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CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

Periodo Enero-Junio 2019

MANUAL DE PRÁCTICAS DE
INMUNOLOGIA

NOMBRE DEL ALUMNO:

____________________________________________________

CARRERA: MEDICINA,
GRUPO C
SEMESTRE: TERCERO

NOMBRE DE LOS PROFESORES QUE IMPARTIRÁN EL CURSO:

Dra. en C. Mariela Jiménez Vargas
Dra. en C. Eva María Salinas Miralles

Apoyo Técnico:
M en AH Rocio Villalobos Cruz

ELABORADO POR: Dra. Mariela Jiménez Vargas

FECHA DE ACTUALIZACION: Diciembre 2018
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LABORATORIO DE INMUNOLOGIA
LICENCIADO EN MEDICINA

OBJETIVOS GENERALES:
1. Que el alumno sea capaz de adquirir el conocimiento práctico que permita entender las bases
teóricas de la respuesta inmune.
2. Aplicar los conocimientos y la metodología analítica actualmente utilizada para realizar distintos
tipos de reacciones inmunológicas con el fin de que pueda aplicarlos en el área de diagnóstico

DESCRIPCION DEL CURSO:

El curso consta de una sesión de laboratorio de dos horas por semana. Las sesiones constarán de una
presentación oral por parte del profesor, la cual busca preparar a los alumnos con conceptos generales
para la realización de la práctica.

REGLAMENTO:
1. Los alumnos deben presentarse al laboratorio adecuadamente preparados, habiendo consultado
previamente en su manual la práctica correspondiente. EL ALUMNO DEBE LEER CON
DETENIMIENTO LA TÉCNICA A SEGUIR, ya que el profesor podrá hacerla preguntas de la práctica.
2. Los alumnos deben usar bata BLANCA para entrar al laboratorio.
3. Los alumnos NO deben entrar y salir del laboratorio a voluntad. Deben esperar fuera del laboratorio
hasta que el maestro o instructor llegue y les indique que pueden entrar.
4. Está prohibido fumar o comer dentro de los laboratorios.
5. Los alumnos deben mantener el orden dentro de los laboratorios.
6. Deben dejar su área de trabajo limpia y ordenada.
7. La basura debe colocarse en los recipientes correspondientes. Las substancias corrosivas o
contaminadas se dejarán en depósitos adecuados sobre las mesas.
8. Los alumnos deben lavarse las manos con agua y jabón al finalizar cada práctica.
9. El alumno tiene la obligación de permanecer en el laboratorio hasta que la práctica se dé por
terminada.

EVALUACIÓN DE LOS APRENDIZAJES DE LA MATERIA

La evaluación de los estudiantes comprenderá:
 Primer parcial de teoría: 15%
 Segundo parcial de teoría: 15%
 Tercer parcial de teoría: 15%
 Final acumulativo de teoría: 22.5%
 Actividades de integración teórica: 7.5%
 Primer parcial de laboratorio: 10%
 Final acumulativo de laboratorio: 12.5%
 Reportes y actividades en laboratorio: 2.5%

LINEAMIENTOS DE TRABAJO DURANTE EL CURSO

 Al inicio de la clase el profesor realizará a algunos alumnos elegidos al azar preguntas
relacionadas con el conocimiento aprendido en las clases anteriores. Si el alumno no sabe
contestar adecuadamente, se le considerará como parte de su calificación en reporte y actividades
de laboratorio.
 No está permitido que los alumnos usen celulares. El uso de tabletas o computadoras está
autorizado únicamente para tomar notas durante las clases.
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 El total de inasistencias en la materia incluirá tanto las de las sesiones teóricas como prácticas.
En caso de inasistencia a una sesión práctica o teórica, se asignarán tantas faltas como horas dure
la sesión.
 Las inasistencias deberán de justificarse en la primera sesión que el alumno se incorpore al curso
tras su falta.
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CALENDARIZACION DE LAS PRÁCTICAS DE INMUNOLOGIA MEDICINA
No. DE
FECHA NOMBRE DE LA PRACTICA
PRACTICA
31-ENERO LINEAMIENTOS GENERALES
7-FEBRERO 1 RECUENTO LEUCOCITARIO

14-FEBRERO 2 REACCIONES DE PRECIPITACION

PRUEBA DE REACCIONES FEBRILES

21-FEBRERO 3 APLICACIÓN DE LAS REACCIONES DE
AGLUTINACION DIRECTA

DETERMINACIÓN DEL FACTOR REUMATOIDE EN

28-FEBRERO 4 EL DIAGNÓSTICO DE ARTRITIS REUMATOIDE
REACCION DE AGLUTINACION PASIVA INDIRECTA

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA C-REACTIVA

28-FEBRERO 5 COMO MARCADOR DE INFLAMACIÓN
REACCION DE AGLUTINACION PASIVA INVERSA
TIPIFICACION DE GRUPOS SANGUINEOS,
7-MARZO 6 SISTEMAS ABO Y Rh
(REACCION DE AGLUTINACIÓN DIRECTA)
PRUEBAS CRUZADAS DE COMPATIBILIDAD
14-MARZO 7
SANGUINEA
DETERMINACIÓN DE ERITROCITOS
14-MARZO 8 SENSIBILIZADOS EN LA ERITOBLASTOCIS FETAL
PRUEBA DE COOMBS

21-MARZO PRIMER PARCIAL

INMUNIZACIÓN ACTIVA COMO PRINCIPIO DE LA
28-MARZO 9
VACUNACIÓN
PRUEBA INMUNOLÓGICA DE EMBARAZO
4-ABRIL 10
INMUNOCROMATOGRAFÍA
DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-
11-ABRIL 11 Toxoplasma
ELISA INDIRECTO
MÉTODO DE AGLUTINACIÓN BACTERIANA PARA
9-MAYO 9A LA DETERMINACIÓN DE LA ESPECIFICIDAD Y
SENSIBILIDAD DE UNA VACUNA INACTIVADA
ESTUDIO DE SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS
16-MAYO 12 EN UNA MUESTRA SANGUÍNEA
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTINUCLEARES Y
ANTI-DNAn EN EL DIAGNÓSTICO DE
30-MAYO 13
ENFERMEDADES AUTOINMUNES
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
6-JUNIO EXAMEN FINAL ACUMULATIVO
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PRACTICA No. 1
RECUENTO LEUCOCITARIO

I. OBJETIVO:

Al finalizar la práctica, el alumno ha de ser capaz de:

1. Elaborar un buen frotis sanguíneo.

2. Realizar adecuadamente la tinción de Wrigth.
3. Distinguir cada uno de los diferentes tipos de células (Leucocitos) que participan en los
mecanismos de defensa del organismo.
4. Realizar el recuento leucocitario.

II. FUNDAMENTO

Leucocitos

Los leucocitos son las células de la sangre que juegan un papel muy importante en el desarrollo
tanto de la respuesta inmune innata como la adaptativa. Estos, se originan en la médula ósea y la mayoría
madura en este mismo sitio, para continuar su paso por el torrente sanguíneo y finalmente vigilar y proteger
los órganos periféricos. Razón por la cual, adquiere especial importancia, el estudio morfológico y cuantitativo
de los leucocitos (Murphy y cols., 2009).

Los leucocitos están comprendidos por dos líneas celulares, mieloide y linfoide. La línea mieloide,
está compuesta por monocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Mientras, que la linfoide solo la
componen los linfocitos (Delves y cols., 2011). En la tabla 1 se resumen las principales características
morfológicas de cada una de estas células.

TABLA 1. Características generales de los leucocitos.

Célula Tamaño y forma del Función Porcentaje

núcleo
Neutrófilo  9-12 µm  Fagocitosis
 2-5 lóbulos  Inflamación:
 Citoplasma  Liberación de trampas 50-70%
finamente extracelulares (NETs)
granulado
Monocito  10-15 µm de  Fagocitosis
diámetro  Screción de quimiocinas y
1-6%
 Núcleo arriñonado citocinas
 Presentación de antígenos
Eosinófilo  9-13 µm  Fagocitosis
 Núcleo bilobulado  Destrucción de parásitos
1-3%
 Gránulos rosa- helmintos.
anaranjado  Trampas extracelulares
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Basófilo  8-12 µm  Liberan sustancias
 Núcleo con 2-3 farmacológicamente activas
lobulos relacionas con algunas alergias. <1%
 Gránulos purpura
intenso
Linfocitos  8-12 µm Producción de anticuerpos
 Núcleo grande y Dirigen y regulan la respuesta inmune 20-40%
citoplasma escaso. Destrucción de células y agentes
extraños.

Tinción con colorante de Wright

La tinción de Wright es una herramienta que facilita la identificación, caracterización y

cuantificación de células de sangre periférica o médula ósea sobre un portaobjetos. Esta tinción se
considera policrómica, pues está compuesta por dos colorantes, eosina y azul de metileno. Ya en
solución el azul de metileno oxidado junto con la eosina forman un nuevo complejo, Tiazina-eosinato,
que tiñe a los componentes celulares neutros. Mientras que; el azul de metileno libre tiñe los
componentes ácidos como el ácido ribonucleico y la eosina tiñe a los componentes básicos como la
hemoglobina y gránulos eosinófilicos. De esta manera, una vez teñidos los leucocitos los podemos
clasificar morfológicamente en granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) y agranul ocitos
(linfocitos y monocitos). Por otro lado, los primeros también se conocen como polimorfonucleares,
por la forma lobulada del núcleo durante su observación al microscopio y a las segundas
monocnucleares pues su aprecia un solo lóbulo, el cual ocupa un espacio importante del total de la
célula (Rodak y cols., 2013).

Generalidades:

Como se ha dicho antes, para la observación de los leucocitos es importante que estos se
encuentren extendidos sobre un portaobjetos, mejor conocido como frotis sanguíneo. El cual facilita el
recuento leucocitario o fórmula leucocitaria, representado por el estudio de los neutrófilos, eosinófilos,
basófilos, linfocitos y monocitos. Este recuento puede ser diferencial o absoluto, el primero indica el
número de cada tipo celular por cada 100 leucocitos; mientras que el segundo indica el número total de
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cada tipo celular por cada 10 /L. Esta, es una de las determinaciones más importantes en hematología
e inmunología, en donde se aprecian multitud de cambios, compatibles con diferentes estados, con
cuadros muy específicos para determinadas afecciones. La información que se obtiene al examinar las
extensiones de sangre es sumamente importante. La fidelidad de la información obtenida depende en
gran parte, de la calidad de las extensiones. Para que un método dé buenos resultados, hay que
cumplir con ciertos requisitos (Rodak y cols., 2013):

1. Los portaobjetos y cubreobjetos deben estar perfectamente limpios y sin grasa; lavarlos con agua y
jabón, enjuagarlos perfectamente con agua normal y por último con agua destilada. Enseguida se
secan y se pulen con un trapo libre de pelusa. A partir de entonces se manejan con cuidado
tocando sólo los bordes. Los cubreobjetos y portaobjetos lavados pueden guardarse en alcohol de
95°C;

2. La gota de sangre no debe ser demasiado grande (2 a 3 mm de diámetro).

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3. El trabajo debe ser rápido.

4. La extensión debe cubrir tres cuartas partes del frotis y se deben apreciar sus bordes laterales.

Para el recuento diferencial, la sangre se toma de la yema de un dedo o del lóbulo de la oreja.
Sólo se requiere de una gota muy pequeña, generalmente más o menos al doble de la cabeza de un
alfiler; su tamaño depende en gran parte del espesor de la extensión. El espesor adecuado depende
de la finalidad de la extensión; por ejemplo para el estudio de la estructura de las células sanguíneas y
para el examen del parásito del paludismo, deberá ser tan fina que, en la mayor parte de ella los
eritrocitos estén en una sola capa, próximos entre sí, pero no sobrepuestos; generalmente se
recomienda que en un campo observado a 100X hayan de 200 a 250 eritrocitos, siempre y cuando, se
trate de una muestra de paciente con un recuento de glóbulos rojos normal.

III. REACTIVOS

 Colorante de Wright
 Buffer para colorante de Wright
 Aceite de inmersión

IV. MATERIAL Y EQUIPO:

 Lancetas estériles y desechables

 Torundas de algodón con alcohol al 70 % o con merthiolate
 Portaobjetos perfectamente limpios y desengrasados
 Cajas de Coplin
 Microscopio Óptico de Campo Claro

IV. PROCEDIMIENTO:

1. Lave perfectamente sus portaobjetos y asegúrese estén exentos de grasa.

2. Lave sus manos con agua y jabón.
3. Haga asepsia a la yema de un dedo con la torunda con alcohol.
4. Descubra la lanceta.
5. Mantenga en dedo hacia abajo y presiónelo suavemente, pinchen la yema del dedo con la lanceta
con un movimiento rápido. Elimine la primera gota de sangre.
6. Coloque una pequeña gota de sangre en uno de los extremos del portaobjeto limpio y coloque el
portaobjetos sobre una superficie plana.
7. Con el segundo portaobjetos limpio tocar la gota de sangre con uno de los bordes y dejar que la
sangre corra a través de él. (ver figura 1).
8. A continuación coloque este segundo portaobjetos en un ángulo de aproximadamente 30° y
moverlo hacia el extremo opuesto del primer portaobjetos (cuanto menor sea el ángulo, más
delgada tendremos la preparación).
9. Deje secar el frotis a temperatura ambiente.
10. Coloque el frotis dentro del colorante de Wright contenido en una caja Coplin durante dos minutos.
11. Retire la laminilla del colorante y retire el exceso.
12. Inmediatamente introdúzcalo en la caja de Coplin durante 3-4 minutos.
13. Elimine el exceso de buffer.
14. Lave durante 15-30 segundos con agua destilada, retire el exceso seque a temperatura ambiente.
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15. Tan Pronto como la laminilla se ha secado completamente, ponga una gota de aceite de
inmersión en el extremo más delgado del frotis.
16. Observe la preparación bajo el microscopio de campo claro con el objetivo 100X, colocando
previamente una pequeña gota de aceite de inmersión.
17. Desplace la laminilla siguiendo una grca griega e identifique cada una de las células sanguíneas
haciendo un dibujo de cada una de ellas.
18. Se facilita su identificación tomando en cuenta que los núcleos son púrpura o azules, el citoplasma
azul pálido, granulaciones rojas en los eosinófilos, granulaciones azul púrpura en los basófilos y las
plaquetas también azul púrpura, eritrocitos rosa o lila.
19. Realice el conteo de los leucocitos y reporte sus resultados

FIGURA 1. Desarrollo de una extensión sanguínea. Tomado de García-Espinoza y cols., 2015.

OBSERVACIONES:

Una extensión de sangre bien teñida debe caracterizarse por una buena diferenciación de las
estructuras subcelulares en los leucocitos, una coloración rosada de los hematíes y la ausencia de
precipitados. Los defectos más frecuentes observados en la tinción del frotis sanguíneo son: que
abarque todo el portaobjeto o sea muy pequeño o que sea muy grueso o muy delgado. Estos
defectos son provocados por el tamaño inadecuado de la muestra, en una velocidad de realización
cambiante o incorrecto ángulo de colocación entre los portaobjetos . Para que se cosidere una
extesión correcta, debe constar de tres capas: cabeza, cuerpo y cola (García-Espinoza y cols.,
2015.).
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Cabeza: inicio de la extensión; por lo tanto, es una zona muy gruesa debido a que los eritrocitos se
encuentran apilados. En ella se aprecia siempre un aumento de linfocitos.

Cola: Correspondeal final de la extensión y termina enun área donde las células adoptan una
posición acartonada (barbas). En esta región existe un exceso de granulocitos y monocitos.

Cuerpo: Corresponde a la región intermedia del frotis y en ella existe un reparto equilibrado de
células. Aquí es donde se encuentra la zona ideal de lectura, que corresponde al espacio final de
este, justo antes de que comience la cola.

V. RESULTADOS: Incluir resultados del recuento diferencial completando la siguiente tabla; sin
comentarios ni observaciones, las cuales se considerarán en otro punto.

TABLA 2. Resultados del recuento leucocitoario.

LEUCOCITOS LINFOCITOS MONOCITOS EOSINOFILOS BASOFILOS NEUTROFILOS

Cantidad
Recuento
Diferencial:
No. Absoluto:

VI. OBSERVACIONES: Se refiere a observaciones durante el desarrollo de la práctica, tales como

fuentes de error, precauciones, comentarios, aclaraciones a la técnica, etc. No repetir la
descripción de los pasos de la técnica.

VII. CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es la composición del colorante de Wright?
2. Describe el fundamento de la tinción de los leucocitos empleando el colorante de Wright.
3. ¿Por qué es importante la fórmula leucocitaria en el diagnóstico clínico?
4. ¿Cuáles son los valores normales de un recuento leucocitario diferencial absoluto y relativo en
niños y en adultos?
5. ¿Qué nos indica un valor alto en el recuento de cada uno de los leucocitos y fundamente su
respuesta?
6. ¿Qué significa recuento diferencial absoluto y relativo?

VIII. CONCLUSIONES: Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados
obtenidos.

IX. BIBLIOGRAFÍA: Incluir las fuentes de información consultadas, proporcionando sus datos
completos.

 Delves PJ, Martin SJ, Burton DR, Roitt IM (2010*). Roitt’s Essential Immunology. United
Kingdom: Wiley-Blackwell.
 Murphy K, Travers P, Walport M (2009**) Inmunobiología de Janeway. México: McGrawHill.
#
 Rodak BF, Fritsma GA, Keohane E (2010 ). Hematology: Clinical Principles and applications.
Elsevier.
 10

* Edición que se encuentra en la biblioteca norte de la UAA

** Edición que se encuentra en la biblioteca central de la UAA
#
Estas fuentes de consulta no se encuentran en la biblioteca de la UAA
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PRÁCTICA NO. 2
REACCIONES DE PRECIPITACION
I. OBJETIVO:

Al finalizar las siguientes prácticas el alumno será capaz de:

1. Llevar a cabo de manera correcta los procedimientos que implican las reacciones de precipitación,
2. Identificar las características y tipos de las reacciones de precipitación.
3. Realizar la técnica de precipitación en medios sólidos (inmunodifusión).
4. Identificar las reacciones de Identidad total, Identidad parcial y No Identidad.
5. .

II. INTRODUCCIÓN:

En el mercado existe una gran gama de pruebas serológicas. Las cuales, como su nombre lo
indica, se refieren a pruebas de laboratorio basadas en la interacción antígeno-anticuerpo. Las
interacciones antígeno anticuerpo ocurren en dos fases. La primera de reconocimiento, donde ocurre la
interacción fisicoquímica entre las moléculas del antígeno y del anticuerpo; y la segunda de
manifestación, donde se hace evidente la misma. En base a esta última etapa, las interacciones
antígeno-anticuerpo se pueden clasificar en tres tipos (Fiorentino-Gómez y cols., 1994):

 Primarias: se evidencia con la ayuda del antígeno o anticuerpo marcado con un indicador
como fluorocromo, enzima, entre otros. Son las pruebas más sensibles.

 Secundarias: se evidencian en base a las características y naturaleza química de los

componentes como la solubilidad. Poseen menos sensibilidad, debido a que no solo se
fundamenta en la interacción antígeno-anticuerpo, sino en su capacidad para formar redes.

 Terciarias: son interacciónes biológicas que involucran la participación de las células del
sistema inmune, como las pruebas de hipersensibilidad de tipo I, en donde se busca la
sensibilización previa del individuo y el desarrollo de memoria.

Dentro de las reacciones secundarias, se sabe que al mezclar cantidades suficientes de antígeno
soluble con anticuerpos específicos, la interacción entre estos puede dar lugar a una reacción visible
llamada precipitación. Esa red de la que hablamos, no es otra cosa que grandes complejos inmunes
(CI) formados por la interacción antígeno-anticuerpos. Para que este tipo de reacción se produzca,
ambos componentes han de ser al menos bivalentes, es decir, que mientras que el antígeno debe
poseer varios determinantes antigénicos (4, 6, 5), basta con que el anticuerpo tenga, al menos, 2 sitios
de combinación.

Así mismo, cuando se agregan concentraciones crecientes de antígeno a una cantidad fija de
suero conteniendo anticuerpos específicos, a medida que la cantidad de antígeno agregado aumenta,
la cantidad de precipitado se incrementa hasta alcanzar un máximo, luego del cual declina. En un
extremo de la curva de precipitación, cuando se agregan pequeñas cantidades de antígeno, los CI se
forman en exceso de anticuerpo (prozona). En el otro extremo, al agregar grandes cantidades de
antígeno, los CI se forman en exceso de antígeno (postzona) siendo pequeños y probablemente
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constituidos por una molécula de anticuerpo y dos de antígno. Entre estas dos situaciones extremas
se encuentra la zona de equivalencia, en donde la relación antígeno-anticuerpo permite la formación
de grandes redes de CI que precipitan (figura 2).

FIGURA 2. Curva de precipitación de concentraciones crecientes de antígeno con una cantidad

constante de anticuerpo. Tomada de Esparza-Gómez y cols., 2011.

Para la realización de estas técnicas se requiere que tanto el anticuerpo como el antígeno se
encuentren en un medio fluido en el que sea posible la precipitación del CI. El medio puede ser líquido
o semisólido. Las primeras también reciben el nombre de floculación y las segundas de
inmunodifusión. Existen diferentes modalidades siendo las principales:

1. Técnica de precipitación propiamente dicha.

2. Técnica de difusión radial simple de Mancini
3. Técnica de difusión doble o de Ouchterlony.
4. Técnica de inmunoelectroforesis

III. FUNDAMENTO:

La inmunodifusión doble o de Ouchterlony es un método inmunológico sencillo y rutinariamente

usado en el laboratorio clínico para la detección de antígenos o anticuerpos en una muestra biológica.
Esta técnica se realiza en placas de agar en donde se realizan pocillos a distancia conveniente y en
dichas perforaciones se colocan pequeñas cantidades de antígeno y anticuerpo (Figura 2). En este
caso los reactivos difunden en forma radial a partir de cada pocillo y cuando ambos sistemas se
encuentren, se formará en la zona de equivalencia el CI correspondiente, que se hace visible en forma
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de una línea de precipitación. En una preparación que contenga varios antígenos, se obtendrán
múltiples líneas de precipitación.

La técnica de Ouchterlony permite identificar sustancias de acuerdo a la forma de unión de las

líneas de precipitación de dos o varios sistemas, generando bandas de precipitación cuyas
características dependerán de varios factores. Si la concentración es la que corresponde a la zona de
equivalencia la banda de precipitación estará situada aproximadamente en la distancia media que
separa los reservorios o pocillos. Cuando hay exceso de antígeno o anticuerpo, la banda estará más
próxima al pocillo del anticuerpo o del antígeno, respectivamente. Por medio de la Inmunodifusión
doble de Ouchterlony se pueden realizar análisis cualitativos y cuantitativos de antígenos y anticuerpos
en una solución, mediante una precipitación en gel de agarosa. Este sistema permite identificar las
bandas de precipitación mediante el empleo simultáneo de antígenos y anticuerpos conocidos. Se
pueden observar tres tipos de reacciones (figura 3):

 Reacción de identidad: los dos sistemas difunden en una única banda de precipitación.

 Reacción de no identidad: cada sistema reacciona independientemente, originando bandas

de precipitación que se cruzan.

 Reacción de identidad parcial: se produce cuando uno de los antígenos tiene menos de un
componente y es capaz de dar una reacción cruzada con un anticuerpo elaborado contra un
antígeno más simple. En este caso las bandas de ambos sistemas se unen y funden
parcialmente en una banda, apareciendo una prolongación o espolón. Esto indica que en este
antígeno hay componentes antigénicos no compartidos.

FIGURA 3. Interpretación de los posibles resultados a obtener por inmunodifusión doble de

Ouchterlony.
IV. MATERIAL POR EQUIPO:
Portaobjetos con agarosa al 1.5% en SSF con azida de sodio al 1%
Plantilla para hacer los orificios en el gel
Cortador de gel
Cámara húmeda
6 pipetas Pasteur con bulbo o capilares
Soluciones de antígeno (los empleados para inmunizar a los conejos)
Soluciones de antisueros (los obtenidos después de la inmunización)

V. PROCEDIMIENTO:

1. Con ayuda de un molde apropiado, se practican perforaciones al gel y el agar residual se

remueve con un sacabocados. La distribución de las perforaciones es la siguiente:
a. El pozo del centro se llena con el antisuero
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b. Los pozos adyacentes se llenan con diferentes antígenos (sueros)

2. Se improvisa una cámara húmeda, usando una caja de petri cuya tapa se recubre con un
disco de papel filtro húmedo.
3. Se colocan los portaobjetos en el interior de la cámara sobre aplicadores de madera.
4. Se incuban a temperatura ambiente durante 24 a 28 horas y se buscan bandas de
precipitación.

VI. RESULTADOS:

Dibujar el esquema de perforaciones utilizado, indicando que solución fué colocada en cada
perforación, así como las bandas de precipitación que hayan aparecido, señale que tipo de identidad
se da entre cada una de ellas y por qué ocurren (fundamente sus comentarios).

VII. Cuestionario:

1. ¿Cuál es la proporción de moléculas Ag y Ac y que ocurre en cada uno de los fenómenos de

prozona, zona equivalente y postzona?
2. ¿Cómo se puede hacer la prueba de Ouchterlony de forma semicuantitativa?
3. ¿En que tipo de medios puede realizarse las reacciones de precipitación y que nombre reciben en
cada tipo?
4. ¿Qué factores influyen en la reacción de precipitación?
5. ¿Qué nos indican el número de líneas de precipitación que se pueden observar en la prueba?
6. ¿Cuáles son las principales aplicaciones de la técnica?
7. ¿Cómo se interpretan los resultados?
8. ¿Define comparativamente la inmunodifusión radial de Mancini y Ouchterlony?

VIII. Discusiones

Discutir sobre la importancia de la técnica de Inmunodifusión de Ouchterlony como una

técnica inmunoquímica clásica más antigua, pero no por ello menos importante; . Y porqué esta
técnica es la mas frecuentemente usada para comparar antígenos complejos usando un sólo
antisuero.

IX. Conclusiones

Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

X. Referencias

 Murphy K, Travers P, Walport M (2009**) Inmunobiología de Janeway. México: McGrawHill.

 Owen J, Punt J, Stranford S. “Kuby Immunología” (2014*). Editorial Mc Graw Hill Education.
 Esparza-Gómez LD, Domínguez-Bernal G, Dómenech-Gómez A, Blanco-Gutierrez MM, Gibello
–Prieto A, Goyache-Goñi J, Sánchez-Vizcaino Rodríguez JM, Suárez-Rodríguez M, Cutuli de
#
Simón MT (2011 ). Compendio de guiones para clases teóricas en la asignatura Inmunología
en Veterinaria III: técnicas inmunológicas. REDUCA Serie Veterinaria 3 (15): 94-121.
 Fiorentino Gómez S, Gutierrez Fernández MF, Rueda Ardila NS, Rodríguez Rodríguez JA
#
(1994 ). La inmunología en el diagnóstico clínico. Colombia. Pontificia Universidad Javeriana.

* Edición que se encuentra en la biblioteca norte de la UAA

 15
** Edición que se encuentra en la biblioteca central de la UAA
# Estas fuentes de consulta no se encuentran en la biblioteca de la UAA
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PRACTICA No. 3
PRUEBA DE REACCIONES FEBRILES
APLICACIÓN DE LAS REACCIONES DE AGLUTINACION DIRECTA

I. OBJETIVOS:

Que el alumno:

1. Realice las reacciones febriles mediante la técnica de aglutinación rápida enplaca.

2. Determinará el título de anticuerpos específicos contra Salmonella typhi, S. paratyphi A y S.
paratyphi B; Brucella abortus, Proteus Ox19.

II. FUNDAMENTO:

Las reacciones de aglutinación son una interacción antígeno (aglutinógeno)-anticuerpo

(aglutinina), en dónde uno de los dos componentes se encuentra particulado. El resultado final se
observa por la presencia de grumos fácilmente visibles al ojo humano. Estas reacciones, dependiendo
de la naturaleza de los componentes se pueden clasificar en tres tipos:

 Directa: la aglutinina reacciona con un aglutinógeno presente de forma natural en una célula,
partícula vital.

 Pasiva indirecta: la aglutinina reacciona con una aglutinógeno que ha sido transferido de
forma pasiva sobre la superficie de una partícula vital (eritrocitos de carnero) o inerte (látex,
carbón activado o bentonita). La transferencia se hace mediante tratamiento químicos con
ácido tánico, bisdiazobencidina, cloruro crómico, glutaraldehído o cloruro cianúrico.

 Pasiva inversa: el aglutinógeno soluble reacciona con una aglutinina que ha sido transferido
pasivamente a la superficie de una partícula vital o inertepor métodos químicos.

Las reacciones febriles, son un conjunto de pruebas empleadas en el diagnóstico de

enfermedades infecciosas; que se caracterizan por la manifestación de una elevada temperatura de
forma recurrente. Las pruebas se fundamentan en la aglutinación de tipo directa, ya que consiste en la
búsqueda de anticuerpos específicos en contra de los diferentes microorganismos de este grupo,
Salmonella typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi B, Brucella melitensis, Rickettsia prowaseki. La técnica
consiste de tres tipos de reacciones:

Reacción de Widal:

La reacción de Widal, técnica desarrollada por primera vez por F Widal en 1896, tiene la
finalidad de detectar fiebre tifoidea en sueros de pacientes sospechosos de infección con S. typhi y con
reacción febril. Esta prueba consiste de cuatro suspensiones bacterianas, de S. typhi antígeno “O” y
antígeno “H”, S. paratiphy “A” y “B” (Olopoenia y King, 2000).

Valor clínico: las reacciones aglutinantes tienen capacidad diagnóstica después de 10 días de
iniciarse la enfermedad. Títulos bajos pueden corresponder a otras salmonelosis. En las fiebres
tifoideas y paratifoideas las aglutininas O aparecen hacia el octavo día de la enfermedad y las
aglutininas H hacia el 10-12° día. Por tanto, en el período de infección actual habrá simultáneamente
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aglutininas O y H, alcanzando estas últimas un título mas elevado. La variación del titulo de las
aglutininas (en dos diluciones al menos para que sean significativas) se pone de manifiesto con dos
muestras de suero extraídas con 7-10 días de intervalo. En los sujetos vacunados sólo las aglutininas
H persisten más allá de tres meses. La aparición de aglutininas O es signo de infección. Cabe señalar,
que la prueba puede ser positiva en pacientes con malaria o infectados con otras enterobacterias.

Reacción de Weil Felix:

La reacción de Weil Felix se basa en la búsqueda de anticuerpos a varias especies de Proteus

los cuales comparten antígenos glucolípídicos con Rickettsia, a excepción de R. akari. Las especies
utilizadas para esta prueba son Proteus vulgaris OX-2, Proteus vulgaris OX-19 y Proteus mirabilis OX-
K, siendo el segundo el de mayor espectro, ya que reacciona con suero de personas infectadas con
Riketsias productoras de tifus así como con fiebre de las montañas rocosas (Mahajan y cols., 2006).

Valor clínico: La reacción se hace positiva a partir del día 5 a 10 de la aparición de los
síntomas, con mayor frecuencia en el día 12, principalmente por anticuerpos de la clase IgM. Los
anticuerpos permanecen elevados durante los primeros 5 meses de la convalecencia y por lo tanto es
positiva a títulos decrecientes hasta su negatividad. Un solo título de ≥1:320 o incremento de 4 veces o
más en pruebas repetidas, comenzando con un título de 1:40, se consideran positivas.

Reacción de Huddleson:

Este prueba consiste de una suspensión bacteriana de Brucella abortus de baja virulencia y en
fase lisa, que reacciona con sueros de pacientes con brucelosis, también conocidas como fiebre de
malta o fiebre ondulante, provocada por Brucella melitensis.

Valor clínico: Valor clínico. Las inmunoglobulinas que aparecen durante la brucelosis humana
inician su aparición en el suero a las dos semanas y alcanzan su máxima concentración entre el
primer y segundo mes. Títulos menores de 1:80 son dudosos pues en áreas endémicas pueden existir
títulos bajos de aglutininas en pacientes sin brucelosis. También es factible que el título bajo
corresponda a una aglutinación cruzada en individuos vacunados contra cólera o tifoidea.

El título que tiene una alta presunción de la enfermedad es el que está en 1:160. La prueba en
tubo es más sensible que la de placa, en donde en esta última con frecuencia dan falsos resultados
negativos o positivos. Además el paciente debe ser evaluado a los 30, 60, 90 y 180 días.

III. REACTIVOS

 1 juego de antígenos para reacciones febriles; antígeno "O" y "H" de S. typhi, A y B de S.

paratyphi; antígeno de Proteus OX 19 y antígeno de Huddleson.
 Sueros problema.

IV. MATERIAL Y EQUIPO:

 5 placas de vidrio para pruebas febriles, divididas en 6 partes.

 10 palillos de madera o plástico.
 5 pipetas de 0.1 ml divididas en centésimas.
 2 lámparas
 18
 2 agitadores mecánicos

V. METODOLOGÍA:

1. Coloque 0.4 ml de suero problema en cada una de las 6 divisiones de la placa (una placa por cada
suero).
2. Cada una de las divisiones corresponderá a un antígeno diferente. Comenzando por el ángulo
superior izquierdo de la placa, se agrega 1 gota de cada antígeno.
3. Mezcle las dos gotas de cada división con palillos diferentes.
4. Coloque la placa sobre un agitador mecánico y deje en agitación durante 2 min a 125 rpm.
5. Coloque la placa sobre una lámpara y busque aglutinaciones.
6. En caso de que aparezca aglutinación de alguno de los antígenos con alguno de los sueros, tome
otra placa y en ella deposite los siguientes volúmenes de dicho suero: 0.08 ml (dil 1:20 con
respecto a los 0.4 ml originales) 0.04 ml (dil 1:40), 0.02 ml (dil 1:80), 0.01 ml (dil 1:160) y 0.005 (dil
1:320).
7. Agregue 1 gota del antígeno en cuestión a cada gota de suero, mezcle bien con palillos, agite y
lea igual que en los pasos 4 y 5.

VI. RESULTADOS:

El título del suero se informa como la recíproca de la dilución más alta en la que todavía se
observa aglutinación.

El hallazgo de títulos de 20 a 40 no es significativo, puesto que muchos individuos de la

población general los tienen debido a contactos previos con los gérmenes en cuestión, que no
necesariamente representan la presencia de una enfermedad. Los resultados tienen valor diagnóstico
cuando se analizan varias muestras sucesivas y se observan cambios en el título de anticuerpos. Cabe
señalar que estas son solo pruebas de escrutinio auxiliares en el diagnóstico de las respectivas
infecciones

VII. OBSERVACIONES:

CRITERIOS DE INTERPRETACION DE RESULTADOS EN REACCIONES FEBRILES, PARA

REALIZAR UN DIAGNOSTICO SON:
 FIEBRE TIFOIDEA : Títulos de Ac. Mayores de 1:320 para Ag.Tífico “O” y mas de 1:80 para
Ag.Tífico “H”, mas los signos y síntomas clínicos sugestivos de esta enfermedad.
 SALMONELOSIS: Títulos de Ac. mayores de 1:320 para Ag. “O” y mas de 1:80 en Ag. paratífico A
ó B., mas los signos y síntomas clínicos sugestivos de esta enfermedad.
 RICKETSIOSIS: Títulos mayores de 1:320 para Proteus OX-19, en este caso se sugiere solicitar
los Ac. Anti-Rickettsia.
 BRUCELOSIS: Cualquier Título Huddleson, con Rosa de Bengala positivo y los síntomas
sugestivos.

SE RECOMIENDA REALIZAR LAS SIGUIENTES PRUEBAS ANTE LA DUDA Ó CUANDO EL

PACIENTE NO RESPONDIÓ COMO SE ESPERABA AL TRATAMIENTO ADMINISTRADO.

Primero, suspender el tratamiento con antibióticos y posteriormente solicitar al laboratorio:

 19
o HEMOCULTIVO , en pico febril y seriado de preferencia ( 2 ó 3 ), cuando se sospecha de
Brucelosis ó Fiebre Tifoidea.
o 2 MERCAPTOETANOL Y SAT , en caso de sospecha de Brucelosis fase activa.
o COPROCULTIVO , en caso de sospecha de Fiebre Tifoidea ó Salmonelosis.
o AANTICUERPO ANTI-Rickettsia Y ANTICUERPOS ANTI-Leptospira al sospechar de
Ricketsiosis, cuando existe un resultado previo para Proteus OX19 positivo y sintomatología
sugestiva.

VIII. CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es el fundamento de la técnica de las reacciones febriles?

2. ¿Por qué se utiliza suspensiones de Proteus OX19 para determinar la presencia de aglutininas
contra las riketssias productoras de tifus?
3. ¿Cuándo se hace positiva la reacción con el Ag de Brucella abortus que consideraciones deberán
tomarse en cuenta par su interpretación?
4. ¿Cuál es la importancia del antígeno Vi presente en la Salmonella?
5. ¿Por qué esta reacción recibe el nombre de Febriles?

IX. DISCUSIONES: Analizar los resultados obtenidos y discutir anormalidades.

X. CONCLUSIONES: Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados
obtenidos.

XI. BIBLIOGRAFÍA: Incluir las fuentes de información consultadas, proporcionando sus datos
completos.

 Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. “Inmunología celular y molecular” (2008*). Editorial Elsevier
Saunders.
 Owen J, Punt J, Stranford S (2014*). “Kuby Immunología”. Editorial Mc Graw Hill Education.
 Rojas Espinosa O: “Inmunologia (de memoria)” (2006*) Editorial Médica Panamericana.
+
 Olopoenia LA, King AL (2000 ). Widal agglutination test-100 years later: still plagued by
controversy. Postgraduate Medical Journal; 76: 80-84.

* Edición que se encuentra en la biblioteca norte de la UAA

+
Edición que se encuentra en la biblioteca virtual de la UAA
 20
PRACTICA No. 4
DETERMINACIÓN DEL FACTOR REUMATOIDE EN EL DIAGNÓSTICOS DE ARTRITIS
REUMATOIDE

REACCION DE AGLUTINACION PASIVA INDIRECTA

I. OBJETIVOS:

Que el alumno:

1. Determinar la concentración semicuantitativa de FR en muestras de suero problema

2. Comprender la importancia clínica de la determinación del factor reumatoide en la Artritis
reumatoide.
3. Comprender el principio de la reacción de aglutinación pasiva inversa.

II. FUNDAMENTO.

La artritis reumatoide es una enfermedad autoinmune sistémica, principalmente con

afecciones en las articulaciones. Esta enfermedad se caracteriza por la amplia infiltración de linfocitos
+
TCD4 , en el líquido sinovial, generando su inflamación, inclusive su destrucción. Además, durante el
desarrollo de la enfermedad, esta bien caracterizada la producción de autoanticuerpos dirigidos
contra la fracción cristalizable de la IgG, mejor conocidos como factor reumatoide (FR) y contra
proteínas citrulinadas (APC) (Aletaha y cols., 2015; Sayah y English, 2005). De ahí que la
determinación de la concentración de estos anticuerpos son herramientas importantes en el
diagnóstico de la enfermedad.

El factor reumatoide se puede generar, en personas sanas, con enfermedades autoinmunes o

infecciones crónicas virales o bacterianas, como consecuencia de estimulación crónica por
inmunocomplejos o mimetismo molecular. Específicamente, el FR puede pertenecer a los isotipos
IgM, IgG e IgA (Gorevic, 2012). Así mismo, altos niveles de IgM e IgG correlacionan con la actividad
de la artritis reumatoide; mientras que altos niveles de IgM junto con la IgA muetran un alto valor
predictivo de la enfermedad. De ahí la importancia que adquiere la determinación de IgM (Sayah y
English, 2005).

Una forma rápida de detección del FR se fundamenta en técnicas de aglutinación, la cual

resulta una buena prueba de escrutinio, en donde el FR detectado es IgM, Este se encuentra en el
80% de los pacientes con artritis reumatoide (Aletaha y cols., 2015). El primer método desarrollado fue
el propuesto por Waaler-Rose en 1940, donde se enfrenta la muestra problema a una suspensión de
glóbulos rojos de carnero recubiertos con IgG específicos a estos. Posteriormente surgió la técnica de
Singer-Plotz misma que emplea partículas de látex sensibilizadas con la IgG humana.Resultando más
sensible que la primera aunque no más específica. Por lo tanto, la técnica de Waaler-Rose se
considera positiva con títulos superiores a 1/32, mientras que Singer Plotz, superiores a 1/60. La
especificidad se puede ver mejorada con la inactivación de los sueros problemas, ya que se eliminan
factores antiglobulínicos así como algunos inhibidores (Díaz Portillo y cols., 1997).

Interpretación clínica de la detrección de FR:

 21
Una vez que se obtienen valores positivos en la prueba de Singer Plotz, es importantante
confirmarla por una prueba de Waaler-Rose o mejor aún sustituirlas por una prueba en donde se
utilicen partículas de látex recubiertas de IgG de conejo. Además, es preciso tener presente que
cuando se detecta FR en una muestra problema, es necesario llevar a cabo, al menos, una semi-
cuantificación de los mismos.

Por otro lado tiene que quedar claro que, aunque en el 80% de los pacientes con artritis
reumatoide se detectan FR en su suero (Artritis reumatoide seropositiva), este hallazgo no puede
establecer por sí sólo el diagnóstico de artritis reumatoide, sino que es un dato más en su consecución.
Esto se debe a que no se detectan FR en algunas artritis reumatoides (Artritis reumatoides
seronegativas) y, sin embargo, sí se pueden encontrar en otras circunstancias como:

 Otras enfermedades reumáticas: la sarcoidosis o el lupus.

 Enfermedades no reumáticas: endocarditis bacteriana, tuberculosis, sífilis, mononucleosis
infecciosa, etc.
 En un 5% de la población sana.

Sin embargo, el estudio de los FR en el suero es mucho más útil desde el punto de vista del
pronóstico. Debido a que las artritis reumatoides con títulos altos de FR suelen presentar una
afectación más grave y progresiva, que incluye manifestaciones extra-articulares. Además, puede
suceder que desaparezcan los FR del suero de los enfermos de artritis reumatoide cuando ésta remite
bajo el tratamiento.

III. REACTIVOS

 Suspensión de partículas látex forradas con gamma globulina humana (IgG humana).
 Suero control (+)
 Suero control (-)
 Sueros problemas
 Buffer tris-glicina-salina (glicina, NaCl, tris, azida de sodio y agua destilada)

IV. MATERIAL Y EQUIPO

 Micropipetas de 10 a 100 μl
 Agitadores (popotes agitadores)
 Placa para aglutinación

V. METODOLOGIA:

1. Diluya el suero 1:20 con buffer tris-glicina salina.

2. Marque la placa de la siguiente manera:
 22

FIGURA 5. Plantilla para lectura de aglutinación.

3. En el compartimiento problema, ponga una gota de la dilución del suero problema (50 L).
4. Añada tanto en el compartimiento control (+) y control (-) una gota de cada uno de los
controles correspondientes (+) y (-).
5. Añada a cada uno de ellos una gota de la suspensión de partículas látex sensibilizadas (50
L).
6. Mezcle con movimientos rotatorios empleando para ello los popotes de plástico.
7. Observe la reacción de aglutinación.

VI. RESULTADOS

 Siempre debe aparecer una aglutinación en el primer círculo.

 La prueba es positiva si sale una aglutinación en el segundo círculo y no aparece aglutinación
en el tercero.
 La prueba es negativa si no se forma aglutinación ni en el segundo ni el tercer círculo.
 La prueba es ininterpretable si aparece aglutinación en el segundo y en el tercer círculo. Esto
se debe a la presencia de heteroaglutininas en el suero problema.

VII. OBSERVACIONES: Se refiere a observaciones durante el desarrollo de la práctica, tales

como fuentes de error, precauciones, comentarios, aclaraciones a la técnica, etc. No repetir la
descripción de los pasos de la técnica.

VIII. CUESTIONARIO:

1. Mencione por lo menos 5 padecimientos diferentes a la artritis reumatoide, en donde pueden

resultar elevados los FR.
2. ¿En qué casos pueden resultar falsos positivos?
3. Mencione otras técnicas para la determinación de autoanticuerpos.
4. ¿Como confirmaría el diagnóstico de artritis reumatoide?

IX. DISCUSIONES: Discutir solamente en base a los resultados obtenidos en caso de ser
necesario al observarse valores anormales.
 23

X. CONCLUSIONES: Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los

resultados obtenidos.

XI. BIBLIOGRAFÍA: Incluir las fuentes de información consultadas, proporcionando sus datos
completos.

 Delves PJ, Martin SJ, Burton DR, Roitt IM (2003*). Roitt’s Essential Immunology. United
Kingdom: Wiley-Blackwell.
 Owen J, Punt J, Stranford S (2014*). “Kuby Immunología”. Editorial Mc Graw Hill Education.
+
 Aletaha D, Alasti F y Smolen JS (2015 ). Arthritis Research & Therapy; 17: 229-239.
+
 Díaz Portillo J, Fernández del Barrio, Paredes Salido F (1997 ). Aspectos básicos de bioquímica
clínica. Ediciones Díaz de Santos.
+
 Gorevic PD (2012 ). Rheumatopid Factor, Complment, and Mixed Cryoglobulinemia. Clinical
and Developmental Immunology. 6p.
+
 Sayah A y English III JC (2005 ).Rheumatoid arthritis: A review of the cutaneous manifestations.
Journal of the Academy of Dermatology; 53: 191-209.

* Edición que se encuentra en la biblioteca norte de la UAA

+
Edición que se encuentra en la biblioteca virtual de la UAA
 24

PRACTICA No. 5
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA C-REACTIVA COMO MARCADOR DE
INFLAMACIÓN

REACCION DE AGLUTINACION PASIVA INVERSA

I. OBJETIVOS:

1. Definir el mecanismo de la inflamación.

2. Determinará la concentración de la proteína C-reactiva en el suero de un individuo mediante la
técnica de aglutinación pasiva inversa.
3. Comprender la importancia de la cuatnificación de la proteína C-reactiva como un marcador de
inflamación.

II. INTRODUCCIÓN:

De acuerdo a Celso (siglo I d.C) la inflamación se caracteriza por la presencia de

enrojecimiento, hinchazón, temperatura y dolor, características a las que más tarde el médico
Galeno (siglo II) le agregó la pérdida de la función. Actualmente sabemos que esto es un reflejo de
la vasodilatación, por lo tanto aumento del volumen sanguíneo en la, zona calentando el tejido y
desencadenando el enrojecimiento. A su vez, hay un incremento de la permeabilidad vascular que
lleva al escape de líquido generando la presencia de edema.

Ante una agresión a nuestro organismo, ya sea por la presencia de microorganismos,

presencia de sustancias perjudiciales o lesión física, las células de la respuesta inmune como
macrófagos, se activan ante la presencia de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP)
o asociados a daño (DAMP), induciéndolas a liberar TNF-α, IL-1, IL-6, entre otros. Estos
mediadores, son el partiaguas del inicio de la inflamación de forma localizada o sistémica,
dependiendo del tamaño de la lesión. A Nivel ssitémico, estas citocinas actúan sobre el hígado,
induciendo la respuesta de fase aguda para la resolución de la respuesta inflamatoria. Esta etapa
se caracteriza por la producción de proteínas por parte del hígado principalmente, que reciben el
nombre de proteínas de fase aguda.

Generalmente, la inflamación es un mecanismo benéfico, que tiene como finalidad la

eliminación de agentes patológicos de nuestro organismo. Sin embargo, cuando este sale de
control, puede ser nocivo para nuestra salud, e incluso ocasionar la muerte. De ahí que se
importante, llevar un control sobre esta respuesta, para su optimización y reducción de riesgos.

En este sentido, las proteínas de fase aguda, son un buen indicador de inflmación. Así, la
proteína C reactiva (P-CR o CRP) es un marcador biológico interesante de la severidad de la
respuesta inflamatoria. A esta glicoproteína, la cual recibe su nombre por su propiedad de
precipitar al reaccionar con el polisacárido C del neumococo, le ha asociado a una gran variedad
de enfermedades infecciosas, a procesos inflamatorios no infecciosos y a ciertos padecimientos
malignos.

La proteína C-reactiva aparece en el suero en forma de complejo de glicoproteína. En

condiciones normales, su concentración suele ser muy baja (<5 mg/dL); sin embargo, aumenta
muy rápidamente cuando se inicia una reacción inflamatoria, permanece elevada a lo largo de la
misma y disminuye velozmente cuando ésta cesa. La elevación de la P-CR suele guardar un
 25

cierto paralelismo con el aumento de la velocidad de sedimentación globular (VSG). Pero la P-CR
sube más rápidamente que la VSG, al inicio del proceso inflamatorio, y baja también con mayor
rapidez cuando éste termina.

Tradicionalmente se ha venido cuantificando mediante una técnica de aglutinación pasiva

inversa, la cual consiste en una suspensión de partículas de látex de tamaño uniforme,
sensibilizadas con la fracción gammaglobulina de un suero específico contra la P-CR (anticuerpos
anti-P-CR de clase IgG) humana. La reacción se pone de manifiesto al unir el antígeno (P-CR)
con el anticuerpo anti-P-CR. Cuando existe la proteína, la suspensión de látex pierde su aspecto
uniforme y se aprecia una clara aglutinación al reaccionar la IgG unida a las partículas látex, con
la proteína. La sensibilidad de esta reacción está comprendida entre 7±1 mg/L y 200 mg/L.

Se han valorado cifras normales de P-CR en el recién nacido, igual a 0.10 mg/dL. De 0.17
mg/dL en el infante y en los adultos una cifra promedio de 0.47 mg/dL, sin pasar de 0.90 mg/dL.

III. REACTIVOS

 Suero problema
 Control positivo
 Control negativo
 Partículas látex recubierta con anti-P-CR

IV. MATERIAL Y EQUIPOS

 Micropipetas
 Puntas
 Placas para aglutinación
 Palillo de madera

V. METODOLOGIA:

1. Coloque los reactivos y el suero problema a 18-25 ° C.

2. Deposite sucesivamente en distintos círculos de una tarjeta:
 1 gota (50 L) de suero testigo positivo.
 1 gota (50 L) de suero testigo negativo.
 50 L de suero problema.
 10 L de suero problema.
3. Ponga, al lado de cada una de las gotas anteriores, otra de látex anti-P-CR que se ha
homogeneizado previamente muy bien.
4. Mezcle las 2 gotas de cada círculo, mediante un palillo y extiendalas.
5. Mueva de forma rotatoria la tarjeta.
6. Observe la posible aparición de una aglutinación en 3 a 5 minutos

VI. LECTURA DE LOS RESULTADOS:

Siempre debe aparecer una aglutinación (resultado positivo) en el círculo donde se

ha depositado el suero testigo positivo, y nunca debe surgir una aglutinación (resultado
 26

negativo) en el círculo donde se ha colocado el suero testigo negativo. Para la lectura del
suero problema se debe hacer de la siguiente manera:

TABLA 3. Determinación de la contración de P-CR.

Círculo con 10 µl de suero Círculo con 50 µl de suero Concentración de P-CR

Resultado - Resultado - <7 mg/L
Resultado - Resultado + 7-20 mg/L
Resultado + Resultado + 20-200 mg/L
Resultado + Resultado - > 200 mg/L

INTERPRETACION
La elevación de la P-CR refleja, casi siempre, la presencia de un proceso inflamatorio (no
necesariamente reumático. También aumenta en muchos tipos de neoplasias* malignas, sobre
todo si han metastatizado. Es, pues, muy inespecífico.

La elevación de la P-CR es útil desde el punto de vista del pronóstico, pues nos indica la
intensidad del proceso patológico que la origina e, incluso, la respuesta del paciente al tratamiento

VALOR CLINICO:

La reacción POSITIVA es muy constante en artritis reumatoide y fiebre reumática. En

meningitis bacteriana lo es y no en la viral. Cuando el tratamiento es efectivo, baja su nivel
paulatinamente a NEGATIVA

VII. CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es el mecanismo de liberación de la P-CR?
2. ¿Qué indican los niveles altos de P-CR?
3. ¿Qué puede generar falsos positivos?
4. ¿Qué puede generar falsos negativos?
5. ¿Bajo qué condiciones puede ser importante la determinación de P-CR para el diagnóstico?

VIII. DISCUSIONES.
Discutir solamente en base a los resultados obtenidos en caso observar valores anormales.

IX. CONCLUSIONES:
Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

X. BIBLIOGRAFÍA:
Incluir las fuentes de información consultadas, proporcionando sus datos completos.
 Delves PJ, Martin SJ, Burton DR, Roitt IM (2010*). Roitt’s Essential Immunology. United
Kingdom: Wiley-Blackwell.
 Owen J, Punt J, Stranford S (2014*). “Kuby Immunología”. Editorial Mc Graw Hill Education.
 Rojas Espinosa O (2006*). “Inmunologia (de memoria)” Editorial Médica Panamericana.
 Stites DP, Terr AI, Parslow TG (1990*). “Inmunología básica y clínica”. Editorial Manual
Moderno.
* Edición que se encuentra en la biblioteca norte de la UAA
 27

PRACTICA No.6
TIPIFICACION DE GRUPOS SANGUINEOS, SISTEMAS ABO Y Rh
(REACCION DE AGLUTINACIÓN DIRECTA)

I. OBJETIVO.

Al finalizar la práctica, el alumno a de ser capaz de:

1. Comprender los principios de la tipificación celular (prueba directa) y sérica (prueba inversa).
2. Realizar la tipificación de los grupos sanguíneos del sistema ABO y Rh por medio de la
tipificación celular y detección sérica.
3. Analizar la importancia clínica que posee la determinación de los grupos sanguíneos de los
sistemas ABO y Rh.

II. INTRODUCCION:

Los glóbulos rojos poseen en su membrana diferentes macromoléculas a diferente

concentración y profundidad, con capacidad antigénica. Algunas de estas macromoléculas están
relacionadas entre sí, lo que les premite ser agrupadas de acuedo a sus afinidadades,
permitiéndonos clasificarlas en sistemas sanguíneos. Un sistema sanguineo corresponde a un
grupo de antígenos eritrocitarios que comparten ciertas características en común, como la
estructura química, los genes involucrados en su codificación, la herencia independiente, la
topografía en la membrana, etc. La Sociedad Internacional de Transfusión Sanguínea (ISBT por su
nombre en inglés) ha reconocido hasta el momento 33 sistemas de grupos sanguíneos, mismos
que representan a 300 antígenos. Los cuales, son proteínas o carbohidratos unidos a lípidos o
proteínas en el exterior de la membrana de glóbulos rojos, y que se les ha demostrado que inducen
la producción de anticuerpos específicos y que se heredan (Mitra y cols., 2014, Reid M y cols.,
2013). Algunos de estos sistemas se representan en la tabla 4.

TABLA 4. Sistemas de grupos sanguíneos (Adaptada de Mitra y cols., 2014).

No. ISBT Sistema No. de antígenos Genes Cromosoma CD*

001 ABO 4 ABO 9, 19 -
002 MNS 43 GYPA, GYPB, GYPE 4 CD235
003 P 1 P1 22 CD77
004 Rhesus 49 RhD, RhCE 1 CD240
005 Lutheran 20 LU 19 CD239
006 Kell 25 KEL 7 CD238
007 Lewis 6 FUT3 19 -
008 Duffy 6 FY 1 CD234
009 Kidd 3 SLC14A1 18 -
010 Diego 22 DI, SLC4A1 17 CD233
*CD: Cluster of differentiation

SISTEMA ABO

El primer sistema en ser definido fue el sistema ABO, descubierto en 1901, por
Landesteiner, que ha sido el mejor estudiado en lo relativo a su composición química. Los
 28

antígenos de este sistema tienen una naturaleza química de carbohidratos, de tal forma que los
genes de este sistema no codificaran para el antígeno directamente sino para la producción de
glucosiltransferasas. Enzimas que permiten la transferencia de azúcar inmunodominante específico
a la proteína precursora; este proceso se lleva a cabo en el paso que va del retículo endoplásmico
rugoso al aparato de Golgi, como parte integral del mecanismo postraduccional. Cuando la
trasferencia es completa se genera un determinante antigénico (Kabat, 2013).

Los genes reguladores están situados en dos loci: el Hh y el ABO. El locus Hh puede
contener los alelos H (dominante) o h (recesivo) y está localizado en el cromosoma 19. El gen H
codifica para la síntesis de la enzima fucosiltransferasa, que añade un residuo de L-fucosa a una
sustancia precursora, formándose la sustancia H. Esta sustancia representa el precursor que bajo
la influencia del gen A y B se convierte en el grupo A o B respectivamente. Cabe señalar, que
existen individuos que son homocigotos para una mutación recesiva (h) que codifica una enzima
defectuosa, incapaz de transferir L-fucosa; por lo tanto, tampoco hay expresión de los antígenos A
y B. A este grupo sanguíneo se le denomina Bombay. Por otro lado, el locus ABO está ubicado en
el cromosoma 9 y en el pueden localizarse los tres genes alélicos (alelos) A, B o O. El gen A
codifica la producción de N-acetil-D-galactosaminiltransferasa, misma que adiciona N-acetil-
galactosamina a la mayor parte de la sustancia H, transformándola en Sustancia A. Por el
contrario el gen B codifica la síntesis de D-Galactosiltransferasa que añade un residuo de D-
galactosa, transformando la sustancia H en sustancia B. El gen O es un gen amorfo que
genera proteínas sin actividad enzimática; por lo tanto, no altera la estructura de la sustancia H.
Resumiendo, los genes A y B codifican la expresión de las sustancia A y B, mientras que el gen O
no dirige la síntesis de ningún isoantígeno (tabla 5) (Rodriguez Moyado y cols., 2004).

TABLA 5. Antígenos y transfereasas de los diferentes grupos sanguíneos del sistema ABO.

Grupo Sustancia Transferasa

A A (N-acetil-galactosamina) N-acteil-D-galactosaminiltransferasa
B B (G-galactosa) D-galactosiltransferasa
AB AyB N-acteil-D-galactosaminiltransferasa y D-
galactosiltransferasa
O Ninguna Ninguna

La importancia clínica de los antígenos del sistema ABO, radica en la existencia de

anticuerpos de forma natural (tipo IgM) en todos los individuos a partir de que se adquiere la
capacidad de montar una respuesta inmunológica por cuenta propia, Ya que hemos de recordar,
que los anticuerpos circulantes durante los primeros meses de vida provienen de la madre. La
producción de estos anticuerpos obedece a la existencia de xenoatígenos, principalmente de
origen bacteriano, Sin embargo la estructura bioquímica de estos, posee semejanza con azúcares
ampliamente distribuido en el humano, sustancia A y B. De ahí que, los individuos con el antígeno
A, solo presentan anticuerpos contra el antígeno B y viceversa; o que los del grupo sanguíneo O
tengan anticuerpos anti-A y anti-B; mientras que los AB no presenten ninguno (Rodriguez Moyado
y cols., 2004).

SISTEMA Rh

El segundo grupo de importancia clínica es el sistema Rh. En 1940, Landsteiner y Kiener

descubrieron otro antígeno como resultado de la inmunización de cobayos y conejos con sangre de
monos de la especie Macacus rhesus, basándose en la suposición de que en los eritrocitos de
 29

estos monos podrían existir antígenos similares a los de humanos pero que aún no se hubieran
descubierto en los glóbulos rojos humanos. Se pensó que los aglutinógenos entonces
desconocidos pero existentes en la sangre humana empleada para inmunizar los animales
tendrían que competir con antígenos más potentes, que eran los conocidos en esa época (A, B, M,
N y P) por lo que la formación de anticuerpos contra antígenos más débiles podría quedar
suprimida o enmascarada por los más fuertes. Después de absorber los anticuerpos conocidos
(Anti-A, Anti-B, Anti-M, etc.), el suero de los conejos que habían recibido eritrocitos de mono rhesus
reaccionó con los eritrocitos del 85% de las personas de raza blanca estudiadas. Los individuos
que reaccionaron fueron denominados Rh positivos (Rh+) y los que no reaccionaron Rh negativos
(Rh-).

Actualmente se sabe que el sistema Rh está determinado por tres pares de genes
alelomorfos Cc Dd Ee los cuales codifican para 5 sustancias químicas definidas C, c, D, E y e ya
que la existencia del alelo d es puramente hipotética puesto que no se ha encontrado su producto,
o sea la sustancia d. Por su potencia inmunogénica la substancia más importante es la D, que es
la que se determina en el laboratorio con el suero anti-D (anti-Rh) y es como se proporciona el
criterio de Rh (+), Rh (-) según sea el resultado de la prueba. De este sistema, solamente se
determina en forma rutinaria la presencia del antígeno D (Rh) debido a que puede inducir una
respuesta inmune, indeseable, cuando los glóbulos rojos Rh (+) entran en contacto con el sistema
inmune de sujetos Rh (-). Esto puede ocurrir de modo natural en el caso de madres Rh (-) con
productos (+) o de modo artificial en el caso de transfusiones.

TIPIFICACIÓN SANGUÍNEA:

El hecho de que se produzcan anticuerpos contra el antígeno que no poseemos, le da mayor

importancia a la tipificación sanguínea, ya que esto da las bases para el éxito de la transfusión
sanguínea, estudios de etiología de ciertas enfermedades, estudios antropológicos y lo hace una
buen herramienta para la medicina legal. De forma rutinaria los sistemas que más se tipifican son
los del sistema ABO y Rh, por su importancia clínica y capacidad inmunogénica.

Los métodos para la determinación de los grupos sanguíneos se fundamentan en una

reacción de aglutinación directa, debido a que los antígenos se encuentran en la membrana de los
eritrocitos (antígeno particulado), Estos se realizan de dos maneras, en la primera se determina la
presencia de antígenos, y esto se conoce como detección celular o prueba directa y en la segunda
se desafía los anticuerpos circulantes contra eritrocitos de fenotipo conocido y se conoce como
detección sérica.

DETECCIÓN CELULAR (ANTÍGENOS ABO Y Rh)

 La detección celular del grupo sanguíneo ABO que recibe también el nombre de tipaje
globular ABO se puede realizar mediante la técnica en placa o mediante la técnica en tubo.
En ambos casos, los glóbulos rojos problema, que contienen sustancias antigénicas del
sistema ABO, se ponen en contacto con antisueros específicos dirigidos contra esos
antígenos. El resultado final de esta determinación consiste en la aglutinación directa de
los eritrocitos cuando reaccionan con el antisuero que les corresponda.

 La detección celular del grupo sanguíneo Rh. La presencia del antígeno D en la

membrana de los glóbulos rojos se detecta por enfrentamiento de los eritrocitos problema a
 30

un suero anti-D. El resultado final de esta determinación consiste en la aglutinación directa

de los glóbulos rojos Rh+, cuando reaccionan contra su antisuero específico

DETECCIÓN SÉRICA (ANTÍGENOS ABO)

Como ya hemos vito anteriormente, todos los individuos adultos tienen en su suero
anticuerpos dirigidos contra los antígenos del sistema ABO que no poseen sus glóbulos rojos.
Estos anticuerpos reciben el nombre de aloanticuerpos y presentan las siguientes características:

1. Son de aparición natural

2. Generalmente son de la clase IgM
3. Son capaces de activar el complemento y originar una rápida destrucción intravascular
de los GR
4. Aglutinan mejor a los GR a temperatura ambiente que a 37 º

Los aloanticuerpos dirigidos contra los antígenos del sistema ABO se detectan enfrentando
el suero que los contiene con glóbulos rojos tipados, es decir, con glóbulos rojos cuyo grupo ABO
es conocido. Esta determinación sólo puede realizarse mediante la técnica de tubo y aunque es
una reacción de aglutinación directa, se dice que es INVERSA, pues en el se buscan los
anticuerpos presentes en el suero y no los antígenos propios de los glóbulos rojos.

III. REACTIVOS

 Antisueros (anti-A, anti-B y anti-D)

 Solución salina fisiológica al 0.85% ó 0.9%.
 Glóbulos rojos tipados A (G.R. A)
 Glóbulos rojos tipados B (G.R. B)
 Suero problema

IV. MATERIAL Y EQUIPO

 Placas excavadas de porcelana o de vidrio.

 Aplicadores de madera.
 Lancetas estériles.
 Torundas alcoholadas.
 Gradilla metálica.
 Tubos de ensayo de 13 x 100mm
 Tubos de ensayo de 13 x 75mm.
 Pipetas Pasteur con bulbo
 Centrífuga
 Baño María a 37 º C

V. PROCEDIMIENTO

DETECCIÓN CELULAR DEL GRUPO SANGUÍNEO DEL SISTEMA ABO Y Rh

1. Rotule una placa de porcelana o portaobjetos de la siguiente manera: anti-A, anti-B y anti-D
 31
2. Haga asepsia en el dedo anular y con una lanceta pinche el dedo del compañero al que le vaya
a tomar muestra.
3. Coloque una gota de sangre en la placa que tiene las marcas anti-A, anti-B, anti-D.
4. Cerca de cada gota, agregue una gota de suero comercial anti-A, anti-B, anti-D, según
corresponda. Mezcle primero suavemente con ayuda de un palillo y después con movimientos
rotatorios.
5. Busque la presencia de aglutinación antes de 2 minutos.

Lectura de los resultados: Hay aglutinación cuando aparecen unos grumos rojos que flotan en un
líquido claro. En el caso contrario, los glóbulos rojos permanecen en forma de suspensión homogénea.
Los resultados se interpretan como se indica en la tabla 6, en base a la presencia o no de aglutinación
para el sistema ABO. En el caso del sistema Rh, solo se reporta con un símbolo + si hay aglutinación,
o – si no.

TABLA 6. Reaccion de los eritrocitos en placa.

GRUPO
ANTISUEROS COMERCIALES
SANGUÍNEO
anti-A anti-B
+ + AB
+ - A
- + B
- - O

DETECCIÓN SÉRICA DEL SISTEMA ABO

1. Marque un tubo de ensaye con la letra A (de G.R. A), otro con la letra B (de G.R. B) y un tercero
con la letra C (control).
2. Coloque dos gotas del suero problema en cada uno de los tres tubos
3. Añada una gota de glóbulos rojos A en tubo A, una gota de glóbulos rojos B en el tubo B y una
gota de glóbulos rojos problema en el tubo C.
4. Mezcle mediante aglutinación suave.
5. Centrifugue a unas 3 500 r.p.m., durante 30 segundos aproximadamente.

Lectura de los resultados

Agite suavemente el botón de los glóbulos rojos del fondo del tubo, golpeando el extremo
inferior de los tubos, suave y sucesivamente con los dedos. Hay aglutinación cuando aparecen unos
grumos rojos que flotan en un líquido claro. En caso contrario los glóbulos rojos se resuspenden
homogéneamente dando lugar a un líquido de color rojizo.

Interpretación clínica de los resultados obtenidos

De acuerdo a los resultados obtenidos se determinará el grupo sanguíneo como se indica en la

tabla 7.

TABLA 7. Reacción de los eritrocitos en tubo.

 32
Anticuerpos presentes Grupo
Tubo A Tubo B Tubo C en el suero sanguíneo
- - - Ninguno AB
- + - anti-B A
+ - - anti-A B
+ + - anti-A yanti-B O
+ + + Autoanticuerpos ?

Pueden presentarse discrepancias en la realización de la prueba. Estas son inherentes a los

eritrocitos, el suero, la técnica o al paciente.La presencia o ausencia de aglutinación puede confirmarse
mediante examen microscópico de las mezclas. Además, pueden darse falsos positivos, principalmente
por aglutinación no específica y por el fenómeno de Rouleaux.

VI. RESULTADOS: En este punto incluyan el resultado obtenido, definiendo el grupo sanguineo de
las muestras de sangre analizadas, ya sea en suero o en eritrocitos.

VII. CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son los factores que influyen en las reacciones de aglutinación y como lo hacen?
2. En la prueba directa para determinar la presencia de antígenos en la superficie de los eritrocitos,
se emplean reactivos de diferentes orígenes ¿cómo se pueden obtener estos reactivos?
3. ¿Cuáles son los errores técnicos más comunes en las discrepancias ABO?
4. ¿Qué fluidos del cuerpo contienen antígenos solubles ABO?
5. ¿Cómo se explica la presencia de anticuerpos naturales contra los grupos sanguíneos A y B?
6. ¿A qué se debe la presencia de aglutinación no específica en estas pruebas?
7. ¿Qué es y a que se debe el fenómeno de rouleaux?
8. ¿Cuál es la naturaleza química del antígeno Rh?
9. ¿Cómo se obtienen los antisueros anti-D?

VIII. DISCUSION:

Interprete y discuta los resultados

IX. CONCLUSIONES:

Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

X. BIBLIOGRAFÍA:

 Rodriguez Moyado H, Quintanar García E, Mejía Arregui MH. (2004*). El banco de sangre y la
Medicina Transfusional. Editorial Médica Panamericana.
#
 Kabat E.A. (2013 ). Blood Group Substances: Their chemistry and Immunochemestry. Elsevier.
#
 Mitra R, Mishra N, Rath GP (2014 ). Bloods group systems. Indian Journal of anaesthesia. 58
(5): 524-528.
#
 Reid ME, Lomas-Francis C, Olsson ML (2012 ). The blood group antigen. FactsBook. Academic
Press.

* Edición que se encuentra en la biblioteca norte de la UAA

 33
# Estas fuentes de consulta no se encuentran en la biblioteca de la UAA
 34
PRACTICA No. 7
PRUEBAS CRUZADAS DE COMPATIBILIDAD SANGUINEA

I. OBJETIVO:

Al término de esta práctica el alumno será capaz de:

1. Comprender el fundamente de las pruebas cruzadas de compatibilidad sanguínea.

2. Demostrar la ausencia de anticuerpos específicos, regulares e irregulares de importantica clínica
en el suero del receptor (PRUEBA MAYOR) y del donador (PRUEBA MENOR).
3. Determinar la compatibilidad sanguínea entre dos individuos (donador y receptor) con un mismo
grupo sanguíneo o de grupos afines.
4. Predecir el posible éxito o no de una futura transfusión sanguínea.

II. INTRODUCCION:

Las pruebas cruzadas son una serie de ensayos realizados sobre la sangre del presunto
donador y del presunto receptor de una transfusión sanguínea que tiene por objeto el detectar
cualquier incompatibilidad existente entre ambas. De tal manera previo a la realización de una
transfusión sanguínea entre individuos compatibles en los sistemas ABO y Rh, es necesario realizar la
prueba cruzada que pondrá de manifiesto la existencia de otros anticuerpos dirigidos contra antígenos
de los sistemas menores.Hay dos tipos de pruebas cruzadas, ambas reacción de aglutinación directa:
la prueba cruzada mayor (PM) y la prueba cruzada menor (pm). En la prueba cruzada mayor se
enfrentan los glóbulos rojos del donante con el suero del receptor, y en la prueba cruzada menor se
hace reaccionar el suero del donante con los glóbulos rojos del receptor.

Una mala realización e interpretación de estas pruebas, puede llevar a consecuencias incluso
letales al receptor, de ahí la importancia de extremar precauciones. Por ello, ambas pruebas deben
realizarse bajo condiciones que favorezcan la reacción antígeno-anticuerpo, que permitan la formación
de aglutinados celulares. Estas condiciones son solución salina fisiológica (0.85%) o un medio rico en
proteínas. De esta manera, la prueba cruzada puede ser dividida en tres fases:

FASE I: (Centrifugación inmediata o prueba rápida): se realiza en SSF 0.85% a temperatura

ambiente. Esta prueba, permite la aglutinación de anticuerpos, IgM principalmente,
específicos a antígenos diferentes del sistema ABO y Rh.

FASE II: (37°C): Durante esta etapa se favorecen las condiciones para la interacción antígeno
anticuerpo. Se incia con una incubación a 37°C y se utilizan diferentes medios de reacción,
entre los cuales podemos mencionar: albúmina, solución de baja fuerza iónica (LISS),
polietilenglicol (PEG) y enzimas como ficina y papaína. Este medio debe ser elegido por el
responsable del banco de sangre de acuerdo a las características del receptor. Esta fase,
permite la identificación de anticuerpos de la clase IgG, ya que su capacidad aglutinanate,
generalmente se ve limitada por el potencial Z; es decir, la fuerza de repulsión entre los
eritrocitos por las cargas eléctricas negativas de su membrana.

FASE III: (antiglobulina): consiste en la adición del reactivo de Coombs, inmunoglobulina IgM anti-IgG
+ anti-C3b del complemento (poliespecífico) o anti-IgG (monoespecífico).. Lo que permite la
detección de anticuerpos, sin capacidad aglutinante, unidos a la membrana de los eritrocitos.
 35
Razón por la cual estos, reciben el nombre de anticuerpos de incompletos, Esta prueba es
también conocida como prueba indirecta de Coombs, ya que se buscan anticuerpos
circulantes, que pueden ser adheridos a los eritrocitos in vitro.

Asociado a lo anterior, debe colocarse la prueba de autocontrol, que consiste en poner en un

tubo debidamente identificado con suero del paciente y suspensión de glóbulos rojos del mismo al 5%,
incubados y leídos con los mismos pasos de la prueba cruzada, detectando de esta manera
anormalidades séricas o la presencia de Roleux que puden dar falsos positivos en las pruebas
cruzadas.

Como se mecionó anteriormente, el encargado de banco de sangre, puede hacer las pruebas de
forma rutinaria para todos los pacientes, o considerar los datos clínicos del receptor y del donador para
elegir las pruebas adecuadas de análisis. Sin embargo, mientras más pruebas se realicen, mayor serán
las probabilidades de éxito de la transfusión. A continuación se muestra dos ejemplos comunes en
banco de sangre:

1) Paciente que nunca ha sido transfundido o que no haya tenido embarazos: prueba de salina
rápida, albúmina rápida y ficina o papaina rápida; ya que podrían existir anticuerpos contra
antígenos de los sistemas sanguíneos menores adquiridos en forma natural.
2) Paciente poli transfundido, que haya tenido embarazos o que se desconozcan sus
antecedentes: Prueba de salina rápida, albúmina rápida, ficina o papaina rápida, salina a 37
ºC/coombs y albúmina a 37 ºC/Coombs y ficina o papaina a 37 C/Coombs. Además de los
anticuerpos mencionados en el caso anterior, pueden existir otros inducidos por las transfusiones
previas o por paso de eritrocitos del producto hacia la madre.

III. REACTIVOS

 Solución de albúmina al 25%

 Solución de ficina (1 mg/ml) o de papaina (10mg/ml), esta solución se expende
comercialmente lista para usarse.
 Suero de coombs.
 2 tubos de 15x7.5mm con 5ml de solución salina estéril

IV. MATERIAL Y EQUIPOS.

 Jeringas estériles con aguja del No. 20

 8 Tbos de 10 x 75 mm
 Tubos de 13 x 100 mm
 Pipetas pasteur con bulbo
 Una centrífuga clínica.

IV.- METODOLOGÍA:

1 Obtenga unos 5 ml de sangre venosa sin anticoagulante del donador y coloque 0.1 ml de esa
sangre en un tubo que contenga 5 ml de solución salina (suspensión al 2%). Deposite el resto de
la sangre en un tubo para obtener suero.
2 Repita el proceso ahora con la sangre del receptor.
3 Disponga de una serie de 4 tubos y etiquete como:
 36

1. P.M.(s) (prueba mayor-salina)

2. auto(s) (autotestigo-salina)
3. P.M.(a) (prueba mayor-albúmina)
4. auto (a) (autotestigo-albúmina)

4 Agregue a cada tubo los reactivos según se indica en la tabla 8.

5 Mezcle bien todos los tubos y centrifugue 60 segundos a 2500 rpm.
6 Busque la presencia de aglutinación en todos los tubos y anote todos los resultados.
7 En caso de que no se presente aglutinación en ninguno de los 4 tubos incube todos a 37 C
durante 30 minutos.
8 Centrifugue los tubos a 3500 rpm por 45 segundos y Descarta el sobrenadante.
9 Llava el paquete celular de cada tubo con solución salina y centrifugue a 3500 rpm por 45
segundos. Descarta el sobrenadante.
10 Repita el paso anterior una vez más.
11 Agregue una gota de suero de coombs al paquete celular de cada tubo.
12 Rrepita el paso 5 y 6 y busque aglutinación.
13 Simultáneamente debe montar dos tubos adicionales uno que servirá como testigo positivo (TP) y
el otro como testigo negativo (TN).
14 Agregue dos gotas de suero comercial anti-D diluido 1:32 y dos gotas de una suspensión al 2% de
eritrocitos O Rh (+) al tubo marcado TP .
15 Agregue dos gotas de suero comercial diluido a 1:32 y dos gotas de una suspensión al 2% de
eritrocitos O Rh (-) al tubo marcado TN.
16 Incube ambos tubos, TP y TN, a 37C por 30 minutos y procece igual a lo señalado en los pasos 8
a 12.
TABLA 8. Pruebas cruzadas con solución salina y albúmina.

Suero del Susp. al 2% Susp. al 2% Sol. Alb al 30%

receptor G.R. donador G.R. receptor

P.M. (s)
1 gota 1 gota . -
Auto (s) 1 gota - 1 gota -
P.M. (a)
1 gota 1 gota - 2 gotas
Auto (a) 1 gota - - 2 gotas

V. RESULTADOS:

La aparición de aglutinación o hemólisis, en cualquiera de los tubos marcados con PM, después
de cualquiera de los pasos, será indicativo de que hay incompatibilidad entre el posible donador y su
receptor, y por lo tanto, la imposibilidad de realizar la transfusión. La presencia de hemólisis, es
apreciada como una coloración rojiza y cristalina de la mezcla, se observa claramente después de
centrifugar la mezcla.

Reporte el tipo de sangres analizadas y si hay compatibilidad entre ellas.

VI. CUESTIONARIO:
 37

1. ¿Cuál es el fundamento de las pruebas cruzadas?

2. ¿Qué indica un resultado de incompatibilidad en la prueba cruzada mayor?
3. ¿Qué se conoce como anticuerpos irregulares o incompletos en el suero del receptor?
4. ¿Cuál es el objetivo de detectar los llamados anticuerpos irregulares o incompletos?
5. ¿En cuántas fases o etapas puede ser dividida la prueba cruzada y que detecta en cada una
de ellas?
6. ¿Cuál es la finalidad de utilizar albúmina bovina y suero de Coombs?
7. ¿Porqué se prefiere usar, como muestra, suero y no plasma?
8. ¿Cuándo se considera que existe compatibilidad sanguínea entre donador y receptor?

VII. DISCUSIONES:

Discutir los resultados obtenidos.

VIII. CONCLUSIONES:

Describir las conclusiones sobre eltrabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

IX. BIBLIOGRAFÍA:

Incluir las fuentes de información consultadas, proporcionando sus datos completos.

 Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. “Inmunología celular y molecular” (2008*). Editorial Elsevier
Saunders.
 Owen J, Punt J, Stranford S (2014*). “Kuby Immunología”. Editorial Mc Graw Hill Education.
 Espinosa O (2006*). “Inmunologia (de memoria)” Editorial Médica Panamericana.
 McCullough J (2011#) Transfusion Medicine (3). Hoboken, GB: Wiley-Blackwell, 2011.
ProQuest ebrary. Web. 11 April 2016

* Edición que se encuentra en la biblioteca norte de la UAA

# Estas fuentes de consulta no se encuentran en la biblioteca de la UAA
 38
PRACTICA No.8
DETERMINACIÓN DE ERITROCITOS SENSIBILIZADOS EN LA ERITOBLASTOCIS FETAL
PRUEBA DE COOMBS

I. OBJETIVO:

Al finalizar la práctica, el alumno:

1. Comprenderá la importancia clínica de la detección de anticuerpos incompletos mediante la

prueba de Coombs.
2. Detectará anticuerpos incompletos anti-Rh que han sensibilizados los glóbulos rojos in vivo
mediante la prueba directa de Coombs.
3. Demostrará la presencia de anticuerpos anti-Rh que están libres en el suero, pero que pueden
+
adherirse in vitro a eritrocitos Rh .

II. INTRODUCCION:

Algunos Anticuerpos incompletos, de tipo IgG son incapaces de aglutinar los glóbulos rojos por
sí solos, pero pueden sensibilizarlos, adhiriéndose a su superficie, o fijar el complemento sin llegar a
hemolizarlos. Es decir, que en algunas ocasiones, los anticuerpos unidos a sus antígenos
correspondientes que están en la membrana de los eritrocitos no dan lugar a la formación de un
agregado visible en un tiempo relativamente corto. Coombs, diseñó un método para poner en
evidencia la presencia de estos anticuerpos (que por su comportamiento han sido llamados
"incompletos") mediante la adición al sistema de anticuerpo anti-inmunoglobulinas humanas preparado
en otra especie (suero de Coombs).

Cabe señalar, que este reactivo también se puede utilizar para buscar anticuerpos que han
sensibilizado a los glóbulos rojos in vivo, a este ensayo se le conoce como prueba de Coombs directo.
En el caso de incompatibilidad en el sistema Rh entre la madre y su producto, en la cual la primera es
Rh (-) y el segundo Rh (+), puede haber isoinmunización con la producción de anti-D de la clase IgG
que se comportan como "incompletos". Estos anticuerpos pueden atravesar placenta, unirse a los
eritrocitos del producto y desencadenar un estado patológico (enfermedad hemolítica del recién nacido,
eritroblastosis fetal y kernicterus). Por tal motivo es de gran importancia la búsqueda de los
anticuerpos anti-D en el suero de la madre o los que se han unido a los eritrocitos del recién nacido y
como estos anticuerpos no aglutinan, es necesario recurrir a las pruebas de Coombs, ya sea directa o
indirecta. Es importante señalar que esto mismo puede ocurrir con otros sistemas de grupo
sanguíneos.

La prueba de Coombs o Prueba de la Anti-Globulina humana (PAG) se basa en el hecho de

que los Ac antiglobulina humana completos, de tipo IgM son capaces de aglutinar los eritrocitos
revestidos con inmunoglobulinas y se puede realizar de dos formas. Se ha calculado que se necesitan
de 100 a 500 moléculas de IgG, fijadas a los glóbulos rojos, para que puedan ser detectadas por los
anticuerpos antiglobulina humana. Los Ac antiglobulina humana están contenidos en un reactivo que
recibe el nombre de Suero Anti-Globulina humana (SAG) o Suero de Coombs. El suero de Coombs
puede ser de dos clases:

 Poliespecífico: si está dirigido contra la IgG y contra el componente C3b del complemento
 39
 Monoespecífico: si sólo está dirigido contra la IgG o contra alguno de los componentes del
complemento.

PRUEBA DIRECTA DE COOMBS:

En la prueba directa de la antiglobulina humana (PDAG) o test de Coombs directo se intenta

detectar Ac incompletos y/o fijadores de complemento fijados in vivo a los hematíes problema. Esto se
realiza añadiendo, a estos eritrocitos sensibilizados, un suero antiglobulina humana que contiene Ac
completos capaces de producir su aglutinación.

Se utiliza en el caso de glóbulos rojos provenientes de niños con eritroblastosis fetal, en el

estudio de la anemia hemolítica adquirida (en la que se buscan auto-anticuerpos) y en la investigación
de reacciones consecutivas a transfusiones de sangre incompatibles.

PRUEBA INCOMPLETA O INDIRECTA DE COOMBS:

Esta prueba se usa para determinar la presencia de anticuerpos "incompletos" en el suero de

sujetos sensibilizados a uno o más antígenos sanguíneos. Es útil en el estudio del suero proveniente
de mujeres afectadas por isoinmunizaciónmaternofetal y se emplea amplia y rutinariamente en pruebas
cruzadas que permiten descubrir ciertas incompatibilidades que no pueden descubrirse por otras
técnicas. Esta prueba se realiza en dos fases:

1. En la primera fase se incuba el suero del paciente con unos glóbulos rojos tipo, que no
tienen adheridos a su superficie ningún tipo de inmunoglobulina ni ningún componente del
complemento.
2. En una segunda fase, se añade un suero antiglobulina humana, que producirá una
aglutinación de los eritrocitos, en el caso de que éstos se hayan sensibilizado en la fase
anterior.

III. REACTIVOS

1. Suspensiones de glóbulos rojos problema y de glóbulos normales, lavados 5 veces con

solución salina y ajustados a una Concentración del 2%.
2. Solución salina isotónica
3. Suero de Coombs
4. Suspensión de glóbulos rojos tipo O, Rh+ (D), lavados 3 veces con solución salina y
ajustados a una concentración del 2-5 %
5. Suero problema
6. Suero de Coombs
7. Suero anti-D dil. 1:16

IV. MATERIAL Y EQUIPO

1. 1 centrífuga clínica
2. Tubos de ensaye de 13x100
3. 4 pipetas de 1 ml
4. Pipetas de 1 ml
5. Tubos de ensaye 13x100
6. Baño maría
 40

V. METODOLOGÍA:

PRUEBA DIRECTA DE COOMBS:

1. Coloque en un tubo de ensaye 2 gotas de la suspensión al 2% de los glóbulos rojos problema.

2. Añada 2 gotas de suero de Coombs.
3. Mezcle bien y centrifugue a 1000 rpm durante un minuto.
4. Desprenda el botón suavemente y macroscópicamente busca la presencia de aglutinación.
5. De la misma manera, prepare un tubo en el cual se sustituye el suero de Coombs por solución
salina (testigo negativo de los eritrocitos problema).
6. Simultáneamente prepare de la misma forma un tubo que contenga una suspensión de glóbulos
rojos normales y suero de Coombs (testigo negativo del suero de Coombs).
7. Resuspenda el botón de los eritrocitos formado, y observe la presencia de aglutinación de los
eritrocitos problema con suero de Coombs lo que indica que los glóbulos rojos del paciente están
recubiertos por anticuerpo específico. La observación de aglutinación se realiza tanto
microscópicamente como microscópicamente.

PRUEBA INDIRECTA DE COOMBS:

1. En un tubo de ensaye, coloque dos gotas de suero problema.

2. Añada dos gotas de la suspensión al 2-5 % de eritrocitos O Rh (+).
3. Mezcle bien y centrifugue a 1000 rpm durante un minuto.
4. Desprenda suavemente los glóbulos rojos sedimentados y observe si hay aglutinación
macroscópica. En caso de ser negativa o débilmente positiva, resuspenda los eritrocitos e incube
en el baño maría durante 20 minutos.
5. Lave los eritrocitos por centrifugación con solución salina una sola vez y después de escurrirlos
resuspenda en la solución salina remanente.
6. Añada dos gotas de suero de Coombs.
7. Mezcle bien y centrifugue a 1000 rpm durante 1 minuto.
8. Desprenda el botón suavemente y busque aglutinación macroscópicamente.
9. De la misma manera, prepare un tubo en el cual se sustituye el suero de Coombs por solución
salina (testigo negativo de los eritrocitos O, Rh (+).
10. Añada una gota de suero anti-D, diluido 1:16 a dos gotas de la suspensión de eritrocitos O, Rh (+).
Incube 15 minutos a 37ºC y continúe con los pasos 6, 7, y 8 (testigo positivo de los eritrocitos O,
Rh (+).
11. La aglutinación de los glóbulos rojos conocidos con suero problema indica la presencia de
anticuerpos aglutinantes (paso 4). La aglutinación de estos eritrocitos con suero problema y suero
de Coombs señala la presencia de anticuerpos "incompletos" en el suero problema (paso 8)

VI. RESULTADOS:

Reporte los resultados obtenidos para cada técnica.

INTERPRETACION CLINICA:
 41

La prueba de Coombs directa sirve para detectar eritrocitos sensibilizados in vivo, debido al
padecimiento de algunas enfermedades, entre las que destacan:

 la enfermedad hemolítica del recién nacido

 reacciones transfusionales
 la anemia hemolítica inducida por medicamentos
 anemia hemolítica autoinmune, es decir, provocada por autoanticuerpos

Los autoanticuerpos se clasifican de acuerdo a la temperatura óptima a la que actúan en:

 autoanticuerpos fríos o crioanticuerpos o crioaglutininas, que suelen ser del tipo IgM y que
aglutinan a los glóbulos rojos, preferentemente a 4 °C.
 autoanticuerpos calientes o aglutininas calientes, que suelen ser del tipo IgG y que reaccionan
mejor a 37°c.

Estos autoanticuerpos suelen causar anemias hemolíticas, leucopenias y trombocitopenias.

Auque a veces no producen manifestaciones clínicas.

VII. CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es la finalidad de cada una de las pruebas de Coombs?

2. ¿Qué es el reactivo de Coombs?
3. Señale un ejemplo en el que indicaría la prueba directa e indirecta de Coombs y que muestras se
deberían solicitar.
4. ¿Cuál es el tratamiento que se debe dar a un niño con eristoblastocis fetal?
5. ¿Índica el nombre de un tratamiento preventivo de la eritoblastocis fetal y su fundamento?

VIII. DISCUSIONES:

Analizar los resultados y discutir en caso de ser necesario.

IX. CONCLUSIONES:

Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

X. BIBLIOGRAFÍA:

Incluir las fuentes de información consultadas, proporcionando sus datos completos.

 Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. “Inmunología celular y molecular” (2008*). Editorial Elsevier
Saunders.
 Delves PJ, Martin SJ, Burton DR, Roitt IM (2010*). Roitt’s Essential Immunology. United
Kingdom: Wiley-Blackwell.
 Rojas Espinosa O (2006*). “Inmunologia (de memoria)” Editorial Médica Panamericana.

* Edición que se encuentra en la biblioteca norte de la UAA

 42

PRÁCTICA No. 9
INMUNIZACIÓN ACTIVA COMO PRINCIPIO DE LA VACUNACIÓN

I. OBJETIVO:

Al finalizar la práctica, el alumno ha de ser capaz de:

1. Diferencia entre un protocolo de inmunización activa y pasiva.

2. Comprender el principio de la vacunación y sus ventajas.
3. Comprobar la mediante la técnica de aglutinación en tubo la efectividad de su esquema vacunación
4. Obtener el título de los anticuerpos contra antígenos flagelares (anti-H) y contra antígenos
somáticos (anti-O).

II. FUNDAMENTO

La vacuna es un preparado de antígenos procedentes de microorganismos patógenos (microbios

muertos de cepas virulentas o vivos de cepas atenuadas), cuya finalidad es la creación de anticuerpos
que reconozcan y ataquen a la infección y, por lo tanto, produzcan la inmunidad del organismo
inoculado.

La vacuna suele consistir de dosis muy pequeñas del propio agente (forma inactiva o atenuada)
que origina la enfermedad, por lo que provoca la creación de anticuerpos que permanecen en el
organismo y lo protegen en el caso de futuros contagios. La técnica de administración depende del tipo
de vacuna; la más común es la inoculación, pero en algunos casos es la ingestión o el spray nasal.

Tipos de vacunas

Según su composición y forma de obtención se clasifican en víricas y bacterianas, que a su vez

pueden ser vivas atenuadas o muertas inactivadas.

Vacunas vivas atenuadas: se componen de microorganismos mutados que han perdido su virulencia,
generalmente mediante pases sucesivos en diferentes medios de cultivo y/o huéspedes animales, sin
sufrir un deterioro importante en sus inmunogenicidades.

Muertas o inactivadas: se obtienen mediante:

a. Inactivación por medios físicos (calor) o químicos (formol, b-propiolactona) de bacterias o
virus, enteros o totales.
b. Inactivación por calor y formaldehído de antígenos secretados (toxoides o anatoxinas):
tétanos, difteria.
c. Obtención de fracciones inmunizantes virales o bacterianas.

Vacunas toxoides: los toxoides se obtienen a partir de las toxinas bacterianas producidas por
Clostridium tetani y del bacilo diftérico, Corynebacterium diphtheriae, causantes del tétanos y de la
difteria, respectivamente.

GENERALIDADES

Las dos grandes propiedades que deben reunir las vacunas son la eficacia y la inocuidad. La
eficacia depende de que la vacuna contenga los antígenos responsables del poder inmunógeno, que
 43

son aquellos que inducen una buena respuesta inmune. Las bacterias y los virus están compuestos por
numerosos antígenos, que pueden ser constitutivos o estructurales, contenidos en determinadas
estructuras de la bacteria (flagelos, fimbrias, capsula, pared celular, membrana citoplásmica, ribosomas)
o secretados, de los cuales solo algunos pueden considerarse antígenos protectores o inmunizantes. La
inocuidad supone que la vacuna esta desprovista de poder patógeno, y debe lograrse este objetivo sin
que se modifiquen los antígenos responsables del poder inmunógeno.

ANTISUEROS

El Antisuero es un producto biológico utilizado en el tratamiento de picaduras o mordeduras

venenosas. El antisuero se crea mediante la inyección de una pequeña cantidad de veneno blanco en
un animal, como un caballo, oveja, cabra, conejo, etc.; el animal sufrirá una respuesta inmune para el
veneno, produciendo anticuerpos contra el veneno de la molécula activa. Pueden ser cosechadas a
partir de la sangre del animal y se usa para tratar envenenamientos en otros.

El Antisuero puede clasificarse en monovalente (cuando son eficaces en contra de una

determinada especie de veneno) o polivalente (cuando son efectivos contra una amplia gama de
especies, o varias especies diferentes al mismo tiempo). La mayoría de antisueros (incluyendo todos los
antisueros serpiente) es administrada intravenosamente. El antisuero ata y neutraliza el veneno,
deteniendo un mayor daño, pero no invierte el daño ya hecho. Por lo tanto, debe administrarse tan
pronto como sea posible después de que el veneno ha sido inyectado, pero que son de algún beneficio,
siempre y cuando el veneno está presente en el cuerpo.

Disponibilidad de antisueros: Los antisueros se han desarrollado para venenos asociados a los
siguientes animales: arañas, ácaros, insectos, escorpiones, animales marinos y serpientes.

III. METODOLOGÍA PARA PROCEDIMIENTO PARA INMUNIZAR CON ANTIGENO “O” Y “H”:

ANIMALES
Conejos Nueva Zelanda de 2 a 3 kg

REACTIVOS

 Vacuna contra Salmonella sp. flagelar y somática

 Alcohol al 70%
 Xilol
 Solución salina fisiológica

MATERIAL Y EQUIPO:

 Jeringas con agujas estériles 21x27 in, ¾ in

 Torundas de algodón
 Tubos de centrífuga estériles 13x100 con tapón
 Cajón especial para sujetar conejos
 Centrífuga clínica
 Viales de vidrio con tapón
 Pipetas Pasteur y bulbo
 44

METODOLOGÍA:

1. Inyecte por vía endovenosa el volumen indicado de una suspensión de antígeno "O" y "H" de
Salmonella typhi de acuerdo al protocolo de inmunización que se indica a continuación, con un total
de cuatro inoculaciones:

TABLA 9. Protocolo de inmunización para antígeno "O" Y "H" DE Salmonella typhi.

Inyección Tiempo (día) Fecha Dosis (ml) Vía Observaciones
1 0 0.5 i.v
2 3 1.0 i.v
3 5 2.0 i.v
4 11 3.0 i.v
Sangrado 17

2. Deje descansar el animal seis días después de la última inyección.

3. Sangre al conejo por punción endovenosa o cardiaca y separar el suero.

IV. METODOLOGÍA DE DETERMINACIÓN DE ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD:

MATERIAL Y REACTIVOS:

 1 ml de suero anti-antígeno "O" de Salmonella sp.

 1 ml de suero anti-antígeno "H" de Salmonella sp.

9
4.0 ml de antígeno "O" de Salmonella sp. Ajustado a 1X10 UFC/ml (tubo 5 del nefelómetro de
McFarland).

9
4.0 ml de antígeno "H" de Salmonella. sp. Ajustado a 1.5X10 UFC/ml (tubo 5 del nefelómetro
de McFarland)
 20 tubos de 13x100 mm
 1 gradilla de acero inoxidable con 20 lugares.
 5 pipetas de 1 ml
 Solución salina isotónica.
 Baño maría ajustado a 37ºC

METODOLOGÍA:

1. Coloque en una gradilla dos hileras de 10 tubos cada una.

2. Marque los tubos de la primera hilera con una "H" y numeración progresiva del 1-10.
3. Marque los tubos de la segunda hilera con una "O" y numeración progresiva del 1-10.
4. Agregue a cada tubo 0.25 ml de solución salina.
5. Agregue al primer tubo de la fila "H" 0.25 ml de suero de conejo anti-antígeno "H". Mezcle bien con la
misma pipeta.
6. Tome 0.25 ml del tubo 1 y transfiera al tubo 2. Mezcle bien.
7. Continúa en la misma forma hasta el tubo 9, del cual se desechan 0.25 ml.
8. El tubo número 10 será el testigo de la prueba y solamente contendrá 0.25 ml de solución salina.
9. Adicione a estos tubos de la hilera "O" 0.25 del antígeno "H". Agite los tubos.
10. Repita los pasos del 5 al 8 en los tubos de la hilera "O"; pero utilizando el suero de conejo anti-
antígeno "O".
 45

11. Adicione a estos tubos 0.25 ml de la suspensión de antígeno "O" y agite bien.
12. Sumerja la gradilla en el baño maría e incube durante 18 horas.
13. En el fondo de cada tubo busque la presencia de aglutinación la cual deberá estar ausente en los
dos tubos número 10, en caso de no suceder esto deseche la prueba y prepare nuevos antígenos.
14. El título del suero en cada caso corresponderá a la dilución mayor en la que todavía se observa
aglutinación.

V. RESULTADOS:

Incluya el resultado obtenido, en cada una de las etapas de la producción de la vacuna, así
como reportar el título del suero expresado ya sea como dilución o la inversa de la misma.

VI. DISCUSIONES:

Observaciones durante el desarrollo de la práctica, tales como fuentes de error, precauciones,

comentarios, aclaraciones a la técnica, etc. No repetir la descripción de los pasos de la técnica. Discutir
que indica el título de anticuerpos obtenidos por esta técnica y cuáles son los factores que influyen en la
reacción de aglutinación.

VII. CUESTIONARIO:

1. Explique la diferencia entre una vacuna y un antisuero.

2. ¿Por qué es importante la vacunación?
3. ¿Cuántos tipos de vacunas existen?
4. ¿Cuáles son las principales enfermedades humanas erradicadas gracias a la vacunación?
5. Menciona 2 ejemplos de vacunas virales y 2 bacterianas de vacunas vivas atenuadas.
6. Menciona 2 ejemplos de vacunas virales y 2 bacterianas de vacunas muertas o inactivadas.
7. ¿Cuáles son los factores que influyen en las reacciones de aglutinación y como lo hacen?
8. ¿Cuántos tipos de reacción de aglutinación hay?
9. ¿Cuál es la sensibilidad de las reacciones de aglutinación?
10. ¿Qué diferencia observaste en las aglutinación de antígeno somático y flagelar? y ¿por qué?
11. Menciona cinco aplicaciones de la reacción de aglutinación.

VIII. CONCLUSIONES:

Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

IX. BIBLIOGRAFÍA

 Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. “Inmunología celular y molecular” (2008*). Editorial Elsevier
Saunders.
 Campbell Dan H., Garvey Justine S., Cremer Natalie E., Sussdorf Dieter H. (1970*). Methods
in Immunolofy. A Laboratory Tex for Instruction and Research. Second Edition.
#
 Arce Mendoza A.Y., Rosas Taraco A.G., Rodríguez Tovar L. E.; (2007 ) Prácticas de
Inmunologìa general aplicada y Veterinaria. Editorial Manual Moderno
#
 Lomonte, B. (2009 ) Técnicas de Laboratorio en Inmunología Clínica, 122 pp. Universidad de
Costa Rica. Acceso libre en http://www.kerwa.ucr.ac.cr/handle/10669/9243
* Edición que se encuentra en la biblioteca norte de la UAA
# Estas fuentes de consulta no se encuentran en la biblioteca de la UAA
 46

PRACTICA No. 10
PRUEBA INMUNOLÓGICA DE EMBARAZO
INMUNOCROMATOGRAFÍA

I. OBJETIVO:

Al finalizar la práctica, el alumno a de ser capaz de:

1. Comprender y describir el fundamento de la técnica de ELISA.

2. Determinar la presencia de la hormona gonadotropina coriónica (HGC) en una muestra de orina
por medio de inmunocromatografía (tira reactiva).

II. FUNDAMENTO.

Las pruebas de embarazo se basan en la detección, generalmente en la orina, de una hormona

llamada Gonadotropina Coriónica Humana (GCH o hCG). Esta hormona es una glucoproteína que
es sintetizada y secretada por las células trofoblásticas del blastocito y posteriormente por la placenta
desde el momento en que éste empieza a formarse, es decir, desde la implantación del zigoto.

Está formada por dos unidades llamadas alfa y beta; la cadena alfa forma parte de diferentes
hormanas hipofisiarias como la estimulante de la tiroides (TSH), luteinizante (LH) y folículo estimulante
(FSH); mientras que la subunidad beta es exclusiva de la GCH, de ahí que sea la que se identificque
para su identificación (Haslam y cols., 2018). Su concentración en orina alcanza un valor máximo (100-
200 UI/ml) alrededor de la 11a. semana de embarazo, contada desde el fin del último ciclo menstrual
completo, luego va disminuyendo, hasta aproximadamente la 17a. semana de gestación y, finalmente
se estabiliza en una cifra intermedia (5-10 UI/ml) hasta el final del embarazo.

Actualmente se utilizan otras pruebas basadas en reacciones de aglutinación de partículas látex

(en placa), reacciones de hemoaglutinación (Pregnosticon); inhibición de la aglutinación (en tubo):
gravindex; Inhibición de la aglutinación en placa (Pregnosticon, Gravindex 90); radioinmunoanálisis
(RIA) y ELISA (enzimoinmunoanálisis).

Prueba de embarazo por inmunocromatografía:

La inmunocromatografía se basa en la migración de una muestra a través de una membrana de

nitrocelulosa. En esta prueba se pueden observar tres zonas, las cuales son importantes para que se
lleva a cabo la reacción (Liu y cols., 2014). La primer zona o también llamada zona del conjugado, es la
zona donde la muestra es añadida. Está conformada por un anticuerpo específico (monoclonal) el cual
reconoce de manera específica uno de los epítopos del antígeno a detectar y un reactivo de detección.
Si la muestra contiene el antígeno problema, éste se unirá al conjugado formando un complejo inmune y
migrará a través de la membrana de nitrocelulosa. De lo contrario, migrarán el conjugado y la muestra
sin unirse.
La segunada zona es la zona de captura está formada por un segundo anticuerpo (monoclonal)
específico contra otro epítopo del antígeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por
la unión del antígeno y conjugado quedarán retenidos y la línea se coloreará (muestras positivas). En el
caso contrario las muestras son negativas. La zona control está formada por un tercer anticuerpo
(policlonal) que reconoce al reactivo de detección. Cuando el resto de la muestra alcanza esta zona, el
anticuerpo se unirá al conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura (figura 6).
 47

FIGURA 6. Tira reactiva por inmunocromatografía. Adaptado de Liu y cols., 2014.

III. REACTIVOS

 Tiras reactivas para prueba inmunológica de embarazo.

 Suero u orina de mujer embarazada.

IV. MATERIAL Y EQUIPO:

 Centrífuga clínica
 Tubos de ensayo

V. PROCEDIMIENTO

1. Deje que las muestras y las tiras reactivas alcancen la temperatura ambiente.
2. Con las flechas señalando hacia la muestra de orina o suero, sumerja la tira verticalmente en la
muestra de orina o suero al menos durante 10-15 segundos.No sumergir por encima de la línea
máxima (MAX) de la tira.
3. Coloque la tira en una superficie plana no absorbente, ponga en marcha el cronómetro y espere
hasta que aparezcan una o dos líneas rojas. Lea el resultado a los 3 minutos cuando se analice
una muestra de orina o a los 5 minutos cuando se analice una muestra de suero.

VI. RESULTADOS:

En este punto incluyan solamente el resultado obtenido, sin comentarios ni observaciones, las
cuales, se considerarán en otro punto.

VII. CUESTIONARIO
 48

1. ¿Cuál es el principio de la inmunocromatografía?

2. De acuerdo al orden de los reactivos ¿qué tipo de inmunoensayo es la prueba de embarazo por
inmunocromatografía?
3. Que indica un resultado positivo en esta prueba cuando no hay embarazo.
4. ¿Cuál es el antígeno detectado mediante esta prueba?
5. ¿Qué resultado esperaría si la prueba se realizara en el último trimestre del ambarazo?
6. ¿A los cuánto días del embarazo comieza a ser positiva esta prueba?
7. Indique cual es la mejor muestra para realizar esta prueba y ¿por qué?

VIII. DISCUSION

Discutir sobre la técnica Inmunocromatografía, la importancia de los anticuerpos anti -hCGi.

Puede incluir un punto aparte de observaciones en el cual se refiere a observaciones durante el
desarrollo de la práctica, tales como fuentes de error, precauciones, comentarios, aclaraciones a la
técnica,

IX. CONCLUSIONES:

Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

X. BIBLIOGRAFÍA:

Incluir las fuentes de información consultadas, proporcionando sus datos completos.

 Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. “Inmunología celular y molecular” (2008*). Editorial Elsevier
Saunders.
#
 Haslam C, Damiati S, Whitley T, Davey P, Ifeachor E y Awan S (2018 ). “Label-Free Sensors
Based on Graphene Field-Effect Transistors for the Detection of Human Chorionic
Gonadotropin Cancer Risk Biomarker”. Diagnostics; 8 (1): 5.
#
 Liu L, Xing C, Yan H, Kuang H y Xu C (2014 ). Development of an ELISA and
Inmunochromatographic Strip for Highly Sensitive Detection of Microcystin-LR. Sensors; 14:
14672-14685.
 Owen J, Punt J, Stranford S (2014*). “Kuby Immunología”. Editorial Mc Graw Hill Education.

* Edición que se encuentra en la biblioteca norte de la UAA

# Estas fuentes de consulta no se encuentran en la biblioteca de la UAA
 49

PRACTICA No. 11
DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-Toxoplasma
ELISA INDIRECTO

I. OBJETIVO:

Al finalizar la práctica, el alumno debe ser capaz de:

1. Comprender y describir el fundamento de la técnica de ELISA.

2. Determinar la presencia de anticuerpos contra Toxoplasma gondii en una muestra de suero por
medio de un ensayo de ELISA tipo Indirecto.

II. INTRODUCCIÓN

La técnica ELISA (ensayo de inmunosorbente ligado a enzima) se basa en la detección de un

antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente
producen una reacción marcada enzimáticamente cuyo producto, puede ser medido
espectrofotométricamente. Una enzima conjugada a un anticuerpo reacciona con un sustrato incoloro
(cromógeno) para generar un producto con reacción de color..Para ELISA se utilizan varias enzimas,
como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante y β-galactosidasa.

Tipos de ensayos ELISA:

Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación
de un antígeno en solución y la detección de un anticuerpo en una solución (Villa y Pabón, 1994; Gan y
Patel, 2013).

 Ensayo directo: Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en
las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican
la presencia de antígeno en la solución analizada.

 Ensayo indirecto: El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el
antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad
por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpo
secundarios por cada primario.

 Ensayo sandwich: (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos).

Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo
anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la
que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer
anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una
solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de
antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al
menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la
amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.

Aplicaciones
 50

Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba
la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de
anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.

III. FUNDAMENTO

En esta prueba, la superficie de los pocillos de titulación están recubiertos con el antígeno de
Toxoplasma gondii, La muestra de suero diluido se adiciona a cada pocillo y si está presente el
anticuerpo IgG anti-Toxoplasma gondii se unirá al antígeno. Todos los componentes que no se unan se
eliminarán durante el lavado. Después se adiciona un conjugado-HRP, el cual se une al complejo
antígeno anticuerpo y aquel conjugado que no se una se elimina mediante el lavado. Enseguida se
adiciona el sustrato (TMB) y después de un tiempo específico la reacción enzimática se detiene para
finalmente ser leída en el espectrofotómetro de ELISA. La intensidad de color generada es proporcional
a la cantidad de anticuerpo IgG específico en la muestra.

IV. REACTIVOS

1. Suero problema
2. Reactivos del estuche de ELISA

I. MATERIAL Y EQUIPO:

1. Estuche de ELISA para Toxoplasma gondii

2. Micropipetas
3. Puntas para micropipeta

II. PROCEDIMIENTO

Seguir las instrucciones del estuche de ELISA para Toxoplasma gondii

IV. RESULTADOS:

En este punto incluyan solamente el resultado obtenido, sin comentarios ni observaciones, las
cuales se considerarán en otro punto.

V. CUESTIONARIO

1. De que tipo, y ¿cuál es el fundamento del ensayo realizado en esta práctica?

2. Describe otras 3 aplicaciones de la técnica de ELISA.
3. ¿Cuál es la diferencia entre un ELISA directo, indirecto y tipo Sandwich?
4. ¿Cuál es la importancia clínica del diagnóstico de Toxoplasma gondii?
5. ¿Por qué es importante la realización de esta prueba en mujeres embarazadas?

VI. DISCUSION

Discutir sobre la técnica de ELISA y la importancia de la determinación de anticuerpos

anti.Toxoplasma gondii. Puede incluir un punto aparte de observaciones en el cual se refiere a
 51

observaciones durante el desarrollo de la práctica, tales como fuentes de error, precauciones,

comentarios, aclaraciones a la técnica,

VII. CONCLUSIONES:

Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

VIII. BIBLIOGRAFÍA:

Incluir las fuentes de información consultadas, proporcionando sus datos completos.

 Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. “Inmunología celular y molecular” (2008*). Editorial Elsevier
Saunders.
 Owen J, Punt J, Stranford S (2014*). “Kuby Immunología”. Editorial Mc Graw Hill Education.
+
 Gan S y Patel K (2013 ). Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay.
Journal of Investigative Dermatology. 133:1-3.
#
 Villa H y Pabón G (1994 ). Métodos Inmunoquímicos Aplicados al Análisis de Micotoxinas.
Revista de la Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia. 4 (2): 105-118.

* Edición que se encuentra en la biblioteca norte de la UAA

+ Edición que se encuentra en la biblioteca virtual de la UAA
# Estas fuentes de consulta no se encuentran en la biblioteca de la UAA
 52

PRACTICA No. 12
ESTUDIO DE SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS EN UNA MUESTRA SANGUÍNEA
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA
I. OBJETIVO:

Al finalizar la práctica, el alumno a de ser capaz de:

1. Purificar linfocitos a partir de sangre periférica y de bazo, mediante estratificación sobre Ficoll-
Hypaque y centrifugación.
2. Observar, contar y determinar la viabilidad celular los linfocitos presentes en una suspensión.
3. Realizar la técnica serológica de inmunofluorescencia directa en la detección de subpoblaciones
celulares en sangre periférica.
4. Definir la importancia del estudio de subpoblaciones celulares en el diagnóstico clínico.

II. INTRODUCCION:

Como ya se ha mencionado anteriormente en la sangre residen la mayoría de las células de la

respuesta inmune. De tal forma que el estudio de las poblaciones de este tejido facilitarían el
entendimiento de las causas de muchas patologías. Haciendo a cada una de estas células un marcador
biológico importante para el diagnóstico clínico. Considerando que es posible analizarlas no solo
morfologícamente, sino, cuantitativamente y fenotípicamente mediante la identificación de la expresión
de diferentes moléculas en su superficie o interior de la misma, así como a través de la síntesis y
liberación de diferentes moléculas biológicamente activas.

El estudio de poblaciones celulares sanguíneas, se ve favorecido por la facilidad de obtención de

la muestra y la baja complejidad en la composición celular de la misma, lo cual permite la fácil
separación e incluso purificación de las diferentes poblaciones. Para el estudio de una célula en
particular primero se debe hacer una estratificación de los grupos celulares muy generalizada como la
separación por gradiente de densidad. Posteriormente se sigue una técnica mucho más específica que
permita analizar a una célula en particular dentro de un grupo más pequeño, como microscopía por
inmunofluorescencia o de manera aislada mediante la purificación por técnicas como separación por
columnas de nylon, perlas magnéticas o citometría de flujo.

PURIFICACION DE LINFOCITOS

Como ya se mencionó antes, existen varios métodos para separar a los linfocitos del resto de las
células sanguíneas. Uno de los más empleados es por flotación en una solución que tenga una
densidad igual a la de ellos. En esta práctica utilizaremos para la obtención de linfocitos la técnicas
usada actualmente en el laboratorio, que es la separación de células mononucleares con soluciones de
Ficoll-Hypaque (polímero de sacarosa de alto peso molecular (Ficoll) y un compuesto orgánico
iodinatado (diatriazoato de sodio, 3-5 bis acetilamino –2,4,6 ácido triyodobenzóico), el cual tiene una
densidad de 1.077 g/ml que es idéntica a la de los linfocitos y monocitos. Los granulocitos y eritrocitos
que tienen una mayor densidad, cuando se centrifuga la sangre en el gradiente de Ficoll-Hypaque,
pasan a través de éste formando un paquete en el fondo del tubo. Debido a que las plaquetas que
tienen una densidad menor permanecen en la fracción plasmática y los mononucleares se localizan
junto con los linfocitos fue necesario purificar los linfocitos, eliminando las células no deseadas
mediante centrifugación a una baja velocidad y alta velocidad para eliminar respectivamente plaquetas
y monocitos.
 53

También existen otras soluciones para la separación de mononucleares utilizando gradientes de

densidad entre las cuales, uno muy efectivo es el del percoll (solución de partículas coloidales que
contienen polivinilpirrolidona), aún cuando este se usa más frecuentemente para la separación de
monocitos, granulocitos, eliminación de blastos y células muertas. Para la separación de células
mononucleares es más común el empleo de soluciones comerciales como el Lympphoprep, lymphopure
o Hystopaque.

INMUNOFLUORESCENCIA

Se conocen como métodos de inmunofluorescencia a aquellos en los que se utilizan anticuerpos

que tienen unidos moléculas fluorescentes (fluorocromos). Estas últimas tienen como característica
común la de emitir luz visible después de haber sido excitadas con energía de una longitud de onda
menor. En general, se utilizan dos tipos de fluorocromos: rodamina y fluoresceina, ambas se excitan
con luz utravioleta o azul y respectivamente emiten luz roja y verde-amarillenta. Puesto que la
conjugación fluorocromo-anticuerpo no altera importantemente la especificidad de estos, puede
utilizarse para identificar las presencias de antígeno en diversos materiales (frotis. improntas, células
purificadas, cortes histológicos. etc.).

También se utiliza en cortes de tejidos y en cultivos celulares. Aquí podemos detectar y localizar
el antígeno, anticuerpo, complemento y reacciones Ag-Ab. Permite el diagnóstico rápido de infecciones
microbianas al localizar al agente causal en un determinado tejido o célula. En estas técnicas
histoquímicas o citoquímicas se necesita un microscopio de fluorescencia para realizar el análisis de los
resultados. Tienen como característica diferenciadora de los microscopios ópticos convencionales, un
sistema de iluminación especial y una fuente de luz con el espectro electromagnético correspondiente al
máximo de absorción de los fluorocromos utilizados. El microscopio de fluorescencia tiene un sistema
de iluminación incidente o de epifluorescencia, donde la luz de excitación entra en ángulo recto en el
tubo del microscopio, se refleja en un espejo dicroico (filtros de interferencia) e incide sobre la muestra.
La luz emitida se observa a través de este espejo y del ocular del microscopio.

La muestra exige una preparación especial ya que hay que evitar la inactivación de los antígenos.
Para ello los tejidos de biopsia y los sustratos empleados deben congelarse inmediatamente en
nitrógeno líquido y conservarse a -70°C. Posteriormente se cortan en el crióstato y se colocan en el
portaobjetos para que se proceda a su tinción.

Existen dos, métodos principales de inmunofluorescencia:

 Directa donde los anticuerpos conjugados a fluorocromo están dirigidos contra el antígeno por
investigar.
 Indirecta donde se hace reaccionar primero un anticuerpo no conjugado con su antígeno y la
reacción se visualiza posteriormente con un anticuerpo anti-inmunoglobulina marcada con un
fluorocromo. Este método permite detectar tanto antígenos como anticuerpos, y tiene la ventaja de
que un mismo anticuerpo antiglobulina puede utilizarse en múltiples tipos de reacción Ag-Ab.
Normalmente se usa una inmunoglobulina antihumana de conejo o cabra, que abarata el costo de
la técnica en comparación del método directo, donde se usan anticuerpos mono específicos
marcados con fluorescencia.

III. REACTIVOS

 20 ml de solución salina fisiológica(SSF)

 54

 RPMI

TM TM
Soluciónestéril de Ficoll-Hypaque o Lymphoprep
 Azul de Tripán al 0.4%
 Inmunoglobulina gama anti-CD3, -CD8 y/o -IgM.
 Solución salina
 Amortiguador de fosfatos (PBS), pH 7.2.
 Glicerol al 70% en PBS (v/v)
 Azul de Evans

IV. MATERIAL Y EQUIPO

 1 aguja para vacutainer

 2 tubos cónicos para centrífuga clínica de 1 ml
 Centrifuga clínica
 Puntillas para micropipeta
 1 frasco de alcohol con torundas
 1 liga torniquete
 Tubo con heparina o con ACD
 Microscopio óptico
 Cámara de Neubauer
 Micropipetas de 10 a 200 µL
 Microscopio con fuente de luz ultravioleta
 Portaobjetos y cubreobjetos
 Pipeta pasteur

V. PROCEDIMIENTO

Obtención de células mononucleares de sangre periférica

1. Obtenga 5 ml de sangre venosa del sujeto en estudio en un tubo con heparina o ACD como
anticoagulante.
2. Centrifugue a 3500 rpm durante 5 min.
3. Una vez terminado el paso anterior, extraiga la capa de leucocitos y coloque en un
microtubo.
4. Resuspenda con SSF (v/v)
5. En otro microtubo, coloque 500 μL de Ficoll-hypaque
6. Del resuspendido, tome 500 μL y se colocan en el tubo que ya contiene la solución de Ficoll-
hypaque para estratificar (coloque cuidadosamente por las paredes del tubo)
7. Centrifuggue a 3500 rpm durante 5 min
8. En la interfase entre el Ficoll-hypaque y el plasma diluido quedan los linfocitos (anillo blanco)
los cuales debe recuperar con una pipeta Pasteur.
9. Transfiera las células a un tubo de ensaye y se lave por centrifugación 3 veces con SSF 1500
rpm durante 5 minutos (centrifuga clínica).
10. Resuspenda las células en 1 mL de medio RPMI y proceda a ver viabilidad y su conteo
11. Para realizar el conteo de las células, haga una dilución de 1:10, para ello, tome 20 µL de la
suspensión de las células y 80 µL de azul de trypano (colorante no vital).
12. Una vez contadas las células, ajuste a una concentración de de 4x10 6 linfocitos/ml utilizando
la cámara de Neubauer.
 55
Determinación de rendimiento, viabiliad y pureza de células mononucleares.

1. Limpie la cámara y el cubreobjeto con alcohol al 70% y posteriormente con agua destilada.
2. Coloque el cubreobjeto sobre la cámara en forma horizontal sobre la mesa de trabajo, este
debe quedar centrado.
3. Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribución de
las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña ya que la cámara se llena
con 10 µl. El llenado debe ser continuo en un solo intento.
4. La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de
llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cámara es de
líquido abundante en las terminaciones del recuadro.
5. Conteo: Lleve la cámara a el microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el ocular de 10X
y posteriormente 40X.
6. Busque el primer cuadro donde se realizará el recuento. Considerando que para el recuento
de leucocitos, generalmente se consideran los 4 cuadrados de las esquinas y el del centro.
7. Comience con el recuento de células en el primer cuadro seleccionado. Considere que por
regla, si las células tocan el límite superior o el izquierdo deben contabilizarse, pero no así
aquellas que tocan al límite inferior o el derecho (Fig.7).
8. Repita el procedimiento para los siguientes cuadros.
9. Una vez obtenido el total de las células contadas, debe aplicar la siguiente fórmula para
obtener la concentración de células
Concentración (células/ml) = número de células/ volumen (en ml)
Considerar que como el volumen de un cuadrado grande es de:
2
0.1 cm X 0.1 cm = 0.01cm (área)
2 2 3
16.01 cm X 0.1 mm (profundidad) = 0.01 cm X 0.01 cm= 0.0001 cm = 0.0001 ml
por lo tanto,
Concentración = (número de células X 10 000)/ número de cuadros contados
En aquellos casos donde se utilice dilución, debe multiplicar por el factor de dilución.

FIGURA 7. Recuento celular en la cámara de Neubauer.

Determinación de subpoblaciones de linfocitos por inmunofluorescencia directa

6
1. Ajuste las células obtenidas entre 2.5 y 5*10 células por ml de RPMI.
 56
2. Toman 100 μl de la suspensión celular y adicione 10 μl de anti-CD8+/PE (1:5) y 10 μl de
anti-IgM/FITC (1:2).
3. Mezcle e incube durante 20 minutos y hielo o a 4°C en el refrigerador y protegido de la luz.
4. Lave con 1 ml de PBS (2500 rpm/10 min).
5. Resuspenda la pastilla en 100 μl de medio de montaje PBS:Glicerol (70:30).
6. Finalmente, observe en el microscopio de fluorescencia.

NOTA: Una vez q se carga el anticuerpo, los tubos se deben proteger de la luz.

VI. RESULTADOS:

En este punto incluyan solamente el resultado obtenido, sin comentarios ni observaciones,

las cuales se considerarán en otro punto.

VII. CUESTIONARIO

1. Describe tres aplicaciones de esta técnica en el diagnóstico clínico.

2. ¿Cuáles deben ser las características de un buen fluorocomo?
3. Describe tres características mediante la cuales se puden diferenciar las diferentes
poblaciones sanguíneas.
4. ¿Por qué se utilizan anticuerpos contra CD3, CD8 e IgM?
5. ¿Qué importancia clínica puede tener la identifiación de los marcadores mencionados en la
pregunta anterior?

VIII. DISCUSION

Discute tus resultados, sobre la técnica de Inmunofluorescencia y su importancia en la

Biotecnología. Puede incluir un punto aparte de observaciones en el cual se refiere a
observaciones durante el desarrollo de la práctica, tales como fuentes de error, precauciones,
comentarios, aclaraciones a la técnica.

IX. CONCLUSIONES:

Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

X. BIBLIOGRAFÍA

Incluir las fuentes de información consultadas, proporcionando sus datos completos.

 Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. “Inmunología celular y molecular” (2008*). Editorial
Elsevier Saunders.
 Delves PJ, Martin SJ, Burton DR, Roitt IM (2010*). Roitt’s Essential Immunology. United
Kingdom: Wiley-Blackwell.
 Owen J, Punt J, Stranford S (2014*). “Kuby Immunología”. Editorial Mc Graw Hill
Education.

* Edición que se encuentra en la biblioteca norte de la UAA

 57
PRACTICA No. 13
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTINUCLEARES Y ANTI-DNAn EN EL DIAGNÓSTICO DE
ENFERMEDADES AUTOINMUNES
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

I. OBJETIVO:

El alumno será capaz de:

1. Determinar la presencia de anticuerpos antinucleares (ANA) y anti-DNAn en una muestra de

suero, por medio de la técnica de inmunofluorescencia indirecta, empleando como sustrato
células Hep-2.

2. Interpretar los diferentes patrones de fluorescencia que por ésta técnica se observan y la
importancia de estos en el diagnóstico de las enfermedades autoinmunes.

II. INTRODUCCION:

Los anticuerpos antinucleares (ANA, por sus siglas en inglés) son inmunoglobulinas específicas
para componentes celulares autólogos. Estos se pueden clasificar en tres tipos (Cabiedes y
Núñez-Álvarez, 2010):

 ANA naturales: están presentes en todos los individuos a títulos relativamente bajos y
principalmente son del isotipo IgM. No se asocian a manifestaciones clínicas.
 ANA infecciosos: se originan tras procesos infecciosos y no se asocian a
manifestaciones clínicas de enfermedad auotinmune, y sus títulos bajan conforme
desaparece el proceso que los originó. Pueden ser del tipo IgG, IgA e IgM.
 ANA autoinmunes: su origen es multifactorial (carga genética, medio ambiente, carga
hormonal, etc.) y reflejan la pérdida de tolerancia inmunológica. Su principal isotipo es el
IgG, pero pueden ser del tipo IgA e IgM. Y se asocian a manifestaciones clínicas de
autoinmunidad. Los títulos fluctúan a lo largo de la enfermedad.

La inmunofluorescencia indirecta permite la detección de auto anticuerpos circulantes contra

antígenos tisulares como, ANA, antitiroídeos (AAT), antimitocondriales(AAM), antimúsculo liso
(AML), anti-DNA y otros de importancia en enfermedades autoinmunes de relevancia clínica.La
detección de autoanticuerpos se realiza sobre un portaobjeto que lleva el sustrato correspondiente
(corte de hígado de rata, sustrato clásico, o células HEp-2 para ANA, corte de riñón de rata para
AAM, corte de tiroide humano o de mono para AAT, corte de estómago de rata para AML,
Crithidialucilidae para anticuerpos anti-DNA, etc). Los autoanticuerpos específicos del suero del
paciente se unen al antígeno presente en el sustrato correspondiente. La unión antígeno-
anticuerpo se evidencia con un conjugado anti-inmunoglobulinas humanas-isotiocinato de
fluoresceína. La lectura se realiza en un microscopio de fluorescencia con luz incidente
(epifluorescencia).

Para los ANA se observan patrones de fluorescencia característicos como homogéneo,

moteado, nucleolar, periférico y centromerico que pueden asociarse con algunas especificidades
antigénicas (Tabla 10) (Cabiedes y Núñez-Álvarez, 2010).
 58
 Homogeneo: tinción homogénea en el núcleo, cuya intensidad varía dependiendo de la
concentración de anticuerpos. La cromatina en células en división puede estar teñida de
manera compacta, delineada o difusa y los nucleolos pueden o no estar teñidos.
 Periférico: Se presenta tinción regular alrededor del núcleo, el centro de este patrón presenta
menos tinción. Y la cromatina se tiñe de manera compacta o difusa.
 Moteado: Se divide en moteado grueso (tinción de gránulos finos y gruesos de componentes
del núcleolo y no de la cromatina) y moteado fino (tinción de gránulos finos y gruesos sin
tinción de núcleolo y no de la cromatina).
 Patron nucleolar: tinción intensa de los componentes de los nucléolos, pues hay anticuerpos
anti-topoisomerasa1, anti-Scl-70 y anti-RNA.
 Centromérico: los núcleos se tiñen con puntos finos distribuidos de manera homogénea en
el nucleoplasma de las células en interfase. Además, las células en división evidencian un
punteado fino localizado en la placa de la cromatina.

TABLA 10. Patrones de fluorescencia de ANA versus especificidad antigénica.

ANTICUERPOS ANTÍGENO PATRÓN FLUORESCENTE

Centrómero cromosoma
Variante CREST de
escleroderma, (calcicosis, Centromerico en HEp-2,
Anti-centrómero
dismotilidad esofágica y puede ser negativo en tejido.
Raynud, esclerodactilia y
telagiectasia.
Periférico u homogéneo, típico
pero cualquier es posible.
Anti-DNA DNA doble hebra. Son muy
Aparece mayor fluorescencia
Lupus Eritematoso sistemático específicos de LES
en la periferia del núcleo que
en su parte central
Homogéneo o periférico.
Anti-Histona. Son muy Proteínas básicas (histonas)
Fluorescencia difusa en la
específicos de LES. unidas a DNA
totalidad del núcleo celular
Moteado o no se detecta.
Proteína, histidina
Anti-Jo-1 Motas fluorescentes de
tRNAsintetasa
tamaño variable
Nucleolar. Aparece una
Anti-Nucleolar (pacientes con Antígenos nucleolares RNA mancha fluorescente en el
escleroderma) nucleolar interior del núcleo que
corresponde con el nucleolo
Antígenos nucleares de PCNA en HEp-2, no se
Anti-PCNA
células en proliferación detecta en tejido
Proteína acídica, U1
Moteado. Motas fluorescentes
Anti-RNP (nRNP, U1 RNP) ribonucleoproteína
de tamaño variable
(extractable)
Nucleoproteína acídica Moteado. Motas fluorescentes
Anti-Sm
(extractable) de tamaño variable
Proteína no histona básica,
Anti-Scl-70 Moteado o no detectado
DNA topoisomerasa
Anti-huso Huso en células en división Huso en HEp-2, no detectado
 59
en tejido
Moteado frecuentemente en
Anti-SSA (Ro) Proteína acídica
HEp-2, no detectado en tejido
III. REACTIVOS

 Suero problema
 Suero testigo positivo
 Suero testigo negativo
 Estuche de anticuerpos antinucleares por inmunofluorescencia indirecta
 Glicerol al 50% en PBS (v/v)

IV. MATERIAL Y EQUIPOS:

 Microscopio con fuente de luz ultravioleta

 1 cámara húmeda
 Cubreobjetos
 Micropipetas que midan de 10 a 20 μl con sus respectivas puntas
 Pipetas pasteur
 Cajas Coplin

V. METODOLOGÍA:

1. Seguir las instrucciones del estuche para la detección de anticuerpos antinucleares por
inmunofluorescencia indirecta.
2. ES IMPORTANTE NUNCA PERMITIR QUE LOS POZOS CON EL SUSTRATO SE SEQUEN.
3. Inmediatamente de finalizar, aplique 2-3 gotas de glicerol en PBS (1:1) a cada portaobjeto
cuidadosamente y coloque el cubreobjetos evitando que queden burbujas de aire atrapadas.
4. Examine el portaobjetos en el microscopio de fluorescencia dentro de las 24 primeras horas
de realizado este procedimiento. Sino se va a observar inmediatamente debe guardarse entre
o
4-10 C evitando que reciba luz directa (puede usarse una carpeta de cartón para guardar los
portaobjetos).
5. La intensidad de la fluorescencia puede disminuir gradualmente si los portaobjetos se dejan
expuestos a la luz o bien si se les deja en el microscopio recibiendo la luz de la lámpara aun
por un periodo corto. El aumento óptimo para observar la placa en el microscopio es 250X ó
400X.

VI. RESULTADOS:

Se compara la fluorescencia en los problemas con la de los testigos (positivo y negativo, y

se interpreta según los antecedente. Además se debe esquematizar los resultados.

VII. CUESTIONARIO:

1. ¿Por qué se producen anticuerpos antinucleares?

2. ¿Cuáles son las características de los ANA en las enferemdades autoinmunes?
3. ¿A qué obedece la expresión de los diferentes patrones de fluorescencia?
4. ¿Qué es una enfermedad autoinmune?
 60
5. ¿Qué pruebas confirmatorias solicitaría para el diagnóstico de enfermedades
autoinmunes?

VIII. DISCUSIONES: Discutir los resultados obtenidos entre los testigos y muestras problema
verificando las diferencias disagósticas de los pacientes.

IX. CONCLUSIONES: Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los
resultados obtenidos.

X. BIBLIOGRAFÍA: Incluir las fuentes de información consultadas, proporcionando sus datos

completos.

 Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. “Inmunología celular y molecular” (2008*). Editorial
Elsevier Saunders.
 Delves PJ, Martin SJ, Burton DR, Roitt IM (2010*). Roitt’s Essential Immunology. United
Kingdom: Wiley-Blackwell.
 Owen J, Punt J, Stranford S (2014*). “Kuby Immunología”. Editorial Mc Graw Hill
Education.
 Rojas Espinosa O (2006*). “Inmunologia (de memoria)” Editorial Médica Panamericana.
+
 Cabiedes J y Núñez-Álvarez (2010 ). Anticuerpos Antinucleares. Reumatología Clínica;
6(4): 224-230.
* Edición que se encuentra en la biblioteca norte de la UAA
+ Edición que se encuentra en la biblioteca virtual de la UAA