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Actividad antibacteriana de la cáscara de cacao, Theobroma

cacao L

Antibacterial activity of the cacao bean husk, Theobroma


cacao L

Oscar Cuéllar G,1Tecnol Quím, Gloria Guerrero A, 1* Ph.D.

1Universidad Tecnológica de Pereira. Facultad de Tecnología. Escuela


de Tecnología Química. Grupo de Oleoquímica. Pereira, Colombia.

*Correspondencia: gguerrero@utp.edu.co

Recibido: Agosto de 2011; Aceptado: Febrero de 2012.

ABSTRACT

Objective. To test the antibacterial activity of different fractions of


cacao bean husk (Theobroma cacao L.). Materials and
methods.Antibacterial activity of different fractions of cacao bean
husk was analyzed using agar diffusion method with native and ATCC
strains. These fractions were studied by HPLC and
GC/MS. Results. The Chloroform fraction exhibited antibacterial
activity through an inhibition percentage of 34.90% (100 µg/µl)
for Bacillus cereus ATCC 11778 and 52.40% (100 µg/µl)
for Streptococcus agalactiae (native). It also showed 512 µg/ml as a
minimum inhibitory concentration for Bacillus cereus and 128 µg/ml
for Streptococcus agalactiae. Conclusions. This research is the first
report known in Colombia about cacao bean husk exhibiting in
vitro antibacterial activity, which is an important advance for the
cacao industry. This work opens the door for further related studies
to determine the spectrum of inhibition with other microorganisms.

Keywords: Antibacterial activity, Bacillus cereus, Streptococcus


agalactiae (Source: DeCS).

RESUMEN

Objetivo. Evaluar la actividad antibacteriana de diferentes fracciones


de la cáscara de cacao (Theobroma cacao L.). Materiales y
métodos. Se evaluó la actividad antibacteriana mediante el método
de difusión en agar de diferentes fracciones de la cáscara de cacao,
empleando cepas autóctonas y de referencia ATCC. Posteriormente,
se hizo un análisis de estas fracciones por cromatografía líquida de
alta eficiencia y cromatografía de gases acoplada a espectrometría de
masas. Resultados. La fracción clorofórmica presentó actividad
antibacteriana frente a Bacillus cereusATCC 11778 y Streptococcus
agalactiae (autóctona), con porcentajes de inhibición de 34.90% (100
µg/µl) y 52.40% (100 µg/µl) respectivamente. También se evidenció
una concentración mínima inhibitoria de 512 µg/ml frente a Bacillus
cereus ATCC 11778 y de 128 µg/ml frente a Streptococcus
agalactiae. Conclusiones. Este trabajo es el primer reporte a saber
en Colombia sobre actividad antibacteriana in vitro de la cáscara de
cacao, el cual resulta ser un avance importante para esta
agroindustria. Esta investigación abre paso a otros estudios
relacionados para establecer el espectro de inhibición frente a otros
microorganismos.

Palabras clave: Actividad antibacteriana, Bacillus


cereus, Streptococcus agalactiae (Fuente: DeCS).

INTRODUCCIÓN

El cacao (Theobroma cacao L.) pertenece a la familia Sterculiaceae,


es una planta que crece en una franja geográfica fundamentalmente
tropical y se extiende 20° de latitud hacia ambos hemisferios. Se
clasifica en dos grandes grupos: Criollo y Forastero y según la
Organización Internacional del Cacao (ICCO), esta última es una
variedad con gran crecimiento, debido a la mayor facilidad para su
siembra y manejo (1). El cacao se utiliza principalmente para la
producción de chocolate siendo el continente Africano el mayor
productor con el 59% de la oferta mundial, liderado por Costa de
Marfil con 1.000.000 de toneladas que representan el 34% de la
producción mundial (2).

El grano de cacao y las hojas del árbol han sido estudiados por
diversos autores en lo que se refiere a la composición química de
fenoles, alcaloides, ácidos grasos y carbohidratos (3,4), también se
han reportado estudios de actividad antioxidante (5), de la
caracterización química de la manteca de cacao así como de sus
aplicaciones (6). Respecto a la cáscara de cacao que es el principal
desecho de esta industria, se han desarrollado estudios donde se
utiliza para la alimentación de porcinos y gallos (7,8), como fuente
comercial de pectinas (9), en la producción de espumas de
poliuretano para uso hortícola (10) y algunos hacen referencia a la
actividad antibacteriana de extractos de la cáscara de cacao frente
aStreptococcus mutans (11,12).

En Colombia, el 25% del cacao producido se clasifica como de sabor y


fino aroma, el cual se emplea para darle características especiales a
los chocolates. El departamento que tradicionalmente ha concentrado
la mayor producción de cacao es Santander con el 30.06% de
participación del total de la producción en el año 2010 de 68.987
toneladas. En ese mismo año 69.7% de las exportaciones de
Colombia se dirigieron principalmente a países del continente
americano como Ecuador, Panamá, Venezuela y Estados Unidos (13).

La manteca de cacao producida en Colombia se utiliza como


ingrediente en la elaboración de productos de chocolatería, y la
cáscara de cacao que se genera luego del proceso de tostado es el
principal desecho en la cadena de producción de chocolate
representando el 10% (14). El contenido de teobromina en la cáscara
de cacao restringe la proporción en que puede ser suministrada como
complemento en la nutrición de rumiantes, debido a la toxicidad de
este alcaloide (15).

Investigaciones recientes en Colombia, indican que la cáscara de


cacao puede ser utilizada como ingrediente principal en la
formulación de galletas para personas con estreñimiento (16),
adicionalmente el mucílago de este desecho puede ser una alternativa
para la clarificación de jugos en la industria panelera (17).

El objetivo del presente trabajo fue buscar nuevas posibilidades de


uso del principal desecho en la producción de chocolate: la cáscara,
evaluando la actividad antibacteriana de diferentes fracciones,
utilizando cepas ATCC y autóctonas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal. Se empleó cáscara residual molida de


cacao, Theobroma cacao L. (mezcla de diferentes tipos de granos
tostados) suministrada por la empresa Casa Luker. Esta fue llevada al
Laboratorio de Oleoquímica de la Universidad Tecnológica de Pereira,
donde se almacenó en bolsas plásticas a 4°C.

Obtención y fraccionamiento del extracto etanol absoluto:


agua (1:1) de la cáscara de cacao. La extracción se llevó a cabo
con cáscara de cacao molida previamente desengrasada con hexano.
Se utilizó como solvente una mezcla de etanol absoluto:agua (1:1).
Se emplearon 20 gramos de cáscara y 100 ml de solvente, usando
agitación magnética, una temperatura de 25°C y un tiempo de
extracción de 2 horas. El extracto crudo se filtró al vacío a través de
papel filtro Whatman No. 4 y el filtrado se conservó protegido de la
luz a 4°C.

Se hizo un fraccionamiento líquido–líquido del extracto crudo


empleando cloroformo, acetato de etilo y n-butanol. En cada caso se
realizaron extracciones sucesivas por triplicado con una relación 1:1
de volumen de extracto vs., volumen de solvente. Las fases orgánicas
obtenidas se filtraron al vacío, se concentraron por rota-evaporación
y el solvente residual se eliminó por corriente de nitrógeno.

Actividad antibacteriana. Se utilizó como blanco dimetilsulfóxido


(DMSO) al 99% y como control de inhibición se empleó ampicilina (25
µg/µl) paraPseudomonas aeruginosa ATCC 27853; amoxicilina (5
µg/µl) para Bacillus cereus ATCC 11778 y Streptococcus
agalactiae aislado de un paciente en el Laboratorio Clínico Patológico
López Correa (Pereira, Colombia); ciprofloxacina (0.125 µg/µl)
para Escherichia coli “resistente a amoxicilina” aislada de pollo y
micostatina (5 µg/µl) para Candida albicans ATCC 10231. La fracción
clorofórmica, en acetato de etilo y butanólica se solubilizaron en
DMSO al 99% a las concentraciones de 100, 50 y 25 µg/µl. El
bioensayo se realizó por el método de difusión en agar, una
modificación del método desarrollado por Kirby-Bauer (18). Cada
bacteria fue replicada en dos tubos de ensayo con el medio líquido
infusión–cerebro–corazón (BHI) y caldo Sauboraud para Candida
albicans ATCC 10231.

Se ajustó la absorbancia a 0.1, que corresponde a 0.5 en la escala Mc


Farland con una concentración de 1.5.108 UFC/ml de las bacterias y
del hongo a una longitud de onda de 540 y 490 nm respectivamente,
empleando un espectrofotómetro Génesis 10 (Marca:
Termospectronic, Fabricante: Termospectronic, Ciudad: New York,
País: USA), y usando como blanco el medio líquido respectivo. Se
adicionaron 100 µl de la bacteria u hongo según el caso a una caja de
Petri, luego se añadieron 25 ml de agar Müeller–Hinton a 50°C. Se
homogenizó, se perforaron 5 pozos los cuales se sellaron con 20 µl
del mismo agar. En el pozo central se adicionó 10 µl de DMSO al 99%
(como blanco), a los cuatro pozos restantes en su orden de izquierda
a derecha se adicionó 10 µl del antibiótico respectivo y la fracción
clorofórmica, en acetato de etilo y butanólica en cada caso a las
concentraciones establecidas anteriormente. Se incubó por 24 horas
a una temperatura de 37°C, utilizando una incubadora VELP (Marca:
Scientifica, Fabricante: Scientifica, Ciudad: Milano, País: Italia). Se
hizo la medición del diámetro del halo de inhibición de la fracción que
fue objeto de estudio con respecto al del control para permitir un
control estadístico del factor inhibitorio.

Determinación de la concentración mínima inhibitoria. Se


utilizó ciprofloxacina como control positivo de inhibición en DMSO al
99% para Bacillus cereus ATCC 11778 y amoxicilina
para Streptococcus agalactiae autóctona. La concentración mínima
inhibitoria se realizó por dilución en microplaca de 96 pozos (19). Se
preparó una solución stock de cada fracción a una concentración de
64000 µg/ml en DMSO al 99%, a partir de esta se hicieron diluciones
sucesivas desde 1024 hasta 1 µg/ml. Se transfirieron 20 µl de cada
una de las concentraciones a los pozos de una fila enumerados del 1
al 11 y se adicionó el blanco en el pozo número 12 (DMSO al 99%).
Cada fracción se repitió en tres filas, se adicionó a cada pozo 220 µl
de medio de cultivo líquido (caldo nutritivo) y 10 µl del
microorganismo ajustado a 0.1 de absorbancia. La lectura inicial se
hizo a contra luz observando turbidez o transparencia después de 4
horas de incubación a 37°C, se tomó como valor de CMI la
concentración del primer pozo que presentó transparencia en cada
fila. Posteriormente se adicionaron 25 µl de Bromuro de 3-(4,5-
dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazoilo (MTT) (con una concentración
de 0.8 mg/ml) utilizando como medio dispersante Triton (con una
concentración de 0.1 g/ml) a cada uno de los pozos con el
microorganismo y se incubó a 37°C. La segunda lectura se hizo a
través de un método colorimétrico. Como prueba confirmatoria se
hizo una siembra por superficie en caja Petri con agar nutritivo, se
adicionó 20 µl del contenido del pozo y se incubó por 24 horas a
37°C, posteriormente se realizó la lectura observando inhibición o
crecimiento.

Análisis preliminar por cromatografía de capa delgada. Las


fracciones clorofórmicas, en acetato de etilo y butanólicas fueron
evaluadas preliminarmente mediante cromatografía de capa delgada.
Para evaluar la presencia de alcaloides, se empleó como fase
estacionaria sílica gel 60 F254, un sistema de elución
cloroformo:metanol (9:1), estándares de teobromina (Sigma ≥99%,
T4500), cafeína (Sigma Reference Standard, C1778) y teofilina
(Sigma Anhydrous ≥ 99%, T1633). Para los compuestos fenólicos se
utilizó como sistema de elución cloroformo:metanol:agua en
proporción (7:13:8), un estándar de ácido ferúlico (Aldrich 99%,
128708). En ambos casos se reveló con luz ultravioleta a longitud de
onda corta (270nm).

Análisis de alcaloides y compuestos fenólicos por


cromatografía líquida de alta eficiencia. Para el análisis de las
diferentes fracciones se empleó un equipo marca Jasco HPLC 2000
Plus (Fabricante: Jasco Corporation, Ciudad: Tokyo, País: Japón),
equipado con una bomba de gradiente cuaternario (PU–2089Plus),
automuestreador (AS–2059 Plus), horno para columna (CO–2065
Plus), detector de arreglo de diodos (MD–2015 Plus), controlado por
software EZCrhom Elite. Se utilizó una Columna Ultra-Aqueous RP–18
RESTEK. Se empleó como fase móvil ácido fosfórico al 0.05% (A) y
acetonitrilo al 5% (B). Se hizo una elución isocrática con 95% de A
los primeros 5 minutos, luego con gradiente lineal hasta alcanzar
75% a los 15 minutos y finalmente se mantuvo isocrático por 5
minutos más para un tiempo total de análisis de 20 minutos. Se
empleó un tiempo de re-equilibrio de 5 minutos entre cada corrida.
La columna se mantuvo a 40°C, se utilizó un flujo de 0.5 ml/min, un
volumen de inyección de 10 µl y un rango de longitud de onda para la
adquisición de datos entre 230 a 450 nm.

Detección y cuantificación de alcaloides y compuestos


fenólicos. La detección de alcaloides en las fracciones se hizo por
comparación con el tiempo de retención de estándares de teobromina
(Sigma ≥99% T4500), cafeína (Sigma Reference Standard, C1778) y
teofilina (Sigma anhydrous ≥99%, T1633), eluidos en las mismas
condiciones. Para los compuestos fenólicos la detección se realizó
empleando un estándar de ácido ferúlico (Aldrich 99%, 128708) que
fue analizado bajo las mismas condiciones.

La cuantificación de alcaloides y compuestos de tipo fenólico se hizo


por el método del estándar externo. Se realizaron curvas de
calibración por triplicado, empleando un rango de concentraciones de
6.25 a 200 µg/ml con los estándares respectivos. Los parámetros
estadísticos fueron: teobromina: Y=87684.9x+135855,
R2=0.999292, D.S=4875.78, LD=0.16 µg/ml, LC=0.55 µg/ml;
teofilina: Y=61342.1x+91287.2, R²=0.999189, D.S=3285.51,
LD=0.16 µg/ml, LC=0.54 µg/ml; cafeína: Y=62519.4x+107980,
R²=0.999212, D.S=3890.13, LD=0.19 µg/ml, LC=0.64 µg/ml; ácido
ferúlico: Y=32520,6x+42144, R²=0.999336, D.S=1980.09, LD=0.18
µg/ml, LC=0.61 µg/ml. (LD= Límite de detección, LC= Límite de
cuantificación, D.S= Desviación estándar).

Análisis por cromatografía de gases/espectrometría de masas


de la fracción de alcaloides. Se empleó un cromatógrafo marca
Shimadzu QP-2010 (Fabricante: Shimadzu Corporation, Ciudad:
Kioto, País: Japón), equipado con un autoinyector (AOC20i)/
automuestreador (AOC-20s, Split 1:20), acoplado a un detector de
masas, modo de ionización de impacto electrónico a 70eV, controlado
por software GC-MS solution. Se utilizó una Columna capilar Rtx–5 Sil
MS. El horno se programó con una temperatura inicial de 100°C por 2
minutos, luego se incrementó en una tasa de 10°C por minuto hasta
alcanzar una temperatura final de 320°C que se mantuvo por 10
minutos para un tiempo total de análisis de 34 minutos.

RESULTADOS

Actividad antibacteriana de la fracción clorofórmica. El


porcentaje de inhibición frente a B. cereus fue de 34.90% con la
fracción clorofórmica empleando una concentración de 100 µg/µl y
31.70% a una concentración de 50 µg/µl (Figura 1A).
Como se aprecia en la figura 1B, la fracción clorofórmica frente a S.
agalactiae presentó porcentajes de inhibición del 33.30% (25 µg/µl),
47.80% (50 µg/µl) y del 52.40% (100 µg/µl), destacándose que no
hubo gran diferencia entre los dos últimos; lo que podría indicar que
a concentraciones mayores de 50 µg/µl no se obtendría un
incremento considerable de la actividad inhibitoria; sin embargo, se
requiere de un estudio detallado frente a este microorganismo que
permita establecer con certeza este comportamiento.
En cuanto a los resultados de concentración mínima inhibitoria, la
fracción clorofórmica presentó frente a Bacillus cereus un valor de
512 µg/ml, mientras que frente a Streptococcus agalactiae fue de
128 µg/ml, apreciándose que esta última bacteria es más sensible
que B. cereus al momento de ser evaluada su capacidad para
reproducirse, en presencia de componentes antimicrobianos en su
medio.

La fracción clorofórmica generó un efecto bacteriostático sobre la


cepa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (Figura 2) en cada una
de las concentraciones empleadas, se encontró un halo con algunas
colonias bacterianas alrededor de cada una uno de los pozos,
disminuyendo el crecimiento de esta bacteria.

Análisis químico de la fracción clorofórmica. Según el análisis


preliminar por cromatografía de capa delgada esta fracción contiene
alcaloides. Se evidenció la presencia de teobromina de Rf de 0.85 y
de teofilina con un Rf de 0.36 según los estándares analizados en las
mismas condiciones.

Análisis por CLAE de la fracción clorofórmica. Como se aprecia


en la figura 3, en el perfil cromatográfico por CLAE de la fracción
clorofórmica, se encontraron teofilina, teobromina y cafeína con base
en los tiempos de retención de los estándares y el espectro
ultravioleta característico de alcaloides a 270 nm.
Los resultados del análisis cuantitativo (Tabla 1), indicaron que el
compuesto mayoritario en la fracción clorofórmica fue la cafeína. La
teobromina se identificó pero no fue posible su cuantificación porque
la concentración estuvo por debajo del límite de cuantificación del
método.

Análisis por CG/EM de la fracción clorofórmica. El análisis se


hizo de manera complementaria. En el perfil obtenido (Figura 4), se
aprecia un pico bien resuelto con un tiempo de retención de 14
minutos que según la comparación con la base de datos Willey 7
versión 2 correspondía a cafeína con un porcentaje de similitud del
96% y el espectro de masas presentó los fragmentos característicos
de la cafeína m/z 194 (pico base), m/z 165, m/z 137, m/z 109, m/z
82, m/z 67 y m/z 55.
Análisis químico de las fracciones de acetato de etilo y
butanólica. Según el análisis preliminar por cromatografía de capa
delgada, se evidenció en ambos casos una mancha de Rf 0.84
revelada con luz ultravioleta y el ácido ferúlico empleado como
referencia reveló con Rf 0.87, lo que podría indicar la presencia de
compuestos de tipo fenólico.

Análisis por CLAE de las fracciones de acetato de etilo y


butanólica. Como se aprecia en la figura 5, las dos fracciones
presentaron perfiles cromatográficos similares. En ambos se
encontraron 5 picos comunes, cuatro de ellos con tiempos de
retención entre 1.3 a 2.7 minutos que de acuerdo con su espectro
ultravioleta (máximos de absorbancia entre 250 y 380 nm), pueden
corresponder a compuestos de tipo fenólico y un compuesto de
tiempo de retención de 5.1 minutos el cual fue identificado según su
espectro (máximo de absorbancia a 270 nm) como un alcaloide y por
comparación con el tiempo de retención del estándar como teofilina.

Falta Figura 5
Según la cuantificación de estos compuestos (Tabla 2), el mayoritario
(5.1* min) fue la teofilina y las concentraciones de los compuestos de
tipo fenólico se encontraron en un rango de 3.31 µg/ml a 14.32
µg/ml.
Actividad antibacteriana de las fracciones de acetato de etilo y
butanólica. Estas fracciones no presentaron ningún efecto inhibitorio
sobre los microorganismos objeto de estudio.

DISCUSIÓN

La fracción clorofórmica resultó promisoria ya que presentó actividad


antibacteriana frente a los microorganismos Gram positivos
estudiados. De acuerdo con los valores de concentración mínima
inhibitoria encontrados (512 µg/ml frente a Bacillus cereus ATCC
11778 y 128 µg/ml frente aStreptococcus agalactiae, según la
clasificación de otros autores (20), esta fracción se consideraría como
un potente inhibidor. La actividad biológica que exhibió esta fracción
puede atribuirse en parte al efecto sinérgico de los alcaloides que la
constituyen puesto que existen reportes que evidencian esta
característica de este grupo de compuestos (21,22); sin embargo, se
requieren otros estudios para profundizar sobre esta actividad.

De otra parte, la fracción clorofórmica presentó efecto bacteriostático


frente al microorganismo Gram negativo P. aeruginosa ATCC 27853,
observándose en cada pozo un halo circundante de color brillante con
presencia de algunas colonias bacterianas observándose que se
inhibió el crecimiento de esta bacteria; este resultado concuerda con
lo reportado por otros autores (23), que indican, que este
microorganismo presenta una alta resistencia a los agentes
antimicrobianos; luego sería importante en próximos estudios evaluar
concentraciones diferentes de esta fracción a las utilizadas en el
presente trabajo que permitan establecer su potencial bactericida.

Los resultados del análisis cuantitativo por CLAE de la fracción


clorofórmica de la cáscara de cacao, indicaron que el alcaloide
mayoritario fue la cafeína, otros autores han reportado a la
teobromina como el alcaloide principal en todo el grano de cacao
(24), pero no se encontraron estudios de la distribución de estas
metilxantinas en la cáscara; Sin embargo, como indican otros autores
(25), la baja solubilidad de la teobromina en solventes polares
favoreció el enriquecimiento de cafeína y teofilina en el extracto
etanol agua 1:1 obtenido. Además, según estudios muy recientes
(26) la cafeína y teofilina forman un complejo con características
químicas que podría llegar a correlacionarse en estudios posteriores
con la actividad antibacteriana exhibida por esta fracción.

El análisis por cromatografía de gases acoplado a espectrometría de


masas confirmó la presencia de cafeína como el alcaloide mayoritario
en la fracción clorofórmica, según sus fragmentos característicos
(27).

Las fracciones en acetato de etilo y butanólica no presentaron


actividad antibacteriana. Si bien fue posible evidenciar la presencia de
compuestos de tipo fenólico con base en su espectro ultravioleta
(28), los cuales según reportes de otros autores han exhibido
actividad antibacteriana (29); es probable que la concentración de
estos compuestos en las fracciones estudiadas y/o el hecho de que
puedan encontrarse formando glicósidos como lo han indicado
estudios previos en el cacao (30), afecte de alguna forma su
actividad. Luego sería conveniente realizar nuevos análisis llevando a
cabo una hidrólisis de la cáscara de cacao, previa a la extracción para
evaluar su actividad.

En conclusión, la fracción clorofórmica resultó promisoria inhibiendo


el crecimiento de Bacillus cereus ATCC 11778 y Streptococcus
agalactiae, por tanto, este trabajo es el primer reporte conocido en
Colombia sobre actividad antibacteriana in vitro de la fracción
clorofórmica de la cáscara de cacao; el cual resulta ser un avance
importante para esta agroindustria. Esta investigación abre paso a
otros estudios relacionados para establecer el espectro de inhibición
frente a otros microorganismos.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Casa Luker por suministrar la cáscara de


cacao, a la Vicerrectoría de Investigación y Extensión de la
Universidad Tecnológica de Pereira por financiar la investigación, al
Laboratorio de Calidad de Productos Naturales de la Universidad
Tecnológica de Pereira por los análisis cromatográficos y al
Laboratorio Clínico-Patológico López Correa (Pereira, Colombia) por la
donación del microorganismo Streptococcus agalactiae.

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Composition and antibacterial activity of essential oils
obtained from plants of theLamiaceae family against
pathogenic and beneficial bacteria¤

Composición y actividad antibacteriana de aceites esenciales


obtenidos de plantas de la familiaLamiaceae contra bacterias
patógenas y benéficas

Composição e atividade antibacterina de azeites essenciais


obtidos de plantas da família Lamiaceae contra bactérias
patogênicas e benéficas

Lina P Roldán1, MV; Gonzalo J Díaz, MV, PhD1* ; Jennifer M Duringer2, PC, PhD

1
Laboratorio de Toxicología, Facultad de Medicina Veterinaria y de
Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C. Colombia. 2Department
of Environmental and Molecular Toxicology, Oregon State University, Corvallis,
Oregon, United States.

(Received: 27 june, 2010; accepted: 31 august, 2010)

Summary

The qualitative composition and antibacterial activity of six essential oils obtained
from plants cultivated in the Colombian Andes (Mentha spicata, Mentha
piperita, Ocimum basilicum, Salvia officinalis, Rosmarinus officinalis and Thymus
vulgaris) and a commercial essential oil of Origanum vulgare subsp. hirtum were
investigated. The essential oil composition was determined by gas chromatography-
mass spectrometry (GC-MS), while the antibacterial activity of the essential oils
against Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella
typhimurium, Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium breve was measured as
the minimum bacte icidal concentration (MBC) using the agar dilution method. The
chemical analysis revealed the presence of 16-28 compounds in each oil,
corresponding mainly to phenols, oxygenated and hydrocarbon
monoterpenes. O. vulgare and T. vulgaris oils were active at low MBCs(MBC ≤ 5
mg/ml) against all bacteria evaluated, including beneficial microorganisms. In
contrast, O. basilicum oil was more active against pathogenic bacteria (MBCs ≤
10mg/ml) than beneficial bacteria (MBCs of 80 mg/ml). The present study shows
that the antimicrobial potential of essential oils depends not only on the chemical
composition of the oil but also on the targeted microorganism. This has important
practical implications for essential oils intended to be used as feed additives with
antibacterial properties for animal nutrition or pharmaceutical products with natural
compounds.

Key words: antibacterial activity, essential oils, Lamiaceae family.


Resumen

Se investigó la composición cualitativa y la actividad antibacteriana de seis aceites


esenciales obtenidos de plantas cultivadas en los Andes Colombianos (Mentha
spicata, Mentha piperita, Ocimum basilicum, Salvia officinalis, Rosmarinus
officinalis y Thymus vulgaris) y un aceite esencial comercial de Origanum
vulgare subsp. hirtum. La composición de los aceites esenciales fue determinada
por cromatografía de gasesespectrofotometría de masas (CG-EM), mientras que la
actividad antibacteriana de los aceites esenciales contra Escherichia coli, Salmonella
enteritidis, Salmonella typhimurim, Lactobacillus acidophilus y Bifidobacterium
breve, fue medida como la concentración mínima bactericida (CMB) usando el
método de dilución en agar. Los análisis químicos revelaron la presencia de16 – 28
compuestos en cada aceite, correspondiendo principalmente a monoterpenos
fenolicos, oxigenados e hidrocarbonos. Los aceites de O. vulgare y T.
vulgaris fueron activos contra todas las bacterias evaluadas, incluyendo
microorganismos benéficos a CMBs bajas (CMB ≤ 5 mg/ml). En contraste, el aceite
de O. basilicum fue más activo contra bacterias patógenas (CMBs ≤ 10 mg/ml) en
comparación de bacterias benéficas (CMBs de 80 mg/ml). El presente estudio
demostró que el potencial antimicrobiano de los aceites esenciales no depende solo
de la composición química del aceite sino también del microorganismo por sí
mismo. Estos resultados tienen implicaciones prácticas para los aceites esenciales
usados como aditivos alimenticios con propiedades antibacterianas para la nutrición
animal o productos farmacéuticos con compuestos naturales.

Palabras clave: aceites esenciales, actividad antimicrobiana, familia Lamiaceae.

Resumo

Pesquisou-se a composição qualitativo e a atividade antibacteriana de seis azeites


essenciais obtidos de plantas cultivadas nos Andes Colombianos (Mentha
spicata, Mentha piperita, Ocimum basilicum, Salvia officinalis, Rosmarinus
officinalis e Thymus vulgaris) e um azeite essencial comercial de Origanum
vulgare subsp. hirtum. A composição dos azeites essenciais foi determinada por
cromatografía de gases -espectrofotometría de massas (CM-EM), enquanto a
atividade antibacteriana dos azeites essenciais contra Escherichia coli,Salmonella
enteritidis, Salmonella typhimurim, Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium
breve foi medida como a concentração mínima bactericida (CMB) usando o método
de diluição em ágar. As análises químicas revelaram a presença de16 – 28
compostos em cada azeite, correspondendo principalmente à monoterpenos
fenólicos, hidrocarbonetos e oxigenados. Os azeites de O. vulgare e T.
vulgaris foram ativos contra todas as bactérias testadas, incluindo
microorganismos benéficos a CMBs baixas (CMB ≤ 5 mg/ml). Em contraste, o
azeite de O. basilicum foi mais ativo contra bactérias patogénicas do que bactérias
benéficas (CMBs de 80 mg/ml). Este estudo demonstrou o potencial antimicrobiano
dos azeites essenciais depende da composição química do azeite e o
microorganismo próprio. Estes resultados têm implicações práticas para os azeites
essenciais usados como aditivos alimentícios com propriedades antibacterianas para
a nutrição animal ou produtos farmacêuticos com produtos naturais.
Palavras chave: atividade antibacteriana, azeites essenciais, familia Lamiaceae.

¤ To cite this paper: Roldán LP, Díaz GJ, Duringer JM. Composition and antibacterial
activity of essential oils obtained from plants of the Lamiaceae family against
pathogenic and beneficial bacteria. Rev Colomb Cienc Pecu 2010;23:451-461.

* Corresponding author: Gonzalo J Díaz. laboratorio de Toxicología, Facultad de


Medicina Veterinaria y de Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá,
D.C., Colombia. E-mail: gjdiazg@unal.edu.co

Introduction

Manipulation of the gut function and antimicrobial habitat of domestic animals with
feed additives has been recognized as an important tool for improving growth
performance and feed efficiency (Collington et al., 1990). Since the prohibition of
antibiotic growth promoters (AGPs) in the European Union (regulation
EC/1831/2003 banned the use of in-feed antibiotics in the EU as from January
2006), a diverse group of phytogenic additives has been evaluated as potential
substitutes of AGPs in order to maintain the same production standards. Among
these compounds are the essential oils (EOs) obtained from several classes of
plants (Hertrampf, 2001).

Essential oils are volatile secondary metabolites isolated from plant tissues either
by hydro- or steam distillation. Among plant species containing large amounts of
EOs are plants from the families Asteraceae, Apiaceae, Lamiaceae (Labiatae),
Lauraceae, Liliaceae, Mirtaceae, Magnoliaceae, Rutaceae and Pinaceae (Jones,
2002). The main constituents of essential oils are mono-and sesquiterpenes and
some of these compounds have shown antibacterial, antifungal and antioxidant
activities (Lee and Ahn, 1998).

Studies conducted with poultry have shown that EOs are able to improve growth
performance and prevent gastrointestinal diseases such as colibacilosis, necrotic
enteritis and coccidiosis (William and Losa, 2001). Compounds of particular
importance that have shown specific biological activities are the phenolic
monoterpenes, carvacrol and thymol, which are particularly abundant in the EO
from oregano and thyme (Basilico and Basilico, 1999). Other compounds with
antibacterial properties found in EOs are eugenol, α-and β- pinene, R- and S-
limonene, 1,8 cineole, borneol, estragol and p-cymene (Mourey and Canillac, 2002;
Bagamboula et al., 2004).

In order to test EOs antimicrobial activity, human and food-borne pathogens are
most frequently chosen. Commonly tested pathogenic bacteria include two Gram-
positive bacteria (Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus), as well as three
Gram-negative bacteria (Escherichia coli, Salmonella spp. and Pseudomonas
aeruginosa) (Kalemba and Kunicka, 2003). Benefic bacteria are rarely chosen, even
though it is important to investigate the effects of EOs on the normal beneficial
microflora.

The objectives of the present work were to characterize the EOs composition of six
plants of the Lamiaceae family cultivated in the Colombian Andes (for gas
chromatography-mass spectrometry) and to investigate the antimicrobial activity of
these EOs against selected pathogenic and benefic microorganisms.

Materials and methods

Plant material

The following species from the Lamiaceae family were evaluated: Ocimum
basilicum (basil), Salvia officinalis (sage), Rosmarinus
officinalis (rosemary), Thymus vulgaris (thyme), Mentha spicata (spearmint)
and Mentha piperita (mint). The plants were grown at the experimental station of
the College of Agriculture, National University of Colombia in the Bogotá campus
located at 2630 m above sea level, from September 2008 to January 2009. A
commercially available essential oil (EO) from Origanum
vulgare subsp. hirtum(Reganotm, Racol Nutrition Inc, Marshal, MN, USA) was also
analyzed and its antibacterial activity compared to the EOs under study. EO from O.
vulgare was chosen because this EO has been reported to have strong antimicrobial
activity (Tsao et al., 2007).

Essential oil extraction

Aerial parts (5 kg) of fresh plants were subjected to steam distillation in a semi-
industrial stainless steel apparatus with recirculation of the condensed water for 2
hours in order to obtain the essential oils. The extracts were stored in amber vials
and kept refrigerated at 4oC prior to further analysis.

Gas chromatography-mass spectrometry (GCMS)

Samples were diluted 1:40 with ethyl acetate and a standard alkane mixture (C 10-
C40, Fluka Analytical, Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland) was added in order to
determine the Kovat’s retention indices (RI). GC-MS analysis was performed using
a Perkin Elmer AutoSystem XL GC apparatus attached to a PE-5MS fused silica
capillary 5% diphenyl/95% dimethylpolysiloxane column (30 m x 0.25 mm, 0.25
µm film thickness, Perkin Elmer). The column temperature was initially 40 ºC, held
for 2 min, then ramped from 40-250 ºC at 3 ºC/min. Helium (1.0 ml/min) was used
as the carrier gas. Line and injector temperature were set at 225 ºC and 250 ºC,
respectively.

Samples (2 µl) were injected using a PSSI injector in the split mode (1:40). MS
conditions were run in EI+ through a Perkin Elmer TurboMass Upgrade mass
spectrometer as follows: ionization energy -70 eV; scan rate 1.6 scans/sec;
interscan delay 0.01 sec; source temperature 200 ºC; mass range 20 to 400 m/z;
solvent delay 3.00 min. The RI of the compounds were calculated based on the
retention time of the C10n-alkanes. Quantitative -C40 data were calculated by
obtaining the peak area from total ion chromatogram using the TurboMass 5.1
software program (Perkin Elmer Inc., Waltham, MA, USA), while qualitative data
were obtained by comparing spectra to those in the Wiley NIST/EPA/ NIH Mass
Spectral Library 2005.

Test organisms and preparation of the inocula

Bacteria were obtained from the culture collections of the National Laboratory of
Veterinary Diagnostic of Colombian Agricultural Institute (CEISA-ICA) in Bogota,
Colombia, which were American Type Culture Collection ATCC. The pathogenic
bacterial strains used were the Gramnegative microorganisms Escherichia coli ATCC
25922, Escherichia coli O157, Salmonella enteritidis ATCC 13076, andSalmonella
typhimurium ATCC 14028. Additionally, the Gram-positive beneficial
bacteria Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 andBifidobacterium breve ATCC 15700
were also tested. Gram-negative strains were incubated in Tryptic Soy Broth
(Merck, Darmstadt, Germany) at 37 oC for 24 h. Gram-positive strains were
incubated in MRS Broth (MRSB, Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK) at 37 oC for 48
and 72 h for L. acidophilus and B. breve, respectively. The bacterial cells were
harvested, centrifuged to a pellet, washed, re-suspended in Peptone Buffer Solution
and diluted to a concentration of 1x10 6 CFU/ml.

Determination of minimum bactericidal concentration (MBC)

For the determination of the MBC, the agar dilution susceptibility assay was used,
as recommended by the National Committee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS, 1999). MBC was defined as the lowest concentration where 99.9% o more
of the initial inoculum is killed after an incubation time (Burt, 2004). A stock
solution of 16% (w/v) of each EO was prepared with Tween 80 (Sigma-Aldrich, St
Louis, MO, USA) and sterile water. Before agar dilution method was performed, the
micro-dilution broth assay was conducted (NCCLS, 1999). In micro-dilution broth
assay, all tests for Gram-negative bacteria were performed in Mueller Hinton Broth
(MHB; Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) while L. acidophilus and B. breve were
tested in MRSB. A series of two-fold dilutions of each oil were carried out in 96-well
microtitre plates over the range of 0.078 to 80 mg/ ml. The inocula were then
added to the plates, which were incubated under normal atmospheric conditions, at
37 oC for 24 h and 48 h for Gramnegative bacteria and L. acidophilus, respectively.

B. breve was incubated in anaerobic conditions (Anaerogen, Oxoid, Basingstoke,


Hampshire, UK) at 37 oC for 72 h. Bacterial growth was indicated by the presence
of a white pellet at the well bottom. The lowest concentration that completely
inhibits the visible growth of microorganisms was defined as the minimum
inhibitory concentration (Delaquis et al., 2002).

After incubation, 10 µl of each well were seeded on McConkey Agar (Oxoid) in the
case of Gramnegative bacteria and MRS Agar (Oxoid) for Lact. acidophilus and Bif.
breve, after which they were incubated again for 24, 48 and 72 h, respectively.
Total absence of bacterial colonies on the agar plate was determined as the MBC.
Both growth controls (containing inocula but no EOs) and negative control
(containing EOs but not inocula) were included into each microtitre and agar plates.
Streptomycin was used as antibacterial control. Every assay was carried out in
triplicate.

Results

Essential oil yields

The EO yield of each plant was expressed as a percentage (v/w) in relation to fresh
plant material weight. In general, all plants yielded less than 1% EO and the
average yields values were as follows: Rosmarinus officinalis: 0.82%, Salvia
officinalis: 0.64%, Thymus vulgaris: 0.48%, Ocimum basilicum: 0.1%, Mentha
piperita: 0.1% and Mentha spicata: 0.08%.

GC-MS analysis
Table 1 summarizes the results of the seven EOs analyzed (six selected plants plus
the commercial oregano oil). The components were organized by elution time from
a PE-5MS column. The compounds identified account for 94-99% of the chemical
components in the EOs. In all EOs analyzed, the majority of the compounds
corresponded to monoterpenes, either phenols, oxygenated or hydrocarbon.
The monoterpenes hydrocarbons, α-and β-pinene and β-myrcene were present in
most of the EOs analyzed. Sesquiterpenes were found in much lesser amounts (a
range of 0.8-8.6%). In T. vulgaris and O. vulgare EOs, 28 and 16 compounds were
detected and identified, respectively. The major components of these EOs were the
monoterpene phenols thymol and carvacrol. Thymol (30.61%) and γ-terpinene
(27.31%) were the major components of T. vulgaris EO and carvacrol (85.28%)
and p-cymene (4.75%) the major ones of O. vulgare EO. In R. officinalis EO a total
of 22 compounds were identified. Oxygen containing monoterpenes such as 1,8-
cineole or eucalyptol (28.05%) and camphor (12.25%), were the major
components. The analysis of M. spicata, S. officinalis and O. basilicum EOs showed
the presence of 24, 25 and 28 different compounds, respectively. The M.
spicata EO, was found to be highly rich in oxygenated monoterpenes (67.91%),
mostly D-carvone (61.53%) and 1,8-cineole (3.37%). Another important
component of this EO was limonene (12.57%) a monoterpene hydrocarbon. In S.
officinalis EO, α-thujone (29.53%) and 1,8-cineole (21.79%) were the major
compounds present, while β-linalool (46.67%) and estragole (27.43%) were the
major compounds of O. basilicum EO. Finally, oxygenated monoterpenes such as
pulegone (44.54%) and iso-menthone (26.15%) were the main compounds found
in M. piperita EO.

Minimum Bactericidal Concentration (MBC)


Table 2 summarizes the antimicrobial activity of the EOs evaluated. All bacterial
strains showed sensitivity to the EOs tested. Some EOs had greater antibacterial
activity than others or showed a differential activity depending on the type of
microorganism (pathogenic or beneficial). S. officinalis EO was active against all
bacteria concentrations tested with MBCs of ≥ 40 mg/ ml; R. officinalis EO was also
active against all bacteria but had greater activity against E
coli than S. officinalis EO. M. spicata and M. piperita EOs were the only ones that
had no activity against the beneficial bacterium L. acidophilus at the tested (up to
80 mg/ml). O. basilicum EO was more active against Gram-negative pathogenic
bacteria (MBC ≤ 10mg/ml) than Gram-positive beneficial bacteria (MBCs of 80
mg/ml). O. vulgare and T. vulgaris EOs were the most efficient bacterial growth
inhibitors, with MBCs of ≤ 5 mg/ml for all strains tested. None of the EOs tested
had greater antibacterial activity than streptomycin, but the O. vulgare EO
inhibited S. enteritidis growth at the same concentration of streptomycin (0.078
mg/ml). In general, Gram-negative bacteria were more sensitive to the EOs
evaluated than to Gram positive.

Discussion

In general, the chemical composition of the EOs obtained from the plants of the
Lamiaceae family cultivated in the Colombian Andes and selected for the present
study was comparable with previous reports from other countries. However, some
important differences were found. Previously reported chromatographic profiles of
EOs obtained by hydrodistillation, steam distillation or ethanol extraction of aerial
parts of T. vulgaris, O. vulgare, M. spicata, S officinalis and O. basilicum are similar
to the ones obtained in the present study (Adam et al., 1998; Aligiannis et
al., 2001; Lee et al., 2005; Sokovic et al., 2009; Dob et al., 2007; Chauhan et
al., 2009). However, the main components of R. officinalis and M. piperita EO were
different to previous reports. In R. officinalis EO, α-pinene had been reported as the
major component (30-35%) followed by 1,8-cineole (14-20%) and camphor (7-
12%) (Djeddi et al., 2007; Özcan and Chalchat, 2008; Jamshidi et al., 2009);
menthol and menthone (>25%) had been reported as the major components of M.
piperita EO (Iscan et al., 2002; Yadegarinia et al., 2006).

In contrast, in the present study, 1,8-cineole (28.05%) and pulegone (44.45%)


were the major components of R. officinalis and M. piperita EO, respectively.
Genetic and biochemical differences among specific cultivars of the same botanical
species could explain these differences (Putievsky, et al., 1988; Tholl, 2006;
Degenhardt et al., 2009). Other factors that may influence the chemical
composition of a particular EO are climatic, seasonal and geographic conditions
(Baydar et al., 2004). Additionally, both the oil yield and the relative composition of
the constituents of an EO may vary greatly according to the developmental phase
of the plant (Miguel et al., 2004). The Lamiaceae family is one of the most
important ones in regards to the production of EOs with antimicrobial and
antioxidant properties (Tsao et al., 2007). The content of active substances in the
EO determines its in vitro and in vivo efficacy. However, the susceptibility of a
microorganism to an EO depends not only on the properties of the EO but also on
the microorganism itself. It is generally accepted that EOs are more active against
pathogenic Gram-positive than against pathogenic Gram-negative bacteria
(Lemos et al., 1990, Smith-Palmer et al., 1998, Mitsch et al., 2004, Burt and
Reinders, 2003); however, in some studies, Gramnegative bacteria have been more
sensitive (Kim et al., 1995, Hayes et al., 1997).

In the present study, all EOs tested were active against the Gram-negative
pathogenic bacteria tested. In regards to beneficial bacteria, Horosova et
al. (2006), found that oregano EO exhibited a strong bactericidal effect against
chicken lactobacilli. The present study supports this finding since O. vulgare EO
(and also T. vulgaris EO) had the lowest MBC (<5 mg/ml) against all strains tested,
including the beneficial bacteria. This strong antibacterial action has been attributed
to the phenolic monoterpenes carvacrol and thymol, which have similar, synergistic,
and non-selective antimicrobial activity (Michiels, 2009). Additionally, there is also
a possible synergistic effect with other minor components such as the monoterpene
hydrocarbons γ-terpinene and p-cymene (Burt, 2004), which are biosynthetic
precursors of thymol and carvacrol (Burt, 2004; Ultee et al., 2002). For
example, p-cymene is a very weak antibacterial compound but it swells bacterial
cell membranes to a greater extent than carvacrol does. By this mechanism p-
cymene probably enables carvacrol to be more easily transported into the bacterial
cell so that a synergistic effect is achieved when both compounds are
simultaneously present (Ultee et al., 2002; Rota et al., 2008).

The results of the present study confirm previous studies where oregano and thyme
EOs had been highly active against important pathogenic bacteria such
as Escherichia coli, Salmonella typhimurium and Clostridium
perfringens (Hammer et al., 1999; Kamel, 2000; Marino et al., 2000; Dorman and
Deans, 2000, Burt and Reninders, 2003). On the other hand, the present study also
shows that oregano and thyme EOs are highly active against the beneficial
bacteria Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium breve, which is an
undesirable effect. These findings however, are in contrast of those of Si et
al., (2006) who reported that eugenol, cinnamon, thymol and carvacrol were less
active against lactobacilli and bifidobacteria in relation to pathogen bacteria
(Escherichia coli andSalmonella typhimurium). A possible explanation for this
discrepancy is the differences in the methodology employed by Si et al., (2006) and
the use of a purified compound rather than the whole essential oil, which contains a
diverse mixture of compounds (16 for oregano and 28 for thyme in this study).

The gut microflora (bifidiobacteria and lactobacilli) are often considered to play an
important role in metabolic activities that result in salvage of energy and
absorbable nutrients, important trophic effects on the intestinal epithelium and on
immune structure and function. Also, these bacteria protect the colonized host
against invasion by alien microbes. The imbalance of native gut flora might also be
an essential factor in certain pathological disorders, including multisystemic organ
failure, colon cancer, and inflammatory bowel diseases (Lee and Ahn, 1998;
Guarner and Malagelada, 2003). Due to these protective and positive roles, it is
highly desirable that growth promoter substances do not have an inhibitory effect
on these bacterial populations. Interestingly, even though O. basilicum EO inhibited
beneficial bacteria, the MBCs required (80 mg/ml) were much higher than those
required to inhibit pathogenic bacteria (5-10 mg/ml). O. basilicum might therefore
be used to control pathogenic bacteria without affecting beneficial bacteria,
provided that the right dose is used.

M. spicata and M. piperita EOs showed intermediate MBCs (5-40 mg/ml) in regards
to their effect on pathogenic bacteria and did not inhibit L. acidophilus growth.
However, B. breve was inhibited with MBCs of 10 and 40 mg/ml for M.
spicata and M. piperita, respectively. R. officinalis and S. officinalis EOs were active
against all bacteria evaluated, but their antibacterial activity was low (high MBCs)
and non-selective (about the same against both pathogenic and beneficial
bacteria). This activity is consistent with the chemical composition of these EO,
characterized by the presence of monoterpene hydrocarbons (limonene, α-pinene
and α-thujone) and oxygen containing monoterpenes (menthone, carvone, 1,8-
cineole and camphor). These compounds have shown weaker antimicrobial activity
compared with phenolic monoterpenes (Kim et al., 1995; Helander et al., 1998;
Dorman and Deans, 2000). The antimicrobial action of EO components is
determined by the lipophilicity of their hydrocarbon skeleton and the hydrophilicity
of their major functional groups. The antimicrobial activity of EO components has
been ranked as follows: phenols > aldehydes > ketones > alcohols > ethers >
hydrocarbons (Kalemba and Kunicka, 2003).

In summary, the results of the present study indicate that the locally
grown Lamiaceae plants selected for this study are capable of producing EOs with
variable antibacterial activity. The “model” EO used (commercial Origanum
vulgare EO), as well as the antibiotic selected as control, showed high antibacterial
activity against both pathogenic and beneficial bacteria. The chemical composition
of the EOs evaluated is consistent with previous studies from other countries, with
a few exceptions. Some of the EOs tested are highly active against pathogenic
bacteria but also against beneficial bacteria, an evident undesirable
characteristic. O. basilicum EO, however, had an interesting antibacterial activity
since it inhibited preferentially pathogenic bacteria. However, its yield was one of
the lowest obtained (0.1%).

More studies are needed to investigate the effect of the EOs tested using in
vivo models in order to determine if these oils (alone or in combination) can be
used to prevent gastrointestinal diseases in animals as natural alternatives to
antibiotics. The type of essential oil, yield, chemical composition, concentration
needed to obtain a biological effect and bioavailability are all aspects that need to
be taken into consideration for their potential use as feed additives in animal
nutrition.

Acknowledgments

Thanks are due to Jairo Cuervo of the College of Agriculture, National University of
Colombia for providing the experimental plants, and to Rocio Patiño of CEISA-ICA,
for her support in the microbiological assays.

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