desarrolló en
una fase móvil diferente. La placa I se desarrolló en una solución compuesta por
cloroformo:metanol:amoniaco (2:2:1), la placa II se desarrolló con la segunda fase
Butanol:Ácido acético:Agua (3:1:1). En ambas placas (I y II) se colocaron 3
microlitros de la solución problema (jugo de mandarina) y también 1 microlitro de
cada una de las 10 soluciones de aminoácidos tipo, estos últimos nos servirán para
caracterizar las manchas localizadas al termino de la cromatografía.
Las placas III y IV se utilizaron para desarrollar la cromatografía bidimensional que
a diferencia de las placas I y III, estás si se pusieron en contacto con ambas fases
móviles.
Las placas utilizadas estaban constituidas por un soporte de alumino, la fase
estacionaria de la cromatografía está formada por una capa de silica-gel (SiO2),
esta es una sustancia con características polares, lo que nos indica que las
sustancias más afines a la fase estacionaria serán de igual manera las sustancias
polares, en cambio las sustancias no polares interactúan en menor medida que las
anteriores, por lo tanto si las interacciones entre sustancias polares son más fuertes,
entonces el desplazamiento sobre la placa será más lento, pues ofrece una mayor
oposición al movimiento; en cambio las sustancias no polares migraran más por su
menor interacción con la fase estacionaria.
Para complemento de lo mencionado anteriormente, nosotros conocemos las
estructuras de los aminoácidos tipo colocados en las diferentes placas de este
análisis, de acuerdo a sus grupos R sabemos acerca de sus características polares,
esto es muy claro en las placas pues en todas las placas la fenilalanina es el
aminoácido que presenta el valor de RF más alto que es la relación entre el avance
de la sustancia contra el avance de la fase móvil. Como se mencionó anteriormente
los grupos polares serían los que avanzan más debido a la menor con la fase
estacionaria. La Arginina en cambio resulta ser la que presenta el valor de RF más
bajo de todos pues es un compuesto muy polar debido a que su grupo R presenta
un carácter iónico.
Los valores de Rf obtenidos en las placas I y II fueron el parámetro que nos sirvió
para identificar a los aminoácidos en las demás placas, si las sustancias
presentaban similitudes en sus valores de Rf se puede considerar que se trata de
dicho aminoácido, al comparar nuestros resultados con experiencias anteriores,
podemos observar que los corrimientos de las placas son similares.
Las placas I y II desarrollaron la separación de la muestra problema colocada, sin
embargo los resultados arrojados mostraron un corrimiento muy difuso, dificultando
así la tarea de identificar los aminoácidos presentes en el jugo de mandarina pues
los valores de Rf fueron muy similares entre sí
Contrario a esto la cromatografía bidimensional nos ofrece un mayor grado de
resolución, esto es visible pues se aprecian las manchas pero más separadas,
siendo más evidente los aminoácidos encontrados. De acuerdo a los valores de Rf
los aminoácidos que más coinciden Sonia Arginina, Prolina, Glicina, Metionina y
Fenilalanina sin embargo se encontraron más manchas que no se reconocen.
Podemos inferir que son aminoácidos adicionales a los utilizados de las soluciones
tipo.
Conclusiones.
Se lograron separar por cromatografía bidimensional, e identificar algunos
aminoácidos contenidos en el jugo de mandarina de acuerdo a sus valores de Rf.
Los aminoácidos encontrados si corresponden a los reportados en la bibliografía.
El grado de resolución de la cromatografía bidimensional es mejor comparada con
la unidimensional, se observan más manchas y de forma más clara
Los aminoácidos que tienen el valor de Rf más alto son los menos polares pues
interactúan en menor medida con la fase estacionaria.
Bibliografía.
• Fieser L.F; Fieser M; Química Orgánica Fundamental, (1985) España; Editorial
REVERTÉ; Pp. Consultadas 318-319.
• Harper; Bioquímica Ilustrada; (2003); China; 29° Edición, Editorial Mc Graw Hill;
Pp (29).
• http://alimentos.org.es/aminoacidos-mandarina.