INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIA BIOLOGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
PRECIPITACION, SEPARACION Y PUNTO ISOELECTRICO DE PROTEINAS.
Dorantes Molina Alba Paloma.
Paulina García 3IM2 Sección 3 (10/Sep/2015)
INTRODUCCIÓN.
La preparación pura de una proteína es esencial antes de determinar Tabla de de resultados de precipitación por metales
sus propiedades, composición de aminoácidos y secuencia; los pesados. Donde pp= Precipitación.
métodos de separación de proteínas aprovechan las propiedades Tubo 1 2 3 4 5 6
fisicoquímicas de estas. Clara de 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
La solubilidad de la mayor parte de las proteínas se debe a la huevo
interacción de las moléculas polares del agua y los grupos Cloruro
ionizados de las proteínas. Dado que una proteína contiene varios mercúrico 0.25 - - - - -
5%
grupos cargados, su solubilidad depende de:
Nitrato de
 Concentración de sales disueltas.
plata 2% - 0.25 - - - -
 Polaridad del solvente.
 pH. Acetato de
 Temperatura. plomo 5% - - 0.25 - - -
La modificación de estos parámetros en soluciones proteicas Cloruro de
permite purificarlas en virtud de su solubilidad. bario 5% - - - 0.25 - -
OBJETIVOS. Cloruro de
 Analizar el efecto que produce la modificación de factores sodio 5% - - - - 0.25 -
fisicoquímicos sobre la solubilidad de las proteínas. Agua. - - - - - 0.25
 Determinar el punto isoeléctrico de la insulina, Obs. pp. pp. pp. - - -
basándose en sus propiedades de solubilidad a
diferentes valores de pH. Tabla de determinación del pI de la insulina.
RESULTADOS. Tubo Ác. Acetato Insulin pH Obs.
Tabla de resultados del método “Salting out” Acético de sodio a 40
Tubo Reacción Biuret Observaciones. 0.2M 𝑈
1 positiva Torna a coloración violeta 𝑚𝐿
2 positiva Torna a coloración violeta 1 0.23 0.02 6U 3.65 -
(0.06
3 negativa Torna a coloración azul
mL)
4 positiva Torna a coloración violeta
2 0.15 0.10 6U 4.52 -
*Especificando numeración de tubos. (0.06
1: Sol. Clara de huevo + (𝑁𝐻4 )2 𝑆𝑂4 mL)
2: Sol. Clara de huevo + (𝑁𝐻4 )2 𝑆𝑂4 + centrifuga. 3 0.05 0.20 6U 5.30 -
Filtrado de solución. (0.06
3: Sobrenadante + (𝑁𝐻4 )2 𝑆𝑂4 sólido. mL)
4: Sobrenadante + (𝑁𝐻4 )2 𝑆𝑂4 sólido + Filtrado. 4 0.01 0.24 6U 6.08 pp.
Tabla de resultados pp.por efecto del pH y solventes. (0.06
Tubo 1 2 3 mL)
Clara de 3.0 3.0 3.0 5 0.00 0.25 6U 9.00 -
huevo. [mL] (0.06
HCl 0.1N mL)
[mL] 1.0 - -
Calculo de pH para cada tubo.
NaOH 0.1N - 1.0 - [𝐵𝑎𝑠𝑒]
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + 𝑙𝑜𝑔 [Á𝑐𝑖𝑑𝑜]
[mL]
1 1
Regulador de - - 1.0 𝑝𝐻 = 2 𝑝𝐾𝑎 + 2 𝑙𝑜𝑔[𝐵𝑎𝑠𝑒]
acetatos. [mL] Tubo 1.
Observaciones Formación No se Formación
Ácido acético. Acetato de sodio.
. de forma un de
precipitado precipitado precipitado
blanquizco. blanquizco 0.2M 0.25 mL 0.2M 0.25 mL
Etanol 96° 3.0 3.0 3.0 X=0.184M 0.23 mL X=0.016M 0.02 mL
[mL] [0.016]
𝑝𝐻 = 4.7 + 𝑙𝑜𝑔 [0.184] = 3.65
Observacion Gelifico. No se Precipito
es. observa aún más. Tubo 2.
ningún Ácido acético. Acetato de sodio.
cambio.
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PRECIPITACION, SEPARACION Y PUNTO ISOELECTRICO DE PROTEINAS.
Dorantes Molina Alba Paloma.
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0.2M 0.25 mL 0.2M 0.25 mL huevo su punto isoeléctrico es a
X=0.12M 0.15 mL X=0.08M 0.10 mL un pH acido, mientras que al agregar NaOH no se prod
[0.08] ujo ningún cambio en la solubilidad de la proteína.
𝑝𝐻 = 4.7 + 𝑙𝑜𝑔 = 4.52
[0.12] Precipitación por metales pesados.
Tubo 3.
Ácido acético. Acetato de sodio. Las Proteínas suelen ser precipitadas por soluciones con
sales de metales pesados lo
0.2M 0.25 mL 0.2M 0.25 mL cual produce precipitados proteicos, la mayoría
X=0.04M 0.05 mL X=0.16M 0.20 mL suelen llevarse a cabo por la desnaturalización de las
[0.16] proteínas; en las soluciones probadas para la solución de
𝑝𝐻 = 4.7 + 𝑙𝑜𝑔 [0.04] = 5.30
clara de huevo, se observó que la precipitación de
Tubo 4.
proteínas solo se dio en los metales pesados utilizados
Ácido acético. Acetato de sodio.
en la práctica, como son las soluciones de mercurio,
0.2M 0.25 mL 0.2M 0.25 mL plata y plomo, mientras que en las soluciones con bario,
X=8𝑥10−3 M 0.01 mL X=0.192M 0.24 mL sodio y agua no se presentó la precipitación, esto debido
[0.192] a que no son metales pesados, sino, metales
𝑝𝐻 = 4.7 + 𝑙𝑜𝑔 [8𝑥10−3 ] = 6.08
alcalinotérreos y alcalinos o el casa del agua, solo eso.
Tubo 5.
Acetato de sodio. Determinación de punto isoeléctrico de la insulina.
0.2M 0.25 mL
El punto isoeléctrico de una proteína es el pH en el cual
X=0.2M 0.25 mL
la proteína presenta su mínimo de
1 1 solubilidad, pH en el cual la carga neta de todos sus
𝑝𝐻 = 7 + 2 𝑝𝐾𝑎 + 2 𝑙𝑜𝑔[0.2] = 9.0 grupos disociables es igual a cero, en la prueba realizada
se llegó al punto isoeléctrico de la insulina en un pH de
DISCUSIÓN DE RESULTADOS. 6.08 el cual se presentó en el tubo número 4,
mostrándose así por el hecho de haber precipitado, El
Método “Salting out”
valor teórico encontrado del punto isoeléctrico de la
El proceso de separación por precipitación de sales se
insulina fue de 5.45 y 5.55.
lleva a cabo por la fuerza iónica de sales neutras con la
cual disminuye la solubilidad de CONCLUSIÓN.
las proteínas, en base a una competencia entre la prote
ína y los iones de la sal por el agua, es por ello que la La solubilidad de las proteínas depende de algunas
prueba hecha al tubo numero 3 es negativa, debido a que variables fisicoquímicas como lo son el pH, la
saturamos adecuadamente la solución de clara de huevo, concentración de sales disueltas, la temperatura y la
precipitando así todas las proteínas contenidas en dicha constante dieléctrica del disuelven; algunas de estas
solución. En base a esto nuestros primeros resultados, varíales o todas ellas pueden manipularse para
los tubos 1 y 2 dieron positivo a la prueba debido a que precipitar de manera selectiva ciertas proteínas, esto
no se realizó la saturación con la sal y por ende las mientras otras se mantienen disueltas.
proteínas presentes en la clara del huevo, aún estaba ahí. BIBLIOGRAFÍA.
Precipitación por efecto del pH y solventes.  Lehninger, A, L. “Principios de bioquímica”. Ed. Omega,
Las proteínas presentan un mínimo de solubilidad el España) pp. 134-146.
cual es un valor de pH en el que se lleva a cabo un  Donald Voet, Judith G. Voet.“Bioquímica 3ra edición“ Ed.
mínimo de solubilidad conocido esto Panamericana (2004) pp. 79-86.
como punto isoeléctrico en base a esto se llegan a preci
pitar las proteínas con más facilidad, pero este efecto
también puede ser modificado por
la presencia de solventes orgánicos, en las mues
tras analizadas cuando se agrega el HCl y la solución
reguladora de acetatos se observa una precipitación la
cual se ve aumentada al agregar el etanol debido a que
la proteína utilizada que buen la albumina de la clara del