“Año del Diálogo y la Reconciliación Nacional”

Bioquímica, código: C0199

Práctica 1: ESPECTOFOTOMETRÍA

Estudiante: Salomé Ramos Ariana Karen

Profesora: María Báez C.

Lima 31 de Agosto 2018

OBJETIVOS
1. Obtener y analizar espectros de absorción de biomoléculas.
2. Aplicar las técnicas espectrofotométricas para el estudio funcional de las biomoléculas.
3. Aplicar la ley de Lambert-Beer para la cuantificación de biomoléculas.
INTRODUCCIÓN
Dentro del análisis cuantitativo espectroscópico, la espectrofotometría es la técnica más utilizada. Esta está basada en
la absorción de radiación ultravioleta y visible por la muestra, lo cual ocasiona un estado activado y el calor que se
genera se desprende en forma de calor. Sin embargo, este calor disipado es muy pequeño, lo cual convierte a la
espectrofotometría en un método que no genera alteraciones en el sistema analizado.
La concentración de la muestra a analizar es un parámetro importante debido a que la ley de Lamber-Ber, es la base
de la espectrofotometría, esta asume que A = ε b c , donde c se expresa en mol/L, b es la longitud del camino
óptico(recipiente que contiene al analito) y ε es la absortividad molar, la cual es específica para cada sustancia que
corresponde a la cantidad de radiación que absorbe a una determinada longitud de onda por unidad de concentración,
teniendo como unidades L mol-1 cm-1.
La hemoglobina consta de cuatro cadenas polipeptídicas, consta de dos subunidades: 𝜶 y 𝜷. Por cada subunidad se
encuentra el grupo hemo, grupo prostético, encajado en la cavidad superior de la hemoglobina y unida por fuerzas de
Van der Waals al Hierro y los nitrógenos. Esta proteína globular es fundamental para el transporte de oxígeno. Debido
a esto, en esta práctica analizaremos el espectro de absorción de la hemoglobina y sus derivados así como las
diferencias de absorción de hemoglobinas fetales y adultas.
PROCEDIMIENTO
1. Experimento 1: Espectro de absorción de la hemoglobina

2. Experimento 2: Tabulación de datos para el espectro de absorción de la hemoglobina

3. Experimento 3: Cuantificación de proteínas por el método de Biuret

RESULTADOS
1. Experimento 1: Espectro de absorción de la hemoglobina
a. Tabla 1: Absorbancia de los analitos A,B y C para cada longitud de onda.
Longitud
A B C
de onda
390 0.554 0.382 0.238
400 0.506 0.646 0.344
410 0.401 1.054 0.527
415 0.345 1.165 0.632
420 0.292 1.069 0.771
425 0.236 0.844 0.678
430 0.219 0.597 0.525
440 0.175 0.289 0.254
450 0.15 0.165 0.175
460 0.13 0.112 0.136
470 0.114 0.083 0.111
480 0.101 0.066 0.098
490 0.09 0.056 0.088
500 0.079 0.049 0.081
510 0.069 0.047 0.08
520 0.061 0.054 0.085
530 0.055 0.091 0.101
540 0.051 0.134 0.106
550 0.049 0.118 0.105
560 0.05 0.086 0.099
570 0.051 0.108 0.087
580 0.052 0.14 0.075
590 0.052 0.046 0.061
600 0.054 0.01 0.048
610 0.052 0.004 0.039
620 0.046 0.002 0.033
630 0.036 0.001 0.03
 Absorbancia vs Longuitud de onda
1.4

1.2

0.8
Absorbancia

0.6

0.4

0.2

0
370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610 620 630
Longuitud de Onda

A B C

Gráfico 1. Dispersión de la absorbancia de los Analitos A, B y C frente a diversas longitudes de ondas

comprendidas en el rango de 390-630nm.

2. Experimento 2: Tabulación de datos para el espectro de absorción de la hemoglobina

 ABSORBANCIA
Absorbancia vs Longuitud de onda

0.14

0.13

0.12

0.11

0.1

0.09

0.08
HbA (Prahl)

0.07 HbAO2(Prahl)
HbA (Zjistra2)
0.06
HbAO2(Zjistra2)

0.05 HbF(Zjistra2)
HbFO2(Zjistra2)
0.04

0.03

0.02

0.01

0
190 240 290 340 390 440 490 540 590 640 690 740 790 840
LONGUITUD DE ONDA

Gráfico 2. Dispersión de la absorbancia los diferentes analitos de hemoglobina frente a diversas longitudes
de onda comprendidas en el rango 250-850 nm.

Tabla 2. Tabulación de la absorbancia para cada analito de hemoglobina por longitud de onda, tomados de
10 en 10nm.
HbA HbfO2
LON.OND HbO2 (Prahl) Hba (Zjistra2) HbaO2 (Zjistra2) HbF (Zjistra2)
(Prahl1) (Zjistra2)
250 0.028184 0.026528
260 0.029074 0.029094
270 0.03072 0.0304017
280 0.029718 0.032984
290 0.024591 0.026188
300 0.01611 0.016493
310 0.014789 0.015838
320 0.018627 0.019688
330 0.022714 0.024378
340 0.027118 0.026971
350 0.030523 0.026644
360 0.033735 0.023686
370 0.034992 0.022044
380 0.036308 0.027391
390 0.041945 0.041937
400 0.055824 0.066558
410 0.075989 0.11671
420 0.10189 0.12009
430 0.13215 0.061518
440 0.10332 0.025645
450 0.025823 0.015704 0.01348 0.0162 0.01297 0.01582
460 0.005847 0.01112 0.005131 0.01117 0.004918 0.01096
470 0.004039 0.008302 0.003457 0.008399 0.003314 0.008246
480 0.003638 0.006657 0.003322 0.006722 0.003211 0.006605
490 0.004171 0.005921 0.003633 0.005741 0.00352 0.005648
500 0.005216 0.005233 0.00433 0.005154 0.004249 0.005082
510 0.006443 0.005009 0.005383 0.004878 0.005362 0.004834
520 0.007897 0.006051 0.006478 0.005981 0.006489 0.006028
530 0.009759 0.009989 0.00801 0.01035 0.008064 0.01054
540 0.011648 0.013309 0.01047 0.01432 0.0106 0.01448
550 0.013353 0.010754 0.01296 0.01201 0.01314 0.01184
560 0.013447 0.008153 0.01311 0.008767 0.01326 0.008599
570 0.011268 0.011124 0.01142 0.01168 0.01152 0.01172
580 0.009255 0.012526 0.009141 0.01442 0.009216 0.01447
590 0.007081 0.0036 0.006875 0.004262 0.00692 0.004004
600 0.003669 0.0008 0.003759 0.0009602 0.003713 0.000896
610 0.002361 0.000377 0.001946 0.000397 0.0018882 0.000366
620 0.001627 0.000236 0.001336 0.000218 0.001308 0.000201
630 0.001287 0.000153 0.00105875 0.000139 0.001054 0.000124
640 0.001086 0.000111 0.000936 0.000104 0.000924 0.000092
650 0.000938 0.000092 0.000873 0.000098 0.000868 0.00009
660 0.000807 0.00008 0.000815 0.0001 0.000822 0.000095
670 0.000699 0.000074 0.000721 0.000102 0.000739 0.000097
680 0.000602 0.000069 0.000612 0.000103 0.000631 0.000098
690 0.000513 0.000069 0.000516 0.000103 0.000532 0.000098
700 0.000449 0.000073 0.000447 0.000105 0.00046 0.000101
710 0.000385 0.000079 0.000397 0.00011 0.000408 0.000107
720 0.000331 0.000087 0.000353 0.000118 0.000362 0.000114
730 0.000276 0.000098 0.000327 0.000127 0.000332 0.000123
740 0.000279 0.000112 0.000339 0.000137 0.000338 0.000131
750 0.000351 0.00013 0.000388 0.000148 0.000385 0.000141
760 0.000387 0.000147 0.000414 0.000159 0.000423 0.000153
770 0.000328 0.000163 0.000347 0.000171 0.000362 0.000165
780 0.000269 0.000178 0.000273 0.000183 0.000283 0.000177
790 0.000223 0.000189 0.000233 0.000196 0.000238 0.000189
800 0.00019 0.000204 0.000215 0.000208 0.000215 0.0002
810 0.000179 0.000216
820 0.000173 0.000229
830 0.000173 0.000244
840 0.000173 0.000256
850 0.000173 0.000265
 3. Experimento 3: Cuantificación de proteínas por el método de Biuret
TABLA 3. Absorbancia de las diferentes soluciones frente a una longitud de onda de 540nm.

SOLUCIONES ABSORBANCIA
1 0.099
2 0.278
3 0.566
4 0.581
5 0.721
6 0.802
M1 0.467
M2 0.208

GRÁFICO 3. Plot de dispersión de la absorbancia para las diversas concentraciones en las soluciones

y = 0.0271x + 0.1026
Absorbancia vs Concentración R² = 0.9498

1
0.9
0.8
0.7
Absorbancia

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 5 10 15 20 25 30
Concentración

DISCUCIÓN
EXPERIMENTO 1: ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE LA HEMOGLOBINA
El comportamiento variado de los diversos grupos frente al mismo rango de longitud de onda (ver TABLA 1), se
atribuyen a la constitución molecular de estos. Para el caso de la hemina, la cual resulta debido a la unión de la
Protoporfirina IX y el átomo de hierro en un estado de oxidación férrico, origina una versión de hemoglobina incapaz
de transportar oxígeno, lo cual puede explicar el comportamiento tan distinto a los grupos B y C.
El grupo B sólo contenía Hb y agua destilada, los picos máximos de absorción obtenidos corresponden con a las
longitudes de onda de 415 y 420 nm, los cuales corresponde a la literatura consultada. El grupo C, el cual contenía
reactivo de Drabkin, tuvo valores máximos de absorbancia a una longitud de onda de 420 y 425nm. Este reactivo
reacciona con la Hb mediante el cianuro y ferrocianuro, esto ocasiona la oxidación de la hemoglobina a
metahemoglobina la cual a su vez pasa a cianometahemoglobina. Esto explica la diferencia de absorbancia entre los
grupos B y C.
EXPERIMENTO 2: TABULACIÓN DE DATOS PARA EL ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE LA HEMOGLOBINA
Las gráficas que corresponden a los datos de W. G. Zijlstra, A. Buursma y O. W. van Assendelft muestran que no hay
una gran variación entre la hemoglobina fetal y adulta, ya se encuentren en su estado oxigenado o desoxigenado. Los
valores de absorbancia son relativamente bajos para el caso de la hemoglobina fetal en comparación de la de un
adulto, debido a que la Hb fetal tiene mayor afinidad al oxígeno al presentar distinta estructura, lo cual limita la unión
de oxígeno a la desoxihemoglobina..
Así mismo la data proporcionada por Scott Prahl indica una diferencia significativa entre la hemoglobina con y sin
oxígeno. Esto se debe a que la sangre oxigenada encuentra su longitud de onda de máxima absorción desplazada hacia
el color azul (conocido como efecto hypsocrómico) el cual es ocasionado por los cambios conformacionales de la
porfirina con hierro. La unión a oxígeno induce el estado T de la subunidad, en el que el grupo hemo se encuentra en
un plano. Debido a que la sangre oxigenada absorbe a un color más azulado, reflejará una tonalidad más intensa.

EXPERIMENTO 3: CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BIURET

Utilizando la ecuación que se obtuvo en el plot de dispersión de Absorbancia vs concentración (Ver gráfico 3), se halló
las concentraciones para las muestras 1 y 2, las cuales tienen valores de 13.446M y 3.8893M.
Se infiere que la absorbancia es proporcional a la concentración de las proteínas en cada una de las soluciones; por lo
que es de esperar que ante mayor concentración, la absorbancia aumente. El método de Biuret es idóneo para este
experimento debido a que posee un color específico al ser añadido por diversas soluciones a distintas concentraciones,
o cual es útil al momento de analizar por espectrofotometría.
CONCLUSIONES
4. Los picos máximos de absorción característicos de la hemoglobina son 415 y 420 nm. La hemina posee un
comportamiento distinto debido a que el hierro se encuentra en estado férrico.
5. No hay diferencias significativas en la absorbancia de la hemoglobina fetal y adulta. La hemoglobina fetal
presenta mayores valores de absorbancia debido a que el feto puede sobrevivir al ambiente hipóxico de la
placenta.
6. La ley de Lambert-Ver demostraron que a mayor concentración mayor absorbancia por parte de la solución.
7. La absorbancia de la hemoglobina desoxigenda y oxigenada no presente variación significativa para ambos
grupos.
8. Las absorbancias de la Hb oxigenada y la Hb desoxigenada son diferentes debido a sus estructuras
cuaternarias.
9. El patrón de absorbancia de la hemoglobina varía con el cambio de oxigenación del grupo prostético hemo.

BIBLIOGRAFÍA
1. Correderas, R. A. (2008). “Determinación de la hemoglobina en el laboratorio – Hematologia”. [Online]. ISSN:
1988-6047.
2. Frydman, B., Bryks de Frydman, R. “Estructura de porfirinas y metaloporfirinas”. [Online]. Editorial El Ateneo.
(Barcelona).
3. Orphan Europe. HEMINA NORMOSANG® http://studylib.es/doc/8184349/hemina-normosang®--orphan-
europe-
4. PEÑUELA, O. Hemoglobina: una molécula modelo para el investigador. Colombia Médica, North America, 36,
Nov. 2009. Available at: http://colombiamedica.univalle.edu.co/index.php/comedica/article/view/366/1136
5. Zijlstra, W., Buursma, A., W. van Assendenlft, O. (2000). “Visible and Near Infrared Absorption Spectra of
Human and Animal Haemoglobin”. [Online]. VSP, Ultrecht.
6. Zijlstra, W. G., Buursma, A. (1991). “Absorption Spectra of Human Fetal and Adult Oxyhemoglobin, De-
Oxyhemoglobin, Carboxyhemoglobin, and Methemoglobin”. [Online]. CLIN.CHEM.37/9, 1633-1638
CUESTIONARIO
EXPERIMENTO 1: ESPECTRO DE ABSORCION DE LA HEMOGLOBINA
1. ¿Por qué se lee la absorbancia de la hemoglobina entre 390 y 630 nm?
Porque es en el rango del espectro de luz visible en el cual la hemoglobina absorbe una mayor cantidad de luz
debido a la porfirina presente en su estructura. Además en este rango se puede visualizar los picos máximos
de absorbancia característicos.
 2. ¿Qué diferencias encuentra entre los máximos de absorbancia de la hemina y las muestras de
hemoglobina?- Explique el origen de esas diferencias.
La hemina, al pertenecer al grupo de las porfirinas (grupo hemo), posee una banda máxima de absorción
alrededor de los 450 nm. Junto a esto, se ecnuentra presente la banda de Soret alrededor de los 380nm para
el complejo Fe(III)-hemo. Estas diferencias se deben a que los grupos Hemo, al formar enlaces covalentes con
las proteínas, e interactuar con ellas, cambian la energía necesaria para producir una transición electrónica,
de esta forma varían la longitud de onda en la cual se da la máxima absorción.
3. ¿Qué longitud de onda utilizaría para identificar hemoglobina en una solución? Explique el porqué.
La longitud de onda que se utilizaría para identificar hemoglobina sería en un rango de 390 a 630 nm porque
es a este rango es visible la mayor absorbancia, además los picos característicos en 540 y 580 nm confirmarían
la presencia de hemoglobina en un solución.
4. ¿Existe alguna razón estructural que origine el espectro de absorción de la hemoglobina? Explique.
En la hemoglobina podemos notar que el cromáforo es el grupo hemo, debido a que este grupo presenta una
banda de absorción característica cercano a los 400nm. Esta propiedad del grupo hemo se debe
principalmente a los dobles enlaces conjugados en este compuesto y a su interacción con un metal de
transición (Fe).

EXPERIMENTO 2: TABULACIÓN DE DATOS PARA EL ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE LA HEMOGLOBINA

1. ¿Qué concluye de las mediciones de Scott Prahl y W.G. Zijlstra?
Se concluye que la hemoglobina oxigenada y desoxigenada fetal como adulta muestran diferencias
significativas de absorción debido al cambio estructural que ocurre en la proteína, además también se observa
que no hay cambios relevantes entre la absorbancia de la hemoglobina fetal y adulta aunque la fetal posea
una mayor afinidad por el oxígeno.
2. ¿Qué diferencias hay entre la hemoglobina oxigenada y la desoxigenada?
Las diferencias entre la hemoglobina desoxigenada y oxigenada radican en su conformación estructural, ya
que en la estructura T (tensa), el ion de hierro se encuentra hacia fuera del plano del anillo de porfirina y se
hace menos accesible al oxígeno para unirse a ella , reduciendo así su afinidad al oxígeno. Mientras que en la
estructura R (relajada) el átomo de hierro está en el plano del anillo de porfirina y es accesible para unirse al
oxígeno, lo que aumenta su afinidad por el oxígeno.8

3. ¿Qué diferencias funcionales hay entre la Hb adulta y la fetal? ¿Qué implicancias fisiológicas deduce del
comportamiento diferencial?
La hemoglobina fetal debe poseer una mayor afinidad por el oxígeno para que este sea irrigado por medio de
la placenta hacia el feto. Por otro lado, la hemoglobina adulta posee una menor afinidad por el oxígeno para
que este sea liberado con mayor facilidad. Además, la Hb fetal no es modulada por 2,5 bifosfofructosa (2,5-
BPF), por lo que a concentraciones normales de 2,5-BPF la Hb fetal posee una mayor afinidad de oxígeno que
la sangre adulta, esto permite que el feto pueda absorber el oxígeno que necesita a partir de la sangre de su
madre.
4. ¿Cuál es la razón estructural que origina los espectros de absorción de la hemoglobina?
El grupo hemo presenta un anillo tetrapirrólico altamente resonante, por lo que presenta electrones
deslocalizados que absorben energía para saltar en los orbitales de nivel energéticos. Por lo tanto se requieren
determinadas longitudes de onda para provocar el salto de orbital y absorber esa energía.
EXPERIMENTO 3: CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BIURET
1. ¿Cuál es la concentración de proteína en las muestras problema?
Las concentraciones en las muestras problemas fueron: M1=13.446M y M2= 3.8893M.
2. Si Ud hubiese utilizado una muestra de suero como muestra problema del experimento 3. ¿Los valores de
concentración obtenidos para las muestras de suero representan a la concentración de albúmina o a la
concentración total de proteínas?
Representan la concentración total de proteínas ya que depende de la concentración de aminoácidos
presentes en la muestra.
3. Con los ensayos realizados en la presente práctica, ¿podría usted diferenciar la concentración de una
muestra de Hemoglobina en sangre o de Albúmina en suero? Describa el ensayo a utilizar indicando las
longitudes de onda que utilizaría.
Sí, para diferencia la albúmina utilizaría un rango de longitud de 620-650 nm, esperando que el pico máximo
de absorbancia se en 625. Mientras que para determinar la presencia de hemoglobina utilizaría un rango de
390-630nm, esperando que el pico máximo de absorbancia se de en 415 y 420 nm.