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ARTÍCULO ORIGINAL
Recibido: 12 Junio 2015 / Aceptado: 3 Octubre 2015 / Publicado en línea: 13 Febrero el año 2016
El autor (s) de 2016. En este artículo se publica con acceso abierto al Springerlink.com
Resumen Las proteasas alcalinas son enzimas importantes en muchas aplicaciones Se encontró serina proteasa ser significativamente estables en presencia de
industriales, especialmente como aditivos en la industria de los detergentes de diversos tensioactivos y H 2 O 2. Además, era satisfactoriamente capaz de eliminar las
lavandería. Aunque hay una serie de manchas de sangre cuando se utiliza como un aditivo junto con detergente
Bacilo especies que se informó de que la producción de proteasas, la comercial que sugiere su potencial aplicación en la industria de detergentes de
deficiencia ef de una proteasa producida por una nueva cepa tiene que ser lavandería.
estudiado en comparación con los otros. Por lo tanto, en este estudio, una
proteasa de serina alcalina producida por una nueva especie Bacillus Palabras clave industria de los detergentes Ensayo de Proteasa de aplicaciones de
1 Laboratorio de Ecología Microbiana, Departamento de Bioquímica, y procesos como el tratamiento de residuos, la recuperación de plata y la
Mahatma Gandhi Universidad, Anneparthy, Yellareddygudem (PO), resolución de mezclas de aminoácidos (Agarwal et al. 2004 ).
Nalgonda 508254, Telangana, India
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Bacilo especies son especí fi cos productores de proteasa extracelular. la temperatura, periodo de fermentación y sus efectos individuales fueron
Varias proteasas alcalinas han sido purifica y caracterizado de muchos Bacilo monitoreados. El sobrenadante libre de células se recuperó por
cepas (Rao et al. 1998 ). La subtilisina Carlsberg producido por Bacillus centrifugación a 10.000 rpm durante 10 min a 4 C y se utiliza para
liceniformis determinar la actividad proteasa extracelular.
(Jacobs et al. 1985 ) Y subtilisina Novo producido por
Bacillus amyloliquefaciens ( Wells et al. 1983 ) Han sido las enzimas de Para el cribado signi fi cativas las variables que afectan la producción de
elección para las industrias de detergentes. Estas enzimas presentan una proteasas por Bacillus caseinilyticus, varios de carbono (1% w / v; glucosa,
actividad máxima a valores de pH alcalinos que van desde 8 a 10 (Horikoshi 1999sacarosa, lactosa, fructosa y maltosa), nitrógeno (1% w / v; cloruro de amonio,
). Generalmente, las proteasas alcalinas para aplicaciones detergentes extracto de malta, extracto de levadura, peptona y leche descremada)
deben ser activos a temperatura superior a 40-50 C y el pH en el intervalo de sustratos, cloruros metálicos (CaCl 2, MgCl 2, ZnCl 2, FeCl 2 y CuCl 2) a una
9-12 (Sellami-Kamoun et al. 2008 ; Hadder et al. concentración de 5 mM, el tiempo de incubación (24, 48, 74, 98 y 120 h),
temperatura (20, 30, 37, 40, 50, 60 y 70 C) y pH (6, 7,
2009 ).
El proceso de purificación también aumenta las actividades fi 8, 9, 10, 10.5 y 12) fueron probados por la estrategia de un factor-a-una vez. Los
específicos de enzimas, haciéndolos más específico para aplicaciones controles se preparan simultáneamente para comparar los datos de las pruebas sin la
industriales. En el presente estudio, informe puri fi cación y caracterización adición de cualquier carbono, fuentes de nitrógeno o cloruros metálicos.
Una novela Bacillu s cepa SP T se aisló del lago Lonar alcalina, situada en
Buldhana, Maharashtra, India. La caracterización detallada taxonómica y
identificación de esta cepa propuesto como una nueva especie, Bacillus la estimación de proteínas
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se recogió por centrifugación a 10.000 9 sol durante 15 min, que se disolvió Determinación de la concentración por valoración de sitios activos
tampones utilizados fueron: (0,05 M) de fosfato (pH 6-7), Tris-HCl (pH 8-9) y la proteasa
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Aplicación de proteasa purificada en la eliminación de manchas de sangre La purificación y la espectroscopia de péptido masa de
proteasa alcalina
Aplicación de la proteasa purificada como un aditivo de detergente en la eliminación de Después de la producción de la enzima, se precipitó de manera óptima usando
manchas de sangre se estudió en piezas de tela de algodón blanco (10 cm 9 10 cm) sulfato de amonio a nivel de saturación de 60%. La saturación de sulfato de
manchadas con sangre y secado al horno a 95-100 C durante 5 min. Las piezas de tela amonio aumentó la puri proteína fi cación 1,65 veces con recuperación de 60%;
manchadas fueron tomadas en bandejas separadas. Los siguientes conjuntos se más adelante enzima se purificó por el método de diálisis. La muestra dializada
prepararon y se estudiaron: fue más purificó por cromatografía en columna de celulosa DEAE. La
purificación de la proteína usando la cromatografía de columna de celulosa
DEAE incrementó la pureza de la proteína por 20,74 veces en comparación
(A) la bandeja con agua destilada (100 ml)? manchado de sangre
con precipitación con sulfato de amonio y diálisis (Tabla 2 ). la actividad de c
tela? 1 ml de detergente comercial (Surf Excel5 mg / ml)? 2 ml de
especificidad de puri proteína fi ed fue 89,2 U / mg. pureza de la enzima fue
enzima purificado. (B) la bandeja con agua destilada (100 ml)? manchado
confirmada por SDS-PAGE con la ayuda de Ejecución marcador de proteína
de sangre
estándar contra la muestra de ensayo. Se encontró que el peso molecular de la
tela? 1 ml de detergente comercial (Surf Excel5 mg / ml).
proteína a ser 66 kDa (Fig. 1 ). Una proteasa 34 kDa serina de B. pumilus CBS, y
un 35 kDa manganesedependent serina proteasa alcalina de B. pumilus TMS55
(C) el pedazo de tela no tratada manchado de sangre era conside-
se ha informado anteriormente (Jaouadi et al. 2008 ; Ibrahim et al. 2011 ). Por
Ered como control.
otra parte, también se informó de un 38 kDa disolvente orgánico y detergente
(D) la bandeja con agua destilada (100 ml)? manchado de sangre
proteasa estable a partir de Bacilo
tela? 2 ml de enzima purificado. (E) la bandeja con agua destilada (100
ml)? manchado de sangre
paño.
Las bandejas se incubaron a 50 C durante 30 min. Las piezas de tela fueron sp. RKY3 (Reddy et al. 2008 ). El peso molecular de la enzima aislada
sacados de cada conjunto a intervalos regulares de 5 min, se enjuagó con agua, se estaba en el intervalo de algunos reportado Bacilo
secaron y se examinaron visualmente. proteasas.
La toma de huellas digitales péptido masa fi (PMF) de la proteína después de
la digestión con tripsina produjo ocho prominente m / z picos (Fig. 2 ). los m / z valores
Resultados y discusión correspondientes a 1958,2,
1324,6 y 1308,9 Se identificaron como péptidos con secuencias
La optimización de las condiciones de cultivo y medios de comunicación para LEAAPVMFPERPAYPDR, GVAPDAEIYAYR y LIGETIADFSSR,
la producción de proteasa: de un factor-a la vez respectivamente. Estos péptidos fueron similares a peptidasa S8 y S53
subtilisina de Bacillus cellulosilyticus.
El organismo fue capaz de producir la proteasa a un intervalo de pH de 7,0 a 10,0
(producción óptima a pH 9,0) y en un rango de temperatura de 30-60 C
(producción óptima a 37 DO). Entre las fuentes de carbono ensayadas, fructosa Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad de la proteasa alcalina y la
mostró más capacidad de producción, seguido de sacarosa. Entre las diferentes estabilidad
2y CuCl 2 tuvo un efecto mínimo. Aumento de la producción mejorada de la proteasa y era estable a pH 6,5-9 (Mane y Bapat 2001 ). La proteasa de B. subtilis VSG-4
tiempo de incubación hasta 48 h. reportado
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tabla 1 Efecto del periodo de fermentación, pH, temperatura, fuentes de carbono, fuentes de a 10 con la actividad máxima a pH 8 (Farhadian et al.
nitrógeno y cloruros metálicos sobre la producción de serina proteasa alcalina de Bacillus 2015 ). Del mismo modo, una bacteria halófilas aislado a partir de agua de mar
caseinilyticus
reacciones catalizadas en el intervalo de pH 8-11 y se realizó de forma óptima a
período de fermentación (h) La concentración de proteína (mg / pH 10 (Raval et al. 2014 ). Enzima aislada en este estudio era más estable a pH 8
ml)
en presencia de CaCl 10 mM 2 ( Higo. 3 ).
26 39.30 ± 2.5
Efecto de diferentes temperaturas mostró que la enzima era activo en estas
48 42.67 ± 3.5
temperaturas variadas, sin embargo, se descubrió que la temperatura óptima
74 34.65 ± 4.0
para ser 60 C ( PAG segundo 0.1) que soporta la naturaleza termotolerantes de
98 28.76 ± 2.8
la enzima. La máxima actividad proteolítica de Bacilo cepas de HR-08 y
120 24.35 ± 2.1
KR-8102 aislado del suelo de la parte oeste y norte de Irán se han registrado a
pH 6
los 65 y 50 C, respectivamente (Moradian et al.
0
7 29.30 ± 3.5
2006 ). Una proteasa de serina por B. subtilis DR8806 mostró la actividad
8 33.67 ± 2.5
más alta en 45 C y resistió a la temperatura hasta 70 C (Farhadian et al. 2015
9 49.76 ± 1.5
). Cha et al. ( 2005 ) Informó que la proteasa de Bacilo sp. SS103 era activo
10 28.16 ± 2.6
en 37 C y la proteasa alcalina de B. subtilis VSG-4 que previamente
10.5 0
reportados por Giri et al. ( 2011 ) Era activo en un rango de temperatura de
12 0
40 a 60 C con una temperatura óptima a 50 C. Además, Huang et al.
Temperatura ( C) 20
purifica una proteasa alcalina que tenía una actividad máxima a 55 C
0
(Huang et al. 2003 ).
30 39.10 ± 2.5
37 49.99 ± 3.5
40 39.76 ± 1.5
En el presente estudio, la actividad enzimática aumenta gradualmente desde
50 28.16 ± 2.9
la temperatura de 30-60 C, pero, después de 60 C, mostró disminución de la
60 20.22 ± 1.8
actividad. Sin embargo, la presencia de CaCl 10 mM 2 disminución de la actividad
70 0
que en cierta medida. Enzyme retenido actividades enzimáticas residuales
Las fuentes de carbono
alrededor de 98% a 60 C en presencia de CaCl 10 mM 2 ( PAG segundo 0.1) (Fig. 4
glucosa 33.55 ± 1.9 ). El sitio de titulación activo de la enzima con PNPGB determinó la
sacarosa 42.66 ± 1.8 concentración de la enzima para ser 15,0 l m (basado en OD mide), con 40%
Lactosa 39.16 ± 1.8 sitios activos.
Fructosa 48.16 ± 1.9
Las fuentes de nitrógeno cloruro Efecto de los inhibidores y los iones metálicos sobre la actividad enzimática
de amonio 0
Extracto de levadura 31.19 ± 1.2 La proteasa alcalina probado era casi sin perturbaciones en presencia de
peptona 39.19 ± 1.0 EDTA que muestra un aumento de la actividad relativa de 96%, y menos
Leche desnatada 47.92 ± 2.1 actividad (30%) en presencia de Na 2 ?.
Cloruros de metales Los resultados (Tabla 3 ) También mostró que la enzima se inhibió
CaCl 2 42.35 ± 2.1 completamente por el inhibidor de serina proteasa (PMSF) en ambos 5 y 10
MgCl 2 42.55 ± 3.9 concentraciones mM, lo que sugiere su naturaleza serina (Adinarayana et al. 2003
ZnCl 2 39.77 ± 2.8 ). Entre los iones metálicos controladas sobre la actividad enzimática, Ca 2? y Mg 2? iones
FeCl 2 38.68 ± 2.9 aumento de la actividad relativa de hasta 82 y 85%, respectivamente. Una
CuCl 2 31.29 ± 1.8 proteasa de serina de Bacillus subtilis DR8806 fue estimulada por K ?, Ca 2 ?, mg 2? y
Control (único medio basal) 12.45 ± 3.7 Fe 2? a una concentración de 10 mM hasta 134, 129, 128 y 112%,
respectivamente. Considerando que, Na? iones no tuvieron ningún efecto
Todos los resultados se presentan como media ± SD 3 Biotech
significativo sobre la actividad enzimática (Farhadian et al. 2015 ). actividad de
metal y la disminución en la presencia de Co 2 ?, Ni 2? fue observado por Farhadian
por Giri et al. ( 2011 ) Tenía la actividad máxima a pH 9 con una fuerte et al. ( 2015 ), Shah et al. ( 2010 ), Priya et al. ( 2014 ), Ibrahim et al. ( 2011 ) Y Jain et
disminución de la actividad en valores de pH inferiores a pH al. ( 2012 ). Por el contrario, nuestros resultados
9. Un extracelular hrtA-como serina proteasa por B. subtilis
DR8806 exhibió una alta actividad en el intervalo de pH de 5
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Tabla 2 Resumen de la purificación de proteasa de serina alcalina producida por Bacillus caseinilyticus
método fi cación Puri La actividad total (U) La proteína total la actividad de c Puri pliegue fi Rendimiento
2007 ).
Varios sustratos se ensayaron para estudiar la actividad de la proteasa
alcalina. Entre caseína, albúmina de suero bovino, gelatina y albúmina de Efecto de diferentes tensioactivos y el agente oxidante en la actividad
huevo, proteasa mostró alta actividad (94%) en caseína (Tabla 3 ). Sin de la proteasa alcalina
embargo, la enzima podría hidrolizar varias otras proteínas como BSA,
gelatina y albúmina de huevo, que es una característica importante de esta Un buen proteasa detergente debe ser compatible y estable con todos los
proteasa alcalina. Adinarayana et al. ( 2003 ) Informaron hallazgo similar que compuestos detergentes comúnmente utilizados, tales como, tensioactivos,
la caseína era un buen sustrato para la proteasa producida por B. subtilis. Nuestroblanqueadores, agentes oxidantes y otros aditivos que pueden estar presentes
resultado estaba en consonancia con hallazgo de Dubey et al. ( 2006 ) Que en la formulación (Gupta et al. 2005 ). Por lo tanto diferentes tensioactivos y
mostró caseína era el sustrato más preferible. Se habían demostrado la agente oxidante en diferentes concentraciones se ensayaron para determinar
actividad en presencia de gluten de trigo fue sólo el 20%, en comparación su efecto sobre la actividad de la proteasa alcalina. Entre el probado (Tween
con la caseína. Además, proteasas producidas por B. halodurans 373 cas6 20, SDS y H 2 O 2), H 2 O 2 estaba mostrando muy menos efecto sobre la actividad
(Annamalai et al. 2013 ), B. cereus de la proteasa alcalina que muestra una actividad relativa de hasta el 91 y el
86% después del tratamiento con 0,5 y 1% H 2 O 2, respectivamente (Tabla 4 ).
En un informe similar, Joo et al. ( 2003 ) reportó que Bacillus clausii 1-52
TKU006 (Wang et al. 2009 ) y B. subtilis DR8806 (Farhadian et al. 2015 ) proteasa exhibido actividad relativa de hasta
Mostraron la mayoría de la actividad hacia la caseína como sustrato.
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Fig. 3 Efecto del pH sobre la actividad y la estabilidad de la proteasa de serina alcalina de Bacillus Fig. 4 Efecto de la temperatura sobre la actividad y la estabilidad de la proteasa alcalina de Bacillus
caseinilyticus caseinilyticus
114% después del tratamiento con 1% de H 2 O 2. La proteasa producida a Aplicación de proteasa purificada en la eliminación de manchas de sangre
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PMSF 0
EDTA 96 ± 3.9
CuCl 2 44 ± 4.1
ZnCl 2 78 ± 2.1
MgCl 2 85 ± 4.0
NaCl 30 ± 2.7
CaCl 2 82 ± 3.6
FeCl 2 54 ± 3.9
CoCl 2 62 ± 2.1
NiCl 2 58 ± 4.2
Caseína 94 ± 2.5
Fig. 5 Aplicación de la proteasa purificada de Bacillus caseinilyticus en la eliminación de manchas
Albúmina de suero bovino 40 ± 4.1
de sangre. UNA Cloth lavó con proteasa (2 ml) más de surf sobresalir detergente (5 mg / ml), segundo
Gelatina 64 ± 3.7 paño lavó con olas sobresalir detergente (5 mg / ml) solo, do paño de control con mancha de
albúmina de huevo 85 ± 2.9 sangre re paño lavó con proteasa (2 ml) solo, mi tela se lavó con agua destilada estéril
Los tensioactivos / agentes oxidantes Concentración (%) Actividad relativa% temperaturas y rango de pH. La enzima también mostró su variada
estabilidad en presencia de diferentes inhibidores, iones metálicos, agentes
Tween 20 0.5 66 ± 3.9
tensioactivos, agente oxidante, disolventes polares polares, no y tenía la
1.0 42 ± 2.1
capacidad de hidrolizar diferentes sustratos que indican la posibilidad de
SDS 0.5 81 ± 2.9
explotación comercial de la serina proteasa alcalina en el detergente para la
1.0 55 ± 3.5 ropa industria.
H2 O2 0.5 91 ± 4.0
1.0 86 ± 2.6
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