Introduccion

El ciclo celular es un proceso estrechamente regulado que organiza la

duplicación del genoma y la distribución precisa del ADN y otros factores en
las células hijas después de la mitosis. La progresión a través del ciclo celular
está mediada principalmente por miembros de la familia de quinasas
dependientes de ciclina (CDK) en asociación con las proteínas ciclinas
asociadas (Malumbres, 2014), y la entrada a la mitosis está controlada por la
activación del complejo ciclina B-CDK1 (también conocido como factor
promotor de la mitosis; Lohka et al., 1988; Labbe et al., 1989; Gautier et al.,
1990). La actividad de la ciclina B1-CDK1 está fuertemente regulada a través
de varios ciclos de retroalimentación (Lindqvist et al., 2009), y durante G2,
la ciclina inactiva B1-CDK1 se mantiene en el citosol después de la
fosforilación de CDK1 en Y15 por Wee1 y quinasas relacionadas para
prevenir la prematura entrada en la mitosis (Gould y Nurse, 1989; Parker y
Piwnica-Worms, 1992). La actividad de la ciclina B1-CDK1 aumenta
progresivamente una vez que las células entran en la profase (Gavet and
Pines, 2010b), y la ciclina activa B1-CDK1 se traslada al núcleo (Gavet and
Pines, 2010a), lo que desencadena varios eventos mitóticos como el
redondeo celular. desintegración de la envoltura nuclear, condensación de
cromosomas y formación del huso.
Para la mayoría de las células, la progresión del ciclo celular es dependiente
del anclaje (Fang et al., 1996; Schulze et al., 1996), requiriendo interacciones
célula-ECM a través de receptores transmembrana de integrina y la
formación de complejos de adhesión asociados con actina (Zhu et al. , 1996;
Renshaw et al., 1997; Roovers et al., 1999; Mettouchi et al., 2001; Welsh et
al., 2001; Park et al., 2011). Antes de entrar en la mitosis, los complejos de
adhesión se desmontan rápidamente, y las células se retraen de su entorno
y redondear para dividir (Cramer y Mitchison, 1997; Yamakita et al., 1999;
Maddox y Burridge, 2003; Dao et al., 2009). Este redondeo de células es
necesario para la formación precisa del huso y la captura del cromosoma
(Carreno et al., 2008; Kunda et al., 2008; Kunda and Baum, 2009; Lancaster
et al., 2013). Además, se requiere una adhesión mediada por integrinas para
determinar la orientación de la división celular (Théry et al., 2005) y para que
ocurra una citocinesis eficiente (Aszodi et al., 2003; Reverte et al., 2006;
Pellinen et al. , 2008; Högnäs et al., 2012; Mathew et al., 2014). Sin embargo,
el mecanismo molecular que acopla la maquinaria del ciclo celular a la
regulación de la adhesión celular a través de complejos de adhesión
asociados a la integración es desconocido.
En este estudio, demostramos que la regulación de los complejos de
adhesión y la remodelación del citoesqueleto de actina se producen de
manera dependiente del ciclo celular. Cuando las células pasaron de G1 a S,
observamos un aumento dependiente de CDK1 en el área compleja de
adhesión mediada en parte a través de la fosforilación de la formina FMNL2.
Al entrar en G2, el área del complejo de adhesión disminuyó y la actina se
distribuyó más periféricamente. La pérdida de complejos de adhesión en G2
fue mediada por el aumento de los niveles de ciclina B1 y la posterior
inhibición de CDK1 por Wee1. Se requirió la remodelación de los complejos
de adhesión para que las células se redondearan posteriormente y
experimentaran una mitosis eficiente porque la prevención de los cambios
dio como resultado un aumento de las mitosis fallidas y la multinucleación.
En conjunto, estos datos demuestran que la inhibición de CDK1 es el
desencadenante que inicia la remodelación de la adhesión en preparación
para la entrada en la mitosis y revela un vínculo íntimo entre la maquinaria
del ciclo celular y la adhesión celular-ECM.
Resultados
Los complejos de adhesión se modifican de manera dependiente del ciclo
celular.
Inicialmente, realizamos una caracterización detallada de los cambios.
En arquitectura de adhesión compleja que tiene lugar a lo largo del ciclo
celular. Para este propósito, las células HeLa se sincronizaron mediante un
bloqueo de timidina doble, liberadas del bloque para varios puntos de
tiempo que reflejan la presencia en G1, S y G2 (Fig. S1, A y B), y se fijaron y
se tiñeron para paxilina (como marcador de complejos de adhesión) y F-
actina. Consistente con S como un período de crecimiento celular, el área
del complejo de adhesión por célula aumentó de G1 a S (Fig. 1, A y B; y Fig.
S1 C). El patrón de los complejos de adhesión también cambió de una
ubicación predominantemente periférica en G1 a sitios que se distribuyeron
por todo el cuerpo celular en S (Fig. 1, A y C; y Fig. S1 C). Al entrar en G2, el
área del complejo de adhesión disminuyó (Fig. 1, A y B; y Fig. S1 C), y la
distribución volvió al patrón periférico observado en G1 (Fig. 1, A y C; y Fig.
S1 DO). El citoesqueleto de actina se modificó concomitantemente con los
cambios observados en los complejos de adhesión: en G1 y G2, la actina F se
encontró predominantemente en la periferia celular, mientras que las
células en S exhibieron fibras de estrés que abarcaban el centro (Fig. 1 A y
S1). DO). También se hicieron observaciones similares cuando se utilizó
vinculina como marcador alternativo de complejos de adhesión (Fig. S1 D) y
en células U2OS sincronizadas (Fig. S1 E). Además, la disminución en el área
del complejo de adhesión observada en G2 se confirmó en el análisis de
células vivas de células que coexpresan GFP-paxilina y mTurq2-tallo-proteína
de unión 18-126 (SLBP18-126). La degradación de mTurq2-SLBP18–126 se
produce al final de S (Bajar et al., 2016) y, por lo tanto, se puede utilizar como
marcador para la entrada en G2. Consistente con las observaciones hechas
en celdas fijas, el área del complejo de adhesión disminuyó progresivamente
a medida que las celdas progresaron a través de G2 (Fig. 1, D – F; y Video 1).
Por lo tanto, estas observaciones definen la modificación dependiente del
ciclo celular de los complejos de adhesión y el citoesqueleto y resaltan la
remodelación típica que tiene lugar en la preparación para ingresar a la
mitosis. Sin embargo, en lugar del desmontaje del complejo de adhesión
inmediatamente después del inicio de la mitosis, como se supone
actualmente por el rápido redondeo que se produce en M, estos datos
indican que una remodelación inicial de los complejos de adhesión y el
citoesqueleto se desencadenó antes, durante G2.
Determinar la relevancia funcional del ciclo celular dependiente.
la remodelación de la adhesión en G2, ya sea la fibra de estrés de la actina o
el desensamblado del complejo de adhesión en G2, se eliminó mediante el
tratamiento de las células G1 con un activador RhoA (CN03), que evita la
hidrólisis de RhoA-GTP y bloquea RhoA en un estado activo, o manganeso,
que hiperactiva las integrinas (Fig. S1 E; Mold et al., 1995, 2002). Ambos
enfoques inhibieron el redondeo celular (Fig. 1 G y los Videos 2, 3 y 4), sin
suprimir la progresión del ciclo celular en G2 (Fig. S1 F), y disminuyeron en
gran medida la capacidad de aquellas células que se redondearon para
someterse exitosamente división celular (Fig. 1 H y Vidós 2, 3 y 4). Ambos
tratamientos también provocaron un aumento en el número de células hijas
multinucleadas (Fig. 1, I y J). Estos datos demuestran que la modificación
controlada de cualquiera de las células: la adhesión de ECM o el
citoesqueleto de actina en G2 es esencial para permitir que las células pasen
por la mitosis con precisión y eso, de acuerdo con las observaciones previas
(Dao et al., 2009; Lancaster et al., 2013 ; Marchesi et al., 2014),
manipulaciones que impiden la adherencia
El desmontaje complejo antes de la mitosis reduce la capacidad de las
células para dividirse de manera eficiente.
Se requiere actividad de quinasa CDK1 para mantener los complejos de
adhesión en interfase
CDK1 es una serina / treonina quinasa promiscua que puede
Phorylate cientos de proteínas, con un gran número de estos involucrados
en la regulación de la arquitectura celular (Olsen et al., 2010; Petrone et al.,
2016). Sobre la base de los análisis fosfoproteómicos, los complejos de
adhesión contienen una variedad de sitios potenciales de fosforilación de
quinasas mitóticas, lo que aumenta la posibilidad de que estas enzimas
puedan regular la adhesión directamente (Robertson et al., 2015). De
manera consistente con esta hipótesis, informamos previamente que la
inhibición de CDK1 produce una pérdida de fibras de estrés de actina y la
formación de pequeños complejos de adhesión nacientes en la periferia de
la célula (Robertson et al., 2015). Debido a que la pérdida de complejos de
adhesión y las fibras de estrés de actina es característica de las células en G2,
la hipótesis de que la regulación de los complejos de adhesión dependientes
de CDK1 puede ser fundamental para los cambios observados durante la
progresión del ciclo celular. La inhibición de la actividad de la quinasa CDK1
en células HeLa asíncronas con tres compuestos diferentes redujo el área del
complejo de adhesión por célula e indujo una pérdida de fibras de tensión
(Fig. 2, A y B; y Fig. S2 E). En contraste, el tratamiento con inhibidores
dirigidos a CDK2 o CDK4 / 6, que redujeron la viabilidad celular después del
tratamiento a largo plazo (Fig. S2 D) o indujo la detención de G1 / S en células
sincronizadas (Fig. S2 C), no tuvo ningún efecto sobre los complejos de
adhesión o el citoesqueleto de actina (Fig. S2, A y B). La reducción de CDK1
mediada por RNAi también disminuyó el área del complejo de adhesión de
una manera que se rescató mediante la reexpresión de CDK1 de WT pero no
de CDK1 muerta con quinasa dominante-negativa (Fig. 2, C – E; van den
Heuvel y Harlow, 1993). Juntos, estos datos demuestran un papel específico
para la actividad de la quinasa CDK1 en el mantenimiento de complejos de
adhesión de integrinas. Además, los cambios en el área del complejo de
adhesión y la distribución observados durante el ciclo celular (Fig. 1) se
perdieron en las células sincronizadas después de la caída de CDK1 (Figs. 2 F
y S2, F – H), lo que demuestra que el ciclo celular - los cambios dependientes
en los complejos de adhesión antes de la mitosis dependen de CDK1 e
identifican un nuevo papel no mitótico para CDK1 en la regulación de los
complejos de adhesión y el citoesqueleto de actina.
La actividad de CDK1 está predominantemente mediada por la interacción
con ciclinas A2 y B1 (Gong y Ferrell, 2010); por lo tanto, la pareja que se une
a la ciclina que media en la regulación dependiente de CDK1 de los complejos
de adhesión se evaluó mediante la eliminación de RNAi de ciclina A2 o ciclina
B1 (Fig. 2 G). En una población asíncrona, el derribo de ciclina A2 o ciclina B1
no dio como resultado la detención de células en G2 (Fig. S2 I); sin embargo,
la caída de la ciclina A2 dio como resultado una disminución significativa en
el área del complejo de adhesión y una distribución periférica de los
complejos de adhesión y la actina que recuerda la inhibición de CDK1 o las
células en G2, mientras que la reducción de la ciclina B1 no tuvo ningún
efecto (Fig. 2H y S2 J). Además, el tratamiento de las células de eliminación
de ciclina A2 con inhibidor de CDK1 no redujo aún más el área del complejo
de adhesión, mientras que se observó una disminución significativa en las
células de eliminación de ciclina B1 (Fig. 2 H y S2 J). Estos datos demuestran
que el papel de CDK1 en la regulación de los complejos de adhesión y el
citoesqueleto durante la interfase es probable que dependa de su unión a la
ciclina A2 en lugar de la ciclina B1.
La señalización de CDK1 se ha relacionado con cambios en el citoesqueleto
de actina durante la mitosis y la citocinesis a través de la regulación de los
factores de intercambio de nucleótidos de guanina Rho (RhoGEF) como Ect2,
GEF-H1 y RhoGEF asociado a leucemia (LARG; Birkenfeld et al., 2007 ;
Matthews et al., 2012; Helms et al., 2016), así como otras proteínas
asociadas a la actina como las filaminas, WDR1 y forminas (Cukier et al.,
2007; Kuilman et al., 2015; Ramanathan et al. , 2015). Para identificar
posibles nuevos objetivos de CDK1 en células no mitóticas, se usó un
enfoque basado en espectrometría de masas (MS) para identificar proteínas
en células no sincronizadas que fueron fosforiladas en motivos de sustrato
de CDK de una manera dependiente de CDK1. La inmunoprecipitación con
un anticuerpo anti CDK / MAPK motivo identificó 26 proteínas cuya
abundancia disminuyó en ≥1.5 veces después de la inhibición de la quinasa
CDK1 (Fig. 3A). Entre estas proteínas había muchos sustratos CDK1
conocidos (Fig. 3 A, verde) y varias proteínas asociadas a actina (Fig. 3 A,
rojo), destacando que CDK1 es capaz de fosforilar múltiples proteínas
involucradas en la regulación del citoesqueleto. De particular interés fue el
formato FMNL2 porque anteriormente se había relacionado con la
estimulación de la formación de fibra de actina aguas abajo de la activación
de RhoC (Kitzing et al., 2010; Zeng et al., 2015). FMNL2 tiene un único
fosfosito de CDK1 de consenso predicho en S1016 (High Stringency, Scansite
3.0; Obenauer et al., 2003), y la fosforilación de FMNL2 dependiente de
CDK1 se confirmó mediante transferencia Western después de la
inmunoprotección con sustrato de CDK (Fig. 3 B). Además, el mapeo de
fosfositos basado en MS de mCherry-FMNL2 purificado por afinidad detectó
la fosforilación de FMLN2 en los residuos S171 y S1016, y la fosforilación en
S1016 se redujo después de la inhibición de CDK1 en células asíncronas (Fig.
3 C). La ciclina A2-CDK1 purificada y la ciclina B1-CDK1 fueron capaces de
fosforilar un fragmento C-terminal de FMNL2 etiquetado con GST
directamente (Fig. 3 D), y se confirmó que esta fosforilación se produce en
S1016 mediante un mapeo de fosfositos basado en MS (Fig. 3 E). No se
observó una diferencia significativa en la abundancia del péptido fosforilado
S1016 entre el término GST-FMNL2 C incubado con ciclina A2-CDK1 o ciclina
B1-CDK1 (Fig. 3 E), lo que demuestra que CDK1 se asocia con ciclina A2 o
ciclina B1 es capaz de fosforilar FMNL2 en S1016 in vitro. Para probar el
papel funcional de la fosforilación de FMNL2 dependiente de CDK1, se
expresó un mutante fosfomimético de FMNL2-S1016E en células de
eliminación de CDK1. En contraste con la expresión de WT FMNL2, la
expresión de FMNL2-S1016E rescató parcialmente la pérdida del área del
complejo de adhesión observada en células asíncronas después de la caída
de CDK1 (Fig. S3 A), lo que demuestra que la fosforilación de FMNL2 en
S1016 contribuye a la regulación de Complejos de adhesión aguas abajo de
CDK1. Estos datos, junto con los datos de MS presentados en este estudio
(Fig. 3 A) y en investigaciones anteriores (Robertson et al., 2015) también
sugieren que, además de FMNL2, CDK1 es potencialmente capaz de regular
múltiples proteínas.
Que controlan los complejos de adhesión y el citoesqueleto de actina.
A continuación, intentamos determinar el papel de FMNL2 en la
modificación dependiente de CDK1 de los complejos de adhesión durante el
ciclo celular. En células sincronizadas, la transferencia Western después de
la inmunoprecipitación con sustrato CDK demostró niveles similares de
fosforilación de FMNL2 en G1 y S, seguida de una reducción en la
fosforilación de FMNL2 en G2 (Fig. S3 C), lo que sugiere que el aumento de
la fosforilación de FMNL2 no contribuyó a un crecimiento complejo en fase
S pero que la desfosforilación puede

Facilita el desmontaje del complejo de adherencia en G2. De acuerdo con

esto, la caída de FMNL2 o la expresión de FMNL2-S1016A no fosforilables
dieron como resultado la pérdida de fibras de tensión y predominantemente
complejos de adhesión periféricos en G1 y S (Figs. 3 F y S3 D). Durante S,
estos complejos de adhesión periférica aumentaron en área (Fig. 3, F y G; y
Fig. S3, B y D), pero no se observó ningún cambio asociado en los complejos
de adhesión central como se observa en las células de control (Fig. 3 H y S3
C). Además, la reducción en los complejos de adhesión después de la
transición de S a G2 no se produjo después de la caída de FMNL2 o la
expresión de FMNL2-S1016A (Fig. 3, F y G; y Fig. S3, B y D). Por lo tanto, se
requiere la fosforilación de FMNL2 dependiente de CDK1 en S1016 para la
formación de complejos de adhesión central y fibras de estrés de actina que
se extienden centralmente con desfosforilación en G2 que contribuye al
complejo de adhesión y desmontaje de fibra de esfuerzo. En ausencia de
fosforilación de FMNL2 dependiente de CDK1 en S1016, los complejos de
adhesión periférica aumentaron en el área durante S (Fig. 3 F y S3, B y D), lo
que sugiere que la estimulación del área del complejo de adhesión en la fase
S se produce a través de FMNL2 independiente Vías pero no fueron
desmontadas posteriormente en G2. Juntos, estos datos demuestran que
FMNL2 es un nuevo sustrato de interfase de CDK1 involucrado en el
mantenimiento de las fibras de estrés transcelular y los complejos de
adhesión durante S y la facilitación de cambios en la adhesión dependientes
del ciclo celular después de la modulación de la actividad de CDK1 y la
subsiguiente disminución en la fosforilación de FMNL2 S1016.
Los niveles de ciclina B1 regulan la actividad de CDK1 para controlar el
desmontaje del complejo de adhesión en G2
La regulación de la actividad de CDK1 durante el ciclo celular es
principalmente
mediada por la formación de complejos con las ciclinas A2 y B1 (Gong y
Ferrell, 2010). El evento molecular clave asociado con G2 es el aumento de
la expresión de ciclina B1 cuando se asocia con CDK1 en preparación para la
entrada en la mitosis. Durante G2, la actividad de la ciclina B1-CDK1 es
fuertemente inhibida por la fosforilación de CDK1 en Y15 por Wee1 para
prevenir la entrada prematura a la mitosis (Gould y Nurse, 1989; Parker y
Piwnica-Worms, 1992). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la
reducción en los complejos de adhesión observada durante G2 podría estar
coordinada con la inducción de la expresión de ciclina B1 y la inactivación
posterior de CDK1. De hecho, una mayor proporción de CDK1 se asoció tanto
con la ciclina A2 como con la ciclina B1 en G2 en relación con la observada
en S (Fig. S4, A y B). Los niveles de tirosina-15-CDK1 fosforilada asociada con
cada ciclina también aumentaron en G2 (Fig. S4, A y B), y CDK1, ciclina B1,
ciclina A2 y Wee1 se observaron en la fracción citosólica de células en G2
(Fig. S4 C), que demuestra que G2 se asocia con una inactivación de CDK1 en
el citosol después de una mayor asociación con ciclina B1 y ciclina A2 y
fosforilación inhibitoria por Wee1. La eliminación mediada por RNAi de la
ciclina B1, pero no la ciclina B2 estrechamente relacionada, anuló la
capacidad de las células para desmontar complejos de adhesión en G2 (Fig.
4, A y B; y Fig. S4, E – H), lo que sugiere que los niveles aumentados de ciclina
B1 se requieren para desactivar CDK1 y promover el desensamble del
complejo de adhesión en G2.
Para determinar si la pérdida de complejos de adhesión en G2 fue
una consecuencia de la acumulación de la inhibición de la actividad de CDK1
dependiente de Wee1, el tratamiento a corto plazo de las células en G1, S y
G2 con MK1775, un inhibidor de Wee1 que reduce la fosforilación de la
tirosina-15 de CDK1 (Fig. 4 C) y por lo tanto Se utilizaron complejos de CDK1-
ciclina hiperactivos (Gheghiani et al., 2017). La hiperactivación de los
complejos CDK1-ciclina en G2 produjo un aumento en el área del complejo
de adhesión (Fig. 4 C), mientras que el tratamiento de las células en G1 y S
no provocó ningún cambio (Fig. 4 C). Esto sugiere que la reducción del área
del complejo de adhesión observada en G2 es una consecuencia de la
formación de complejos inactivos CDK1-ciclina en esta fase. Consistente con
las observaciones realizadas en células asíncronas (Fig. 2 H), la caída de la
ciclina A2 resultó en una reducción en el área del complejo de adhesión en
las células S, lo que sugiere un papel para la ciclina A2-CDK1 en la promoción
de la formación del complejo de adhesión (Fig. 4 E) Durante esta fase del
ciclo celular. Además, la hiperactivación de la ciclina B1-CDK1 sola (después
de la eliminación de la RNAi de la ciclina A2) no pudo promover la formación
del complejo de adhesión en G2 (Fig. 4 E), lo que indica que la ciclina B1-
CDK1 no puede regular los complejos de adhesión de la misma manera que
ciclina A2-CDK1 y que los dos complejos tienen efectos opuestos en el área
del complejo de adhesión. Por lo tanto, estos datos demuestran que el
evento clave que ocurre en G2 para desencadenar la pérdida de complejos
de adhesión y, por lo tanto, cebar las células para una rápida entrada en la
mitosis es el aumento de los niveles de expresión de la ciclina B1. De hecho,
la alteración de los niveles de ciclina B1 en células mediante la
sobreexpresión de ciclina B1 no degradable (Clute and Pines, 1999) en
células asíncronas o en células sincronizadas en S resultó en una pérdida de
complejos de adhesión similares a los observados en G2 (Fig. S4, I – L), que
demuestra el papel clave de los niveles de ciclina B1 para facilitar el
desmontaje del complejo de adhesión. Además, el tratamiento de células
asíncronas que expresan ciclina B1 no degradable con MK1775 rescató la
disminución observada en la formación del complejo de adhesión, sin tener
un efecto sobre las células de control (Fig. S4 J), lo que demuestra que la
reducción en el área del complejo de adhesión asociada con la
sobreexpresión de ciclina B1 se produce como resultado de un aumento de
la fosforilación dependiente de Wee1 y la inactivación de CDK1. Consistente
con un papel clave para la ciclina B1 en la regulación de la entrada mitótica
(Jackman et al., 2003; Krämer et al., 2004; Soni et al., 2008; Gavet and Pines,
2010a, b; Gong and Ferrell, 2010), knockdown la ciclina B1 dio como
resultado una disminución significativa en el número de células que se
redondeaban hasta la división (Fig. 4 F) junto con una disminución pequeña
pero significativa en la capacidad de las células mitóticas para experimentar
una división exitosa (Fig. 4 G). Durante la mitosis, las células experimentan
un cambio de forma importante caracterizado por el redondeo celular y la
formación de una red de actina cortical rígida (Stewart et al., 2011;
Ramanathan et al., 2015). Este cambio de forma está mediado por varios
factores que incluyen una mayor actividad de RhoA impulsada por Ect2
(Matthews et al., 2012), inhibición de Rap1 (Dao et al.

al., 2009), desmontaje del complejo de adhesión (Dao et al., 2009) y

aumento de la presión osmótica (Stewart et al., 2011). Después de la caída
de la ciclina B1, las células mitóticas no pudieron redondearse hasta el
mismo grado que las células de control (Fig. 4 H), lo que demuestra un papel
clave para la ciclina B1 en la mediación de los cambios morfológicos que
ocurren durante el redondeo de las células mitóticas.
Para explorar más a fondo el papel de los niveles de ciclina B1 en la
promoción de la reducción en el área del complejo de adhesión, las células
asíncronas se marcaron por pulsos con 5-etileno-2-desoxiuridina (EDU)
durante 30 minutos para identificar las células en S y se fijaron y se tiñeron
para la ciclina B1 y pax-illin (Fig. 5 A), y luego se cuantifica el área del
complejo de adhesión. Este enfoque permitió la identificación de células en
G1 (EDU y ciclina B1 negativa), S (EDU positiva y ciclina B1 negativa) y G2
(ciclina B1 positiva) y demostró que es consistente con las células
sincronizadas (Fig. 1, A y B) y células que sobreexpresan GFP-paxilina y
mTurq2-SLBP (Fig. 1, D – F), el área del complejo de adhesión se incrementó
en las células S positivas para EDU y que las células G2 positivas para ciclina
B1 tuvieron un área de complejo de adhesión reducida posteriormente (Fig.
5 B). Por lo tanto, los niveles de ciclina B1 se pueden usar dentro de una
población asíncrona para identificar células en G2 y como un indicador de
células con un área de complejo de adhesión reducida.
Discusión
En resumen, nuestros hallazgos principales identifican una asociación íntima
entre la maquinaria del ciclo celular y la adhesión celular al definir
(A) cambios dependientes del ciclo celular en el área del complejo de
adhesión, (B) un papel no mitótico para CDK1 en la regulación de los
complejos de adhesión célula-matriz en parte a través de la fosforilación de
la forma FMNL2, y (C) un mecanismo por el cual esta actividad puede ser
desconectado en forma de ciclo celular coordinado a través del aumento de
la expresión de ciclina B1 en G2. Por lo tanto, estas ideas explican cómo la
regulación de la actividad de CDK1 produce la modificación de los complejos
de adhesión y el citoesqueleto a medida que las células progresan a lo largo
del ciclo celular.
La regulación de la composición del complejo de adhesión y la rotación hasta
la fecha se ha centrado en gran medida en la migración de células o células
que se propagan a proteínas de matriz. En este estudio, hemos descrito un
nuevo aspecto de la regulación del complejo de adhesión que se centra en
la progresión del ciclo celular. El área del complejo de adhesión celular
aumenta a medida que las células pasan de G1 a S y, posteriormente,
disminuye a medida que las células ingresan a G2. Estos cambios están
respaldados por observaciones recientes de que las fuerzas contráctiles
celulares siguen la misma tendencia a través del ciclo celular (Vianay et al.,
2018) y, por lo tanto, sugieren una regulación de adherencia dependiente
del ciclo celular concertado. Un regulador central de este proceso es CDK1
porque la rotación de CDK1 produce una pérdida de cambios de adhesión
dependientes del ciclo celular. Los sustratos CDK1 incluyen reguladores de
la actina (Yamashiro et al., 1991, 2001; Kuilman et al., 2015; Ramanathan et
al., 2015), filamento intermedio (Chou et al., 1990; Yamaguchi et al., 2005) y
redes de tubulina (Andersen et al., 1997; Liakopoulos et al., 2003) junto con
reguladores de Rho GTPasas (Birkenfeld et al., 2007; Matthews et al., 2012;
Whalley et al., 2015; Helms et al., 2016). La regulación de estas vías puede
permitir que CDK1 facilite los cambios significativos en la morfología celular
y la reutilización de los polímeros del citoesqueleto que se requieren para
que ocurra la mitosis, pero en gran parte se han relacionado con la
regulación de los complejos de adhesión durante la interfase. Un análisis
fosfoprotómico previo de los componentes del complejo de adhesión
identificó un gran número de sustratos CDK potenciales (Robertson et al.,
2015), lo que sugiere un papel fundamental para CDK1 en la regulación de
complejos de adhesión en interfase a través de múltiples vías que aún no se
han dilucidado. Este papel es distinto de la inducción de la mitosis asociada
con la ciclina B-CDK1 porque la caída de la ciclina B1 no tuvo un impacto en
la formación del complejo de adhesión. Los datos presentados en este
estudio sugieren que la ciclina A2 es necesaria para la regulación
dependiente de CDK1 de los complejos de adhesión en la interfase; por lo
tanto, pueden existir sustratos específicos de ciclina A2-CDK1 adicionales
involucrados en la regulación de complejos de adhesión. En el futuro, sería
instructivo determinar si los reguladores adicionales de la actividad de CDK1
como las proteínas CKS (Krishnan et al., 2010) o los nuevos socios de unión
de CDK1 actúan para promover su actividad y función en la interfase.
Por lo tanto, la modificación de la actividad de CDK1 no solo puede influir
Aza el potencial proliferativo de las células, pero también podría tener un
impacto sobre otros procesos dependientes de la adhesión, como la
migración y la invasión celular. En apoyo de esto, recientemente se ha
demostrado que la actividad de CDK1 funciona en sentido descendente de
la proteína tirosina fosfatasa LAR para regular la formación de complejos de
adhesión en fibroblastos embrionarios de ratón estimulados con el factor de
crecimiento derivado de la placa (Sarhan et al., 2016), y la expresión de CDK1
es necesaria para la estimulación dependiente de integrina αvβ3 de la
migración de células de cáncer de próstata (Manes et al., 2003). Por lo tanto,
se requiere una investigación adicional de este nuevo papel no mitótico para
CDK1 en la regulación de complejos de adhesión y el citoesqueleto. El
redondeo de células mitóticas permite un posicionamiento preciso del huso
y la separación de cromosomas (Carreno et al., 2008; Kunda et al., 2008;
Kunda and Baum, 2009; Lancaster et al., 2013). De acuerdo con las
observaciones anteriores, hemos demostrado que la prevención del
desmontaje del complejo de adhesión perturba la mitosis (Dao et al., 2009;
Lancaster et al., 2013; Marchesi et al., 2014). Varias proteínas que los
complejos de adhesión regulados también son necesarios para una división
celular eficiente; por ejemplo, los Rho-GEF LARG y GEF-H1 median la fuerza
mecánica en los complejos de adhesión (Guilluy et al., 2011), pero también
son necesarios para una mitosis eficiente (Birkenfeld et al., 2007; Helms et
al., 2016) y la activación de Rho y la promoción de la contractilidad
dependiente de la miosina son necesarias para que se produzcan tanto el
redondeo de células mitóticas como la citocinesis (Maddox y Burridge, 2003;
Glotzer, 2005; Matthews y otros, 2012; Breznau y otros, 2015). Además, se
requiere la actividad de la formina para mantener la actina cortical en las
células mitóticas (Ramanathan et al., 2015). Es lógico, por lo tanto, que esta
maquinaria reguladora deba reciclarse y redistribuirse para que no
promueva complejos de adhesión y fibras de estrés de actina para su
reutilización durante la división celular. Nuestros hallazgos muestran que el
desmontaje de los complejos de adhesión y la modificación del citoesqueleto
comienza en G2, antes de la retracción celular y el redondeo. Esto se
demuestra en la formación de complejos de adhesión periféricos y un
cambio a una distribución de actina más cortical y prepara la célula para el
rápido redondeo requerido una vez que se haya pasado el punto de control
G2 / M. Estos hallazgos sugieren que la modulación de los complejos de
adhesión y el citoesqueleto representa un proceso clave que ocurre en G2
en preparación para una mitosis eficiente. Debido a que el desmontaje del
complejo de adhesión dependiente de G2 resulta en una pérdida de división
celular precisa, especulamos que esto puede ayudar a explicar cómo los
cambios en el microentorno del tejido que influyen en el citoesqueleto de
actina y la formación y señalización de complejos de adhesión, como el
elevado La rigidez de la ECM que caracteriza a muchos carcinomas
(Faurobert et al., 2015) contribuye a la aneu- ploidía y la progresión tumoral.
En este estudio hemos identificado el formin FMNL2 como una novela.
Sustrato para CDK1 que desempeña un papel en el mantenimiento de los
complejos de adhesión y facilita los cambios dependientes del ciclo celular
en los complejos de adhesión. El derribo de FMNL2 o la expresión de un
mutante S1016A no fosforilable dio lugar a la pérdida de complejos de
adhesión y fibras de estrés dentro del cuerpo celular, manteniéndose las
estructuras periféricas. Esto es consistente con el papel de FMNL2 en la
promoción del alargamiento de las redes de actina ramificadas Arp2 / 3
(Block et al., 2012) y la formación de fibra de estrés transcelular (Péladeau
et al., 2016). Se ha demostrado previamente que FMNL2 se acumula en el
borde de los lamelipodios y en las puntas de los filopodios en las células
migratorias de melanoma B16 (Block et al., 2012; Kage et al., 2017), donde
junto con FMNL3 regula la actina fila. - formación de mentir a lo largo de los
lamelipodios que sobresalen (Block et al., 2012; Kage et al., 2017). Sin
embargo, queda por determinar cómo influye FMNL2 en la formación de
complejos de adhesión. FMNL2 puede desempeñar un papel directo en la
formación de fibras de estrés asociadas con complejos de adhesión;
alternativamente, puede proporcionar el marco transcelular a partir del cual
se forman posteriormente las fibras de esfuerzo dorsal y ventral junto con
las adherencias focales (Hotulainen y Lappalainen, 2006). Esta alternativa es
consistente con la observación de que el crecimiento del complejo de
adhesión puede ocurrir en ausencia de FMNL2 durante la fase S, lo que
sugiere que FMNL2 no es directamente responsable del crecimiento del
complejo de adhesión en la fase S, pero en su ausencia, la localización de los
complejos de adhesión se altera debido a Cambios en la red de actina
existente. La forma en que FMNL2 media la dinámica de la actina durante la
progresión del ciclo celular y cómo esto influye en la formación del complejo
de adhesión formará la base de futuros estudios. Además, aún queda por
determinar cómo la fosforilación de FMNL2 en S1016 modula su actividad y
el papel de esta fosforilación en la regulación de la dinámica de la actina
durante la progresión y migración del ciclo celular. Se demostró previamente
que la fosforilación de FMNL2 en S1072 por PKC es necesaria para la
translocación de FMNL2 en asociación con la integrina β1 de la membrana
plasmática a las vesículas intracelulares (Wang et al., 2015). Por lo tanto, es
posible que se produzcan conversaciones cruzadas entre estos sitios de
fosforilación que regulan el tráfico de integrinas y, posteriormente, la
localización y la rotación de complejos de adhesión. La fosforilación de
FMNL2 en S1016 se ha identificado en análisis fosfoprotómicos a gran escala
de células mitóticas e interfásicas (Dephoure et al., 2008; Olsen et al., 2010).
Además de nuestra observación de que la ciclina B1-CDK1 purificada es
capaz de fosforilar FMNL2 S1016, esto sugiere que la FMNL2 también puede
estar fosforilada en mitosis por ciclina B1-CDK1. Dado que las forminas se
han relacionado con el mantenimiento de la actina cortical en las células
mitóticas (Ramanathan et al., 2015) y la citocinesis (Bohnert et al., 2013), un
posible papel mitótico para FMNL2 justifica una investigación más a fondo y
potencialmente proporciona un buen ejemplo de una proteína adicional que
desempeña un doble papel en la regulación de los complejos de adhesión
durante la interfase y el citoesqueleto durante la mitosis.
Los niveles de ciclina B1 y la cantidad de CDK1 asociada con ambos la ciclina
B1 y la ciclina A2 aumentaron a medida que las células ingresaban a G2 (Figs.
S1 y S4, A y B). Durante G2, los complejos de ciclina-CDK1 se mantienen en
un estado inactivado a través de la fosforilación en Y15 por Wee1 (Gould y
Nurse, 1989; Parker y Piwnica-Worms, 1992). Esta acumulación de
complejos inactivos ciclina-CDK1 proporciona un medio simple para reducir
la actividad de mantenimiento de la adhesión compleja de CDK1 en un golpe
y actúa como un interruptor temporal para desencadenar la pérdida de
complejos de adhesión coordinados con la entrada en G2. El evento clave
que impulsa la pérdida de complejos de adhesión en G2 es el aumento en
los niveles de ciclina B1 y esto, junto con las observaciones recientes de que
la localización citoplasmática de ciclina B1-CDK1 inactiva determina la
longitud de G2 y se requiere para prevenir la prematura entrada a la mitosis
(Strauss et al., 2018), demuestra un papel de la ciclina B1-CDK1 inactiva
citoplasmática en la coordinación de los cambios celulares en G2. Aunque se
sabe mucho sobre los eventos de señalización que facilitan la activación de
la ciclina B1-CDK1 y la entrada en la mitosis, se sabe muy poco acerca de los
eventos de señalización que marcan la transición de S a G2. Esto merece un
trabajo adicional ya que quedan varias preguntas. Por ejemplo, ¿cómo
influye el aumento de ciclina B1 en la actividad de Wee1 o Myt1, y cómo se
determina la expresión, actividad o localización subcelular de la miríada de
otros reguladores del ciclo celular y del citoesqueleto por la ciclina B1?