Clase Teórica:

CULTIVOS PRIMARIOS: CONCEPTO Y TIPOS. ETAPAS EN EL

ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO PRIMARIO.
Docente: Dra. María Gabriela Mediavilla
mmediavi@fbioyf.unr.edu.ar o mediavilla@ibr-
conicet.gov.ar

CULTIVO PRIMARIO.
Concepto y tipos. Etapas en el establecimiento de un cultivo primario.

Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el

mantenimiento de las células in vitro, conservando al máximo sus propiedades
fisiológicas, bioquímicas y genéticas. En este sentido, los cultivos primarios suelen
considerarse los más semejantes al tejido de origen por tratarse de aquellos que se
establecen luego del aislamiento de explantos o células individuales y antes del primer
subcultivo/pasaje, utilizándose con preferencia a las líneas celulares cuando se buscan
condiciones experimentales más representativas del tejido in vivo.
Los cultivos primarios son obtenidos a partir de explantos o explantes (fragmento
escindido desde un órgano o tejido), por disgregación de tejidos y órganos o aislados de
fluidos orgánicos como la sangre.
La mayoría de los cultivos primarios mantienen la viabilidad por un periodo de tiempo
limitado, a excepción de algunos derivados de tumores. En general, después de dividirse
un cierto número de veces dejan de hacerlo y entran en senescencia; otros, en cambio,
no se dividen en cultivo. Cuando el cultivo a partir de tejidos u órganos se mantiene por un
periodo limitado de tiempo con reproducción de las células en cultivo, se habla de líneas
primarias (o líneas celulares finitas) y son ejemplos de las mismas los queratinocitos,
fibroblastos dérmicos, las células
endoteliales de cordón umbilical.
Ejemplos de células que

Evolución de un cultivo celular.

Cuando las células se ponen en cultivo
por primera vez a partir del tejido de
origen se habla de cultivo primario. Si
el tipo celular se divide en cultivo,
entonces a partir del primer subcultivo
o pasaje se denomina línea celular
finita que, en general, puede sufrir
unas 30-50 divisiones celulares o
generaciones. Si la línea celular sufre
una transformación en cultivo
(espontánea o inducida) o si se trata de
células derivadas de tumores que ya
son inmortales, la línea celular puede
crecer indefinidamente y se denomina línea celular continua.
no se dividen en cultivos son los hepatocitos obtenidos de hígado adulto y las neuronas.
Los cultivos primarios pueden volverse inmortales por transformación espontánea
(transformación en cultivo), o inducida químicamente o viralmente. que puede ser
inmortalizados mediante transfección del gen de la telomerasa.
Si el aislamiento de células para cultivo primario se realiza en condiciones de
esterilidad: usando instrumentos de cirugía, soluciones y demás elementos esterilizados,
y si se realiza en un campo quirúrgico aséptico (por ejemplo: sobre la mesada de un
equipo de flujo laminar horizontal) y limpiando correctamente el animal de origen con
soluciones desinfectantes (adultos, neonatos o feto); entonces, ese cultivo debería estar
libre de contaminaciones (bacterias, hongos, micoplasmas) ya que el medio interno de un
animal sano está libre de ellas. En este sentido, el cultivo primario se considera más
limpio que el cultivo de líneas celulares, que ha permanecido más tiempo en cultivo,
contrariamente a lo que se suele creer.

Diferencias entre cultivo Primario y cultivo de Líneas Celulares

Propiedad Células primarias Línea celular continua

Período de vida y Finita (limitada a un número Infinita
proliferación celular definido de divisiones celulares)
Consistencia Existe variabilidad entre Variabilidad mínima
tejidos/animales dadores y
también entre preparaciones
Integridad genética Mantienen la integridad genética Sujetas a deriva genética a medida
observada in vivo (tejido de origen) que se dividen (conjunto de
y, si se dividen, a través de las mutaciones no definidas)
duplicaciones celulares
Relevancia biológica Imitan mejor la fisiología de las
Puede perderse a medida que las
células in vivo células se dividen (relevancia algo
baja). Si derivan de tejidos
tumorales, ya tienen características
distintas (grado variable) de las del
tejido de origen.
Facilidad de uso Difícil o aún no encontrada en Existen protocolos y condiciones
(congelación- ciertos casos. Requiere condiciones bien establecidas.
descongelación) de cultivo optimizadas y manejo
cuidadoso
Tiempo y esfuerzo Requiere mayor tiempo y esfuerzo Menos tiempo, mayor abundancia
de uso de preparación. Menos cantidad de de células
células
Uso de animales Requiere uso de animales de En el peor de los casos un único
experimentación. Planificar los animal. Se puede decir que no
experimentos para minimizar el requiere uso de animales.
número de animales usados.
Nota: obsérvese que en la tabla hablo de células primarias y no cultivo primario ya que, éste último, se limita
exclusivamente al pasaje 0 (antes del primer pasaje) del cultivo y en la tabla se enumeran las características
de las células aisladas del tejido de origen, tanto las que no se dividen como las que sí pueden hacerlo.
 Aislamiento de células
A partir de un órgano, tejido, biopsia de un animal vivo con o sin sacrificio del mismo.
El primer paso para aislar células de un tejido es separar la matriz extracelular que
las une. Para lograrlo, existen diferentes técnicas para disgregar tejidos.
1- Técnicas que utilizan desagregación enzimática.
2- Técnicas mecánicas puras, con o sin alguna forma de maceración.
La disgregación enzimática da mejores resultados cuando hay mucha cantidad de
tejido y la disgregación mecánica funciona bien con tejidos blandos o algunos tejidos más
duros cuando la cantidad de células viables que se necesita no es tan importante.

Disgregación enzimática:

En tejidos, la adhesión célula-célula es mediada por la interacción entre una variedad

de glicopéptidos homotípicos (moléculas de adhesión o CAMs), algunos de los cuales son
dependientes de calcio y por lo tanto sensibles a agentes quelantes como el EDTA o
EGTA. Las integrinas, que se unen a sitios arginina-glicina-aspártico (RGD) en la matriz
extracelular, también tienen dominios de unión a calcio y son afectados por la depleción
de calcio. La matriz intercelular y la membrana basal contienen otras glicoproteínas, tales
como fibronectina y laminina, que son sensibles a proteasas, y proteoglicanos los cuales
son menos sensibles pero pueden a veces ser degradados por glicanasas, tales como
hialuronidasa o heparinasa. Lo más sencillo es proceder desde una simple solución de
disgregación a una solución más compleja, con tripsina sola o tripsina/EDTA como punto
de partida, agregando otras proteasas para mejorar la disgregación, y eliminar la tripsina
si es necesario para mejorar la viabilidad. En general, aumentar la pureza de una enzima
nos dará un mejor control y menor toxicidad con aumento en la especificidad, pero podría
resultar en menor disgregación.
La disgregación con tripsina puede dañar las células (por ejemplo, algunas células
epiteliales) o puede no ser efectiva (por ejemplo, para tejido muy fibroso como el tejido
conectivo fibroso), por lo que se ha desarrollado el uso de otras enzimas. Dado que la
matriz extracelular frecuentemente contiene colágeno, particularmente en tejido conectivo
y músculo, la colagenasa es una buena elección.
La técnica de disgregación con colagenasa, es una técnica muy simple y efectiva
para muchos tejidos (embrionario, adulto, normal y maligno). La colagenasa cruda es
usada frecuentemente y alguna de sus acciones va a depender de la contaminación con
otras proteasas no específicas. Hay disponibles colagenasas con alto grado de pureza, en
caso de querer evitar la actividad proteolítica no específica, pero ésta podría no ser tan
efectiva como la colagenasa cruda.
El aislamiento de algunas células requiere simplemente que el órgano/tejido de origen
sea reducidos a trozos pequeños por trituración con tijeras/bisturíes e incubados con
agitación en las soluciones enzimáticas a una temperatura determinada (frío, ambiente o
37 °C) con cosecha de células liberadas a distintos intervalos de tiempo. En cambio, el
aislamiento a partir de otros tejidos requiere perfusión del órgano entero (hígado/corazón)
con soluciones enzimáticas con posterior ruptura y disgregación mecánica suave sólo
para liberar las células ya separadas.

Disgregación mecánica:

Al haber un riesgo de daño proteolítico durante la digestión enzimática, muchas veces

conviene usar la técnica alternativa de disgregación mecánica, es decir, colectar las
células que se desprenden cuando el tejido es cuidadosamente cortado en láminas,
presionando el tejido diseccionado a través de una serie de tamices donde la malla se
reduce gradualmente en tamaño u obligando a los fragmentos de tejido a pasar través de
una jeringa o simplemente pipeteando repetidamente. Este procedimiento es más rápido
que la digestión enzimática, pero puede causar daños mecánicos. El raspado y tamizado
son probablemente los métodos mecánicos más suaves mientras que el pipeteado y, en
particular, el pasaje a través de una jeringa, son los que más probablemente generen
daño.

Usando cualquiera de las dos formas de disgregación se obtiene, a partir del tejido,
una suspensión celular generalmente conteniendo más de un tipo de células. Para
separar los diferentes tipos celulares de la suspensión celular se pueden utilizar varios
métodos, según sus propiedades:
- La diferencia de tamaño de las células permite separarlas por centrifugación.
- La capacidad que tienen algunos tipos celulares de adherirse al vidrio o al plástico,
permite separarlos de otras células que se adhieren débilmente.
- Recubriendo las superficies de cultivos con proteínas de adhesión que favorecen
el pegado de un tipo celular con respecto a los otros presentes en la mezcla.
- De la misma manera, el empleo de medios de cultivo selectivos que favorecen la
viabilidad/pegado/ proliferación del tipo celular de interés e inhibe a los otros tipos
celulares. Ejemplo: agregado ITES (Insulin, Transferrin, Epidermal growth factor,
Selenium) y dexametasona al medio de cultivo de hepatocitos primarios.
- Algunos anticuerpos se unen específicamente a sustancias presentes en
determinadas células. Luego, se emplean diferentes matrices (como colágeno,
bolitas de polisacáridos, plástico) a las cuales sólo las células reconocidas por los
anticuerpos podrán adherirse. Las células pueden, luego, recuperarse por
agitación o por tratamiento con tripsina que digiere las proteínas que median la
adhesión.
- Se emplean anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes para marcar células
específicas adheridas a ellos. Las células marcadas por interacción con el
anticuerpo pueden ser separadas de las no marcadas en un separador de células
activado por fluorescencia o cell sorter.

Una vez disgregado el tejido, y separadas las células, la mayoría de las células
obtenidas no están adaptadas para vivir en suspensión, y requieren una superficie sólida
en la cual crecer y dividirse. Para los cultivos primarios, en general se requiere recubrir el
soporte donde crecerán las células con sustancias tales como colágeno, fibronectina,
gelatina, poli-lisina. Además, pueden requerir del agregado de factores de crecimiento
(insulina, factores estimulantes de colonias, factor de crecimiento epidérmico, entre otros)
y mayores cantidades de suero que las líneas celulares establecidas.

Previamente a la siembra se realiza el recuento de las células:

Para resolver el problema de conteo celular, se ha optado, en algunos casos, por
calibrar sistemas espectrofotométricos, cuyo fundamento se basa en las propiedades de
absorción de la luz por parte de las células; sin embargo, tales sistemas son poco exactos
y los resultados que se obtienen son difíciles de repetir. Una alternativa a este problema
es el contar directamente el número de células presentes en un volumen conocido. Esto
puede resultar un gran trabajo considerando el tamaño de algunas células, sin embargo,
la cámara de Neubauer permite contar células de distintos tamaños de manera muy
práctica. También existen sistemas de conteo de células automáticos por medida de
resistencia eléctrica (Coulter counter), por citometría de flujo, o por análisis de imagen
(conteo sobre cámara tipo Neubauer).

Determinación de la viabilidad celular:

El método más comúnmente usado es el de exclusión de azul tripán. La incubación a

tiempos cortos (menores a 15 min) con azul tripán (0,2% en PBS) permite diferenciar por
recuento en cámara de Neubauer las células viables de las no viables ya que estas
últimas se tiñen de azul porque no son capaces de excluir el colorante. Esta técnica mide
la integridad de la membrana plasmática.

Separación de células viables y no viables:

Cuando un cultivo primario adherente se prepara de células disociadas, las células no

viables son sacadas en el primer cambio de medio. En los cultivos primarios mantenidos
en suspensión, las células no viables son gradualmente diluidas cuando comienza la
proliferación de células. Si es necesario, sin embargo, las células no viables pueden ser
sacadas del disgregado primario centrifugando las células en una mezcla de Ficoll y
metrizoato de sodio. Esta técnica es similar a la preparación de linfocitos de sangre
periférica. Las células viables se colectan de la interfase entre el medio y el
Ficoll/Metrizoate, y las células muertas quedan en el pellet al fondo del tubo.

Relevancia de los cultivos primarios sobre las líneas celulares continuas

1. Sistema modelo: ya que las células primarias son no-transformadas, son más
parecidas al tejido de origen (siempre que las condiciones de cultivo elegidas
mantengan esta similitud) y los resultados experimentales obtenidos se consideran
fisiológicamente más relevantes. Pueden ser usados como modelo de estudios de
biología celular y bioquímicos, interacciones entre las células y agentes causantes de
enfermedades (virus, bacterias, parásitos), efecto de drogas, procesos de
envejecimiento, señalización celular, regulación metabólica.
2. En muchos casos, el uso de cultivo primarios permite al investigador evitar las
complicaciones (disponibilidad, costos, ética) involucradas en el uso de modelos
animales. Puede consistir en una primera aproximación para pasar, luego y si no
pudiera evitarse, al modelo animal contando con antecedentes suficientes acerca de
la problemática en estudio de manera de reducir el número de animales
experimentales.
3. Investigación en cáncer: pueden exponerse a radiación, químicos y virus para
estudiar el desarrollo del cáncer (mecanismos y causas, alteración de rutas de
señalización). También puede determinarse la efectividad de drogas
anticancerígenas, así como, los efectos secundarios de los tratamientos
(quimioterapia, irradiación) sobre células normales.
4. Virología: modo de infección, detección, aislamiento, crecimiento y ciclos de
desarrollo de los virus.
5. Búsqueda y selección de drogas y estudios de toxicidad: citotoxicidad de nuevas
drogas (efecto y dosaje), cosméticos, químicos, carriers de drogas per se (ej.
nanopartículas).
6. Producción de vacunas: se usan para la producción de virus que luego se usan para
producir vacunas (poliomielitis, rabia, varicela, rubéola, hepatitis B).
7. Anticuerpos monoclonales: Aislamiento de linfocitos B de bazos de ratones
inmunizados que luego son inmortalizados mediante fusión a células de mieloma
generando hibridomas productores de anticuerpos monoclonales.
8. Reemplazo de tejidos y órganos: se están llevando a cabo investigaciones que
utilizan células primarias para la reconstrucción de tejido dañado o reemplazo de
células y tejidos no funcionales. ´Se usan tanto células embrionarias (stem cells)
como de animales adultos. Incluyen producción de órganos in vitro, órganos bio-
artificiales (como el hígado bio-artificial) o terapia génica (cuando se extraen células
autólogas se les realiza terapia génica y se re-introducen en el paciente o animal
enfermo).
9. Diagnóstico prenatal: se cultivan células del líquido amniótico extraído de
embarazadas y se cultivan para determinar anormalidades cromosomales (cariotipo)
y detección temprana de desórdenes fetales. También determinación del cariotipo de
adultos cultivando linfocitos de sangre periférica.

Bibliografía:
• Culture of animal cells. A manual of basic techniques. Autor: R. Ian Freshney. 5°
Edición. Editorial: Willey-Liss. New Jersey. USA. Año 2005.
• Cell Biology Protocols. Edited by J. Robin Harris, John Graham, David Rickwood.
John Wiley & Sons, Ltd. ISBN: 0-470-84758-1. Año 2006.