MODIFICAÇÃO DE COLORAÇÃO HISTOQUÍMICA

A PARTIR DA TÉCNICA CONVENCIONAL DE LUXOL

FAST BLUE PARA UMA MELHOR VISUALIZAÇÃO
DAS CÉLULAS DE SCHWANN
Trabalho de conclusão de curso técnico em química
apresentado na ETEC de Osasco II ao Centro Estadual de
Educação Tecnológica Paula Souza como requisito para a
obtenção do título de técnica em química.

Osasco 2015
 José Marcelo Muniz

Kely Cristina Soares Bispo

Silvana Bueno

Talita Lucas

Vinícius Proença de Moraes

ORIENTADOR: PROF. JORGE LUÍS COSTA

 INTRODUÇÃO
Na organogênese, a formação do tubo neural é o marco inicial para o
desenvolvimento do sistema nervoso, que se dá a partir da formação
da placa neural das pregas neurais (MOORE & PERSAUD, 2008).

Figura1- Organogênese. Fonte: http://www.danieleassesgestante.com.br/

 INTRODUÇÃO
O sistema nervoso é um composto por:

• Diversas células responsáveis pelo controle sistêmico de funções

específicas deste tecido.

• Dividido anatomicamente SNC e SNP.

• Sistema nervoso central (SNC), composto por encéfalo, medula

espinhal e constituintes neurais do sistema fotorreceptor

• Sistema nervoso periférico (SNP), composto por nervos e

gânglios.

• As principais células do sistema nervoso são os neurônios e as

células da glia.
 INTRODUÇÃO
Oligodendrócitos e Células de Schwann, fazem parte das células da
glia, as quais têm a função de fornecer um ambiente adequado ao
funcionamento dos neurônios.

Figura 2- Neurônio. Fonte: http://melhorbiologia.blogspot.com.br/

 INTRODUÇÃO
A histoquímica, técnica considerada um elo entre a bioquímica e a
morfologia, seu papel é auxiliar no contexto médico a visualização
tecidual e a sua interpretação patológica na compreensão dos
mecanismos das doenças (CARLSON, 1996).

Figura 3 - Análise ao microscópio. Fonte: http://www.labclim.com.br/

 OBJETIVOS
• Modificação nas etapas do processo de coloração pela técnica
convencional de Luxol Fast Blue.

• Melhor visualização das células de Schwann em cortes histológicos

dos nervos periféricos num laboratório de histotecnologia em rotina
médica.

Figura 4 - Coloração . Fonte: http://pt.depositphotos.com

 OBJETIVOS
Dentre as várias técnicas histoquímicas existentes, há a coloração
conhecida classicamente como Luxol Fast Blue, cujo princípio é a
coloração de bainhas de mielina e neurônios (UNICAMP, 2015).

Figura 5 - Microscopia Sistema Nervoso. Fonte: http://anatpat.unicamp.br/

 AS CÉLULAS DE SCHWANN E A
BAINHA DE MIELINA
As Células de Schwann são células da neuroglia do sistema nervoso
periférico as quais formam as bainhas isolantes de mielina dos
axônios periféricos.

Figura 8 - A célula de Schwann - Fonte: http://www.lookfordiagnosis.com/

 AS CÉLULAS DE SCHWANN E A
BAINHA DE MIELINA
Células de Schawnn mielinizadas e não mielinizadas.

Figura 9 - Célula Schwann mielinizada e não mielinizada. Fonte: http://www.lookfordiagnosis.com

 BAINHA DE MIELINA
• Função da bainha de mielina.
• Composição da bainha de mielina.

Figura 10 - Bainha de Mielina e o neurônio. Fonte: http://www.meduniversitario.com.br/

 BAINHA DE MIELINA
• Perda da bainha de mielina.

Figura 11- Bainha de Mielina. Fonte: http://pt.depositphotos.com/

 PERDA DA BAINHA DE MIELINA
• Desmielinização.

Figura 12- Bainha de Mielina destruída. Fonte: http://www2.uol.com.br/

 COLETA DO MATERIAL
Nervos vestibulares e nervos cocleares serão removidos de
cadáveres, durante necropsias de rotina no Serviço de Verificação de
Óbitos da Capital da Universidade de São Paulo.
Após a coleta, cada nervo será fixado em formalina tamponada com
acetato de sódio a 10%, na temperatura de por 24 horas.

Figura 13- Ilustração fixação em formalina 10%

Fonte: http://soranadia.blogspot.com.br/
 PROCESSAMENTO DO MATERIAL
• Desidratação: remoção da água.
• Clarificação: remoção do álcool.
• Impregnação: imersão em parafina.

Figura 14- Aparelho processador automático (auto-técnico) de tecidos (Marca Leica, modelo TP 1020).

Cortesia do Laboratório de Histopatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

 PROCESSAMENTO DO MATERIAL
Passo Estágio Reagente Duração

1 Desidratação Álcool 95 % 1h

2 Desidratação Álcool 95 % 1h

3 Desidratação Álcool 100 % 1h

4 Desidratação Álcool 100 % 1h

5 Desidratação Álcool 100 % 1h

6 Desidratação ½ Álcool 100% e ½ Xilol 1h

7 Clarificação Xilol I 1h

8 Clarificação Xilol II 1h

9 Clarificação Xilol III 1h

10 Impregnação Parafina I 1h

11 Impregnação Parafina II 1h

12 Impregnação Parafina III 1h

 PROCESSAMENTO DO MATERIAL
A inclusão, feita no aparelho inclusor, se baseia em colocar, com o
auxílio de uma pinça previamente aquecida), os tecidos que foram
previamente infiltrados em parafina no interior de um molde.

Figura15- Aparelho auto inclusor (Marca Leica, modelo EG 1160). Cortesia do Laboratório de Histopatologia da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo.
 PROCESSAMENTO DO MATERIAL

Figura 16- Posicionamento e pinçamento do tecido. Cortesia do Figura 17 – Placa resfriadora de moldes para formação de blocos.
Laboratório de Histopatologia da Faculdade de Medicina da Cortesia do Laboratório de Histopatologia da Faculdade de Medicina
Universidade de São Paulo. da Universidade de São Paulo.
 CORTE HISTOLÓGICO DO MATERIAL
(MICROTOMIA)
Para permitir a análise dos tecidos ao microscópio de luz, eles
devem ser seccionados em fatias bem finas e uniformes num
aparelho chamado de micrótomo.

Figura 18- Aparelho micrótomo rotativo (Marca Leica, modelo RM 2245). Cortesia do Laboratório de
Histopatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
 CORTE HISTOLÓGICO DO MATERIAL
(MICROTOMIA)
O micrótomo é constituído por três partes: corpo, porta-bloco e porta-
objeto.

Figura 19 – Giro da alavanca no micrótomo para a aproximação de porta-objeto.

Cortesia do Laboratório de Histopatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
 CORTE HISTOLOGICO MATERIAL
(MICROTOMIA)
O resultado final são cortes ultrafinos seriados (figura 20), que são
postos em banho-maria e, em seguida, capturados em lâmina
histológica fosca lapidada (figura 21).

Figura 20– Cortes ultrafinos seriados. Cortesia do Laboratório de Figura 21- Lâmina fosca lapidada com o corte. Cortesia do Laboratório
Histopatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de de Histopatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São
São Paulo Paulo.
 COLORAÇÃO CONVENCIONAL POR LUXOL FAST
BLUE (ANATOMIA PATOLÓGICA UNICAMP)
Previamente processado tecnicamente de acordo com os itens
acima, o procedimento segue os seguintes passos:
Materiais (corantes).
Luxol-Fast-Blue à 0,1% (1 g de Luxol-Fast-Blue da marca MBS em
100 ml de etanol à 95%) adicionado a 0,5 ml de ácido acético à 10%
(esta solução é estável por meses).
Cresil-violeta à 0,1% (0,1 g de cresil violeta em 100 ml de água
destilada) acrescida de 15 gotas de ácido acético a 10% (filtrar esta
solução antes do uso).
Carbonato de lítio à 0,05% (0,05 g de carbonato de lítio em 100 ml
de água destilada).
 COLORAÇÃO CONVENCIONAL POR LUXOL FAST
BLUE (ANATOMIA PATOLÓGICA UNICAMP)
Lâminas Carbonato Álcool
em Luxol Álcool de Lítio 70%
Fast Blue 95%
Over 30 30
Night Segundos Segundos

Montar em Desidratar Corante

Álcool de Cresil
meio em álcool
95% Violeta 6
resinoso 100% e xilol
minutos

Resultados: A mielina é corada em azul turquesa e os neurônios em

azul violeta.
 MODIFICAÇÃO DA TÉCNICA
CONVENCIONAL DE LUXOL FAST BLUE
Após o material biológico ter sido processado de maneira fidedigna
ao relatado neste trabalho, o procedimento modificado da técnica de
Luxol-Fast Blue realizou-se da seguinte maneira:
Materiais (corantes)
Luxol-Fast-Blue a 1,5% (1,5 g de Luxol-Fast-Blue da marca Solvent
Blue 8/SIGMA ALDRICH S3382 diluído em 100 ml de álcool etílico à
95%) adicionado à 0,5 ml de ácido acético glacial.
Cresil-violeta 1,5% (1,5 g de Cresil-violeta da marca MERCK
adicionado à 100 ml de água destilada) acrescido de 10 gotas de
ácido acético glacial.
Carbonato de lítio à 0,5% (0,5 g de carbonato de lítio em 100 ml de
água destilada).
MODIFICAÇÃO DA TÉCNICA CONVENCIONAL
DE LUXOL FAST BLUE
Lâminas Carbonato Álcool
em Luxol Álcool de Lítio 70%
Fast Blue 95%
Over 60 30
Night Segundos Segundos

Montar em Desidratar Corante

Álcool de Cresil
meio em álcool
95% Violeta 60
resinoso 100% e xilol
segundos

Resultados: bainha de mielina corada em azul, terminações

nervosas e células de Schawnn em roxo.
 RESULTADOS
5.1 Coloração Convencional por Luxol Fast Blue 5.2 Coloração Modificada por Luxol Fast Blue
 RESULTADOS
Em ambas as colorações com Luxol fast-blue, se percebe a
circuncisão (setas pretas) das camadas de tecido conjuntivo que
cercam o nervo (o epineuro e o perineuro). Entretanto, na técnica
modificada nota-se um delineamento maior destas estruturas (setas
pretas com asterisco).

Figura 22- Método convecional Luxol Fast Blue Figura 23 – Método modificado Luxol Fast Blue
Acervo pessoal Acervo pessoal
 RESULTADOS
Corpos celulares das células de Schwan (setas amarelas) estão em
maior evidência na coloração modificada.

Figura 24 – Método convencional Luxol Fast Blue Figura 25 – Método modificado Luxol Fast Blue
Acervo pessoal Acervo pessoal
 RESULTADOS
Num mesmo ponto (círculo vermelho) pode-se perceber que a
técnica habitual não evidencia estruturas de Shwann (corpos
celulares e núcleos) que a técnica proposta neste trabalho (setas
vermelhas) marca.

Figura 26 – Método convecional Luxol Fast Blue Figura 27 – Método modificado Luxol Fast Blue
Acervo pessoal Acervo pessoal
 RESULTADOS
Finalmente, a utilidade desta alteração na técnica
convencional pode ajudar às ciências médicas na
localização de potenciais degenerativos nas células de
Schwann. Além disto, auxiliar na compreensão da
evolução destes processos seja de grandezas
neoplásica, inflamatória, necrótica ou de outra origem
patológica.
 CONCLUSÃO
A bainha de mielina tem a mesma composição das
membranas celulares, ou seja, 70% de lipídeos e 30% de
proteínas, com alta concentração de colesterol e
fosfolipídios na sua composição.

A bainha de mielina que reveste e isola eletricamente

muitos axônios das células nervosas é particularmente
rica em esfingomielinas.
 CONCLUSÃO
O corante de Luxol Fast Blue tem em sua composição a ftalocianina
de cobre como mediador de elétrons. A ftalocianina é um macrociclo
orgânico contendo um átomo central de cobre coordenado por quatro
átomos de nitrogênio.

Figura 28 - Estrutura da molécula de ftalocianina de cobre, presente no corante Luxol-Fast-Blue, marca Solvent
Blue 8/SIGMA ALDRICH S3382. Fonte: http://stainsfile.info/StainsFile/dyes/74180.htm
data de acesso: 10\06\2015
 CONCLUSÃO
A reação conduz a cadeia peptídica a um desarranjo em
sua estrutura tridimensional. Os íons Cu2+ presentes em
solução, originados do sulfato de cobre, formam um
complexo com os aminoácidos, estabelecendo
interações com os átomos de nitrogênio da cadeia
peptídica.
 CONCLUSÃO
A técnica de Luxol Fast Blue modificada simplificou as
etapas de execução, e com isso aumentou a
reprodutibilidade das reações.

A melhora da visualização e percepção da imagem

gerada permitiu a identificação mais rápida e marcação
segura das fibras mielinizadas e contraste de cores não
mielinizadas.
 CONCLUSÃO
Houve corroboração da qualidade do teste
histoquímico pela avaliação do patologista e
possibilitou avaliação qualitativa de diagnóstico
da bainha de mielina nas estruturas estudadas,
assim como análise quantitativa através da
contagem de células de Schwann pela
identificação dos núcleos corados de forma
precisa e em menor tempo.
 CONCLUSÃO
Concluímos com isso que a alteração da técnica já
existente mas aperfeiçoada por reações químicas
otimizou tempo favorecendo a melhor visualização da
bainha de mielina e células de Schwann contribuindo
para futuros trabalhos e com isso auxiliando no avanço
de várias discussões na área da Neurociência.
 AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradecemos a Deus, por nos iluminar e
durante nossa trajetória.
Ao nosso orientador, Prof. Jorge Luís Costa por ter nos
auxiliado com disciplina, ética e todo carinho.
Ao veterinário Leonardo Nunes Zerbone, por toda atenção,
paciência, dedicação e carinho com este trabalho, sem a
ajuda deste brilhante profissional não conseguiríamos a
imagens das lâminas neste trabalho.
A Profa. Dra. Leila Antonangelo, que gentilmente autorizou o
uso do Laboratório de Histopatologia do Departamento de
Patologia da FMUSP para a confecção das lâminas
histológicas apresentadas neste trabalho.
 AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Raphael Salles Scortenagna de Medeiros,
neuropatologista do Hospital das Clínicas da FMUSP, que foi o
grande responsável pelo desenvolvimento da modificação da
técnica, seu trabalho foi o impulsor desta coloração
histoquímica e pela sua atenção na análise final das lâminas
nos auxiliando na parte médica diagnóstica.

Aos técnicos de histoquímica do Laboratório de Histopatologia

do Departamento de Patologia da FMUSP, Cassia Arruda e
Rodrigo Soares Vaz de Camargo pela presteza e
principalmente pela vontade em ajudar nas diversas formas,
passando seus conhecimentos e habilidades profissionais.
 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
• CARLSON, B. M. Embriologia Humana e Biologia do
Desenvolvimento. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1996.
• DANGELO, J. G.; FATTINI, C. A. Anatomia humana básica. 2.
ed. Rio de Janeiro: Atheneu. 2002.
• DI FIORI, M.S.H. Atlas de Histologia. 7ª ed. Guanabara Koogan,
Rio de Janeiro, 1984.
• JUNQUEIRA, L. C. & CARNEIRO, J. Histologia Básica. 10ed.
Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
• KÖNIG, H.E.; LIEBICH, H.G. Anatomia dos animais
domésticos: Texto e atlas colorido. 4ª ed., Porto Alegre:
Artmed, 2004.
• MOORE, K.L. & PERSAUD, T.V.N. Embriologia Clínica, 8ª ed.,
Rio de Janeiro: Elsevier, 2008.