I.

Introducción

El impedimento principal en la observación de bacterias en microscopio óptico es la déficit

de contraste entre la célula en observación y el medio que la rodea, la manera más simple de
facilitar el contraste es la utilización de colorantes, revelando la presencia de determinados
constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de
actividad respiratoria, etc. Para bacterias, el proceso de fijación por calor es lo más habitual,
aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y
alcoholes. Después de esto se añade el colorante. La fijación produce habitualmente el
encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células parezcan
mayores de lo que son realmente. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos
que tienen alguna afinidad por los materiales celulares. [1]

Determinados colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con
otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina
mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente se combina con un
constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante.
Una técnica de coloración y la más conocida es la tinción de Gram, denominada así por el
bacteriólogo danés Christian Gram, quien desarrollo esta técnica en 1844. Sobre la base de
la tinción de gran, las bacterias se clasifican en dos grupos: gran positivos y gran negativos.
En cuanto a la tinción de gran la secuencia es la siguiente: el frotis bacteriano se fija con
calor se tiñe con cristal violeta por 1 min, se lava con agua, se la aplica un mordiente por 1
min y se lava nuevamente con agua, después se decolora con una mezcla alcohol
etílico/acetona. Escurrir y cubrir con safranina (color de contraste) durante 1 min lavar y
secar.

Las bacterias Gram positiva y Gram negativas tiñen de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula
bacteriana sirve para definir su tamaño y su forma al organismo así como para prevenir la
lisis osmótica. La pared de la células Gram positivas es gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de peptidoglicano (cadenas lineales de un polisacárido formado por residuos
alternativos de N-acetilglucosamina y N-acetilmurámico unidos mediante un enlace) [3] y un
poco de ácido teicoico (forman parte de la gruesa capa de peptidoglicano que rodea a la
membrana plasmática y están directamente unidos a él mediante un enlace fosfodiéster. De
este modo pueden conectar varias capas de peptidoglicano) [3], mientras que las bacterias
gram negativas se componen de una capa delgada de peptidoglicano y está rodeada por una
capa exterior de lipopolisacáridos (forma parte de la pared de la pared celular de las bacterias
Gram-negativas. Tienen carácter anfipático, presentan carga negativa, y repelen moléculas
hidrofóbicas. Son tóxicos para el hombre, y también se llaman endotoxinas) [3] por lo cual
 estas dos tipos de bacterias se tiñen de diferente color y es posible identificarlas como Gram
positiva o Gram negativa. [2]

II. Materiales y métodos

Materiales y métodos
Equipo Materiales Reactivos
Vortex Cajas de Petri Colorantes de Gram
Estufa de incubación Mecheros Solución salida y/o
solución peptonada
Autoclave de Micro pipetas de 100 y
esterilización 1000 ul
Puntas para pipetear de
200 y 1000 ul estériles
Solución salida y/o
solución peptonada

Método
Para el cultivo:

Se tomo un ml de la suspensión suministrada realizando diluciones: 1:10, 1:100, 1:1000,

1:10000 con solución salina estéril.

Agregándole un ml de la suspensión que contenía los microorganismos al tubo uno, para

después agitarlo en el vortex.

Del tubo uno se saco 1 ml. y adicionándolo al tubo 2, para después agitarlo repitiendo este
proceso hasta a completar 6 tubos.(figura, A).

Del tubo 1, que es el que contenía la mayor concentración de suspensión de microorganismos

se tomo 100 ul y se procedio a agregarlo a una caja Petri con el medio de cultivo previamente
preparado,(figura, B). Realizando un movimiento circular para dispersar todo el contenido
agregado(figura C)
.

Incubamos por 48 horas a 37ºc. Cada 24 (figura A) Y 48 horas (figura B). se estuvo
realizando un monitoreo de las cajas Petri para ir observando el crecimiento de las colonias
a nivel microscópico y poder describirlas según su tamaño, color y forma.
III. Resultados y discusiones

En el siguiente reporte de practica se presenta la descripción de un procedimiento en el cual

se llevó a cabo la tinción de Gram con el fin de contrastar las bacterias presentes en una UFC
(unidad formadora de colonia) de una muestra de agua y suelo, para identificar la presencia
de bacterias según su grupo taxonómico: Gram positivas y Gram negativas. En este
procedimiento, en un porta objetos limpio y seco, se agregó una gota de agua destilada y
posteriormente se colocó una UFC (unidad formadora de colonia) encima de esta gota con
un asa de siembra previamente esterilizada; seguidamente se calentó suavemente en la llama
de un mechero para fijar la muestra. Posteriormente se tiño con cristal violeta de Hucker,
luego se lavó con agua destilada, nuevamente se tiño con lugol y seguidamente se lavó con
agua destilada para retirar el exceso de colorante, después se aplicó Azul de metileno para
contrastar y por último se lavó con agua corriente y se dejó secar la muestra para agregarle
una gota de safranina ,Finalmente se procedió a la identificación la presencia de bacterias
según su grupo taxonómico: Gram positivas o Gram negativas presentes en la UFC a través
del microscopio con el objetivo 10x, 40x y 100x.
En la figura A,B y C es posible observar bacterias con forma de bacilo (forma de barra o
vara) y de color rosadas, lo que indica que son baterías Gram negativas. Esta coloración se
debe a las características que poseen las bacterias Gram negativas en su pared celular. Debido
a que las bacterias Gram negativas poseen en su pared celular una capa delgada de
peptidoglicano (mureína) unida a una membrana externa formada por proteínas, fosfolípidos
y polisacáridos, la cantidad de colorante cristal violeta y del mordiente lugol que retiene es
mínima, en comparación a las bacterias Gram positivas, que “tiene varias capas de
peptidoglucano unido a la membrana plasmática, donde se encuentra el ácido lipoteicoico, y
más en la superficie, el ácido teicoico” [4], por lo cual el complejo de las moléculas de cristal
violeta, lugol y ácido teicoico que se forma en la pared celular de las Gram positivas, es muy
difícil de remover, lo que no sucede con las Gram negativas, porque el cristal violeta y el
lugol no reaccionan con el ácido teicocio, debido a que las bacterias Gram negativas en su
pared celular no lo tienen. Por otra parte, la membrana externa que poseen las bacterias Gram
negativas es soluble en compuestos orgánicos como a la mezcla de alcohol y acetona, por lo
tanto al momento de agregar el decolorante alcohol 95°, el complejo de cristal violeta y lugol
se perdió. De igual forma, las bacterias Gram negativas tomaron su color rosado, debido a
que se le agrego el colorante de contraste llamado Fuscina para colocarlas en manifiesto.

Es importante decir que las colonias a las que se les realizó tinción de Gram, eran de una
muestra de suelo, lo cual explica la presencia de estas bacterias, debido a que en el suelo
predominan las bacterias Gram negativas. Sin embargo en el suelo también se encuentran
bacterias Gram positivas, pero en menor proporción que las Gram negativas, lo cual también
explica la presencia de estas bacterias en el suelo.
 Figura A & B. Bacillu spp en tinción de Gram. Microscopia óptica en objetivo A= 10x B= 40x y C =
100x Bacterias de color rosado (Gram negativas).

IV. Conclusiones

Tanto las bacterias Gram positivas como las Bacterias Gram negativas se presentan
morfológicamente como cocos o bacilos, sin embargo al ejecutar tinción de Gram en estas
para identificar su grupo taxonómico, las Gram positivas se tiñen de color violeta mientras
que las Gram negativas se tiñen de color rosado.

Mediante la tinción de Gram se identifican bacterias Gram positivas y Gram negativas gracias
al color que tornan después de ser teñidas; en el caso de las bacterias Gram positivas se tiñen
 de violeta, esto se debe a que gracias a que contienen una pared gruesa de peptidoglicano y
gran cantidad de ácidos teicóicos que permiten fijar y retener rápidamente el colorante inicial
el cual es, el cristal violeta de Hucker, y además son resistentes a la decoloración. Lo
contrario ocurre con el caso de las Gram negativas, las cuales poseen una pared delgada con
menos cantidad de peptidoglicano y lípidos, la cual requiere de un colorante de contratincion
como la safranina o la fucsina en este caso, ya que el colorante inicial es fácilmente retirado
en la decoloración con alcohol, debido a que por su delgada pared celular no lo retienen.

Las colonias de bacterias a las que se les realizó tinción de Gram se tomaron de una muestra
de suelo y agua, tratando de homogenizar lo mas posible. lo cual explica la presencia de estas
bacterias, debido a que en el suelo predominan las bacterias Gram negativas. Sin embargo en
el suelo también se encuentran bacterias Gram positivas, pero en menor proporción que las
Gram negativas, lo cual también explica la presencia de estas bacterias en el suelo. De
acuerdo a esto Fue posible observar bacterias Gram negativas con forma de bacilo (con forma
de barra o vara), en el caso de las bacterias Gram positivas no fue posible tener alguno
observación.

V. Referencias:

[1] Díaz Camilo (2011). Definición de tinción. [En línea]. Disponible:

http://es.scribd.com/doc/52811425/Tinciones-en-Microbiologia-Seminario. Citado:
26/02/2019.
[2] Santambrosio Eduardo. (2009).tinción de gram. [En línea]. Disponible:
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practico4.pdf.
Citado: 26/02/2019.
[3] González Juan. Definición de peptidoglicano, ácido teicoico y lipopolisacáridos [En
línea]. Disponible: http://www.ehu.es/biomoleculas/hc/sugar35b.htm#lp. Citado:
26/02/2019.
[4] Wikipedia (2013). Tinción de Gram. [En línea]. Disponible:
http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram. Citado: 19/11/2013