Aislamiento e identificación de proteínas por electroforesis

Introducción

Suero

A simple vista, la sangre aparenta ser una sustancia simple. Sin embargo, consta de
varias partes. Ambos tipos de glóbulos (rojos y blancos), así como las plaquetas, son
sólidos. Cuando se les extrae, queda un líquido. Éste es el suero.

Proteína

Las proteínas son sustancias compuestas por pequeñas sustancias químicas llamadas
aminoácidos. Sus funciones son variadas:

 dotan al cuerpo de estructura

 ayudan a transportar nutrientes
 ayudan en la lucha del organismo contra las enfermedades

Electroforesis

La electroforesis es una técnica de laboratorio que se utiliza para separar grupos de

proteínas del suero sanguíneo. Esto permite que se les pueda medir y analizar
individualmente. Consiste en exponer a una corriente eléctrica el suero que se ha
colocado en un tipo de papel especial. Esto hace que los distintos tipos de proteínas se
muevan y agrupen. Las proteínas crean bandas separadas en el papel, las cuales se
analizan en el laboratorio. Se trata de una técnica fundamentalmente analítica, aunque
también se puede realizar con fines preparativos.

Funcionamiento general.
ELECTROFORESIS
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de
estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa
por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se emplee.
Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis:

De frente móvil: los componentes de la muestra están presentes en toda la disolución

y se determina ópticamente la posición del frente de avance o frontera con el disolvente.
 Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran a
través de un disolvente, utilizando además un medio que da soporte a éste. En este caso
no se determina la movilidad, sino que el único objetivo de la técnica es separar los
componentes de la muestra.
Continua: la muestra se aplica también en una zona, pero se suministra continuamente
a lo largo del proceso

Estudiaremos únicamente la electroforesis zonal, de uso más extendido.

Modos de disposición del soporte
Horizontal
esquema de cubeta de electroforesis horizontal En papel, para aminoácidos u otras
moléculas pequeñas; en soportes similares (especialmente, acetato de celulosa), para
proteínas.
En gel de almidón o de agarosa, para proteínas y especialmente para ácidos nucleicos.
Casi siempre el tampón cubre el gel (para evitar que se seque debido al calentamiento
sufrido al pasar la corriente), denominándose por ello “electroforesis submarina”.
El soporte se impregna por capilaridad de disolución tampón, que disuelve la muestra y
mantiene el contacto eléctrico.
Se aplica la muestra depositándola (con pipeta o un aplicador específico) como una gota
sobre el soporte (papel, acetato de celulosa) o dentro de un “pocillo” creado en el gel.
Vertical
Se usa casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (más resistente físicamente, no se
desliza), para proteínas o para ácidos nucleicos de pequeño tamaño.
El gel puede rellenar tubos de vidrio (este formato ya apenas se usa) o estar contenido
entre 2 placas rectangulares.
Contacto eléctrico y disolvente gracias al tampón que embebe el gel y llena las cubetas
o compartimentos del ánodo y cátodo.
La muestra se deposita con micropipeta llenando un “pocillo” creado al polimerizar el gel.
En cuanto a la composición del gel hay dos variantes: electroforesis continua (un solo
tipo de gel) y electroforesis discontinua (2 tramos de gel de composición ligeramente
diferente).

La técnica clásica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa impregnada de un
electrolito.
Sus extremos se sumergen en dos depósitos independientes que contienen ambos al
electrolito y están unidos a los electrodos del generador de corriente. La muestra se
deposita en forma de un pequeño trazo transversal en la tira. La distancia de migración
se mide en relación un marcador interno. Las placas son reveladas con sales de plata
(nitrato de plata), azul de Coomassie (es un colorante derivado del trifenilmetano.
Originalmente se utilizó en la industria textil, pero actualmente se emplea principalmente
en bioquímica para teñir proteínas en geles de electroforesis.), o reactivos en particular.

Técnicas de separación Electroforéticas

Separación de proteínas por SDS-PAGE discontinua vertical

Separación de acuerdo con la masa molecular (estrictamente, con la longitud de la

cadena polipeptídica).

La muestra se trata con SDS (a mayor concentración que en la composición del gel) y
se calienta brevemente a 90-100°C, para provocar la desnaturalización. Se suele
añadir también β-mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro, separando así las
subunidades de la proteína y permitiendo que se extiendan por efecto del SDS.

En la preparación del gel se mezclan:

 un tampón de pH (comúnmente Tris-HCl)

 acrilamida y bisacrilamida
 un agente iniciador de la polimerización, como el persulfato amónico (genera
radicales libres)
 un agente catalizador de la polimerización, como el TEMED (N,N,N’,N’-
tetrametiletilenodiamina)
 SDS

Para mejorar la resolución (obteniendo bandas más compactas) se suele emplear

electroforesis discontinua:

 En la parte superior, un gel acumulador o concentrador (stacking gel), que

tiene como efecto concentrar la muestra en una banda estrecha.
 Ocupando la mayor parte de la placa, un gel separador (resolving gel) en el que
tiene lugar la separación de los componentes.

El efecto concentrador se debe a una mayor porosidad del gel acumulador combinada
con una diferente composición de los tampones de cubeta (Tris-glicina) y de gel (Tris-
HCl) y distinto pH para ambos geles.

Nota: “Tris” es tris(hidroximetil)aminometano, una sustancia habitual para preparar

disoluciones tampón de pH próximo a 7.

También hay:
Electroforesis capilar en zona o en disolución libre (CZE)
Es el procedimiento de electroforesis más habitual, en el cual el capilar es recorrido por
el electrolito a través de un medio buffer que puede ser ácido (fosfato o citrato), básico
(borato), o anfótero (carácter ácido y básico). El flujo electroosmótico (el movimiento de
un fluido a través de un conducto de muy pequeño diámetro como un capilar o un
microcanal cuando se aplica un campo eléctrico) crece con el pH del medio
electroforético.
Electroforesis capilar en gel (CGE)
Esta es la transposición de la electroforesis en gel de poliacrilamida (homopolímero de
acrilamida) o de agarosa (polisacárido formado por galactosas alfa y beta que se extrae
de las algas de los géneros Gellidium y Gracillaria). El capilar está relleno con un
electrolito que contiene al gel. Se produce un efecto de filtración que ralentiza a las
grandes moléculas y que minimiza los fenómenos de convección o de difusión. Los
oligonucleótidos, poco frágiles, se pueden separar de este modo.

Preparación de Gel separador para electroforesis

Agua destilada
Buffer pH 8.8
Acrilamida/bis acrilamida 30% v/v son poliacrimidas(forman un gel transparentes con
estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena
visualización de las bandas durante tiempo prolongado)
Sds 10%( Dodecilsulfato sódico) carga negativamente la proteína. (es un detergente
aniónico que se une a las proteínas, desnaturalizándolas en una conformación extendida
recubierta de moléculas de SDS. Como consecuencia, el tamaño de la molécula de
proteína es directamente proporcional a su longitud en aminoácidos y su carga queda
enmascarada por la mayor carga del SDS que la recubre, que es también proporcional
a la longitud. Por lo tanto, la movilidad electroforética de la proteína depende
exclusivamente de su masa molecular.)
Persulfato de amonio completa la polimerización
Reactivo TEMED(Tetrametiletilendiamina) inicia la polimerizacion
Homogeneizar
Se añade una capa de agua encima de los cristales para evitar el paso de aire y facilitar
la polimerización de los reactivos.

Preparación de gel concentrador

Agua
Acrilamida/bis acrilamida 30% v/v
Buffer concentrador pH tris-borato (rango de pH 7.0 a 8.5)
Se cubre la parte superior de los cristales reemplazando el agua, para concentrar las
proteínas antes de ser separadas
Buffers: tris-glicina (rango de pH 8.3 a 9.5), tris-borato (rango de pH 7.0 a 8.5) y tris-
acetato (rango de pH 7.2 a 8.5).
Cuando la muestra ya esta en la cubeta se añade el buffer de electroforesis (contiene
glicerol para aumentar la densidad de la muestra y azul de bromofenol como tinción
Se selecciona el voltaje adecuado
Azul de comassie como tinción de proteinas(3 horas) se puede dejar hasta 18 horas sin
problemas de sobretinción.
Se agita un par de horas para que asimile la tincion
Se usa un decolorante selectivo que elimina la tincion del gel pero no de las proteinas(30-
60minutos)
Desventajas
Las mediciones de electroforesis no son precisas
La electroforesis en gel puede separar eficazmente las proteínas similares con diferentes
pesos (esta es una técnica de Western blot). Se puede separarlos más precisamente a
través de una técnica conocida como electroforesis 2D; esto es común en la proteómica.
Desafortunadamente, todas las mediciones realizadas a partir de esta técnica son semi-
cuantitativa en el mejor. Con el fin de obtener la masa precisa (en peso) de proteínas,
espectroscopía de masas debe ser empleado después de la proteína ha sido purificada
por electroforesis. Además, la comparación de las cantidades relativas de diferentes
moléculas se basa en la densidad de banda (oscuridad) de diferentes manchas en el gel.
Este método tiene un cierto grado de error, y las muestras se suele ejecutar varias veces
para obtener resultados limpios.
Sólo ciertas moléculas pueden ser visualizados
La electroforesis es excelente en la separación e identificación de mediano a
biomoléculas de gran tamaño. Sin embargo, muchas de las moléculas que los
investigadores desean mirar son más pequeños; pequeñas hormonas,
neurotransmisores, y los iones no se pueden medir por electroforesis
La electroforesis es el bajo rendimiento
La electroforesis en gel es generalmente bajo rendimiento, lo que significa que no
produce datos especialmente rápido. Contrasta la electroforesis, donde se puede ver un
pequeño puñado de moléculas de ARN a la vez, con la PCR (reacción en cadena de la
polimerasa), que se puede evaluar simultáneamente miles de muestras.

Identificación de proteínas:
Valoración del proteinograma
Hay que tener presente que el proteinograma proporciona la información correspondiente
a las proteínas mayoritarias de cada banda y que, por tanto, la información que parece
aportar sobre una proteína específica puede estar distorsionada en presencia de
concentraciones aumentadas de las otras proteínas que comparten la zona de migración.
Las valoraciones cuantitativas de cada una de las principales proteínas plasmáticas se
realizan por otros procedimientos analíticos.

En el proteinograma realizado por electroforesis capilar se definen las siguientes bandas:

Banda de la prealbúmina
Es una banda difusa, por delante de la albúmina,2 poco visible y que está constituida por
dos proteínas con un gran interés para la valoración nutricional como son la prealbúmina
y la proteína fijadora del retinol.3 Por sus bajas concentraciones, se requieren técnicas
inmunológicas para valorar su cuantía.

Banda de la albúmina
Es la banda más importante del proteinograma, representando más del 50% del mismo
en condiciones normales. Está integrada por la proteína más abundante del plasma.4 Su
interés se centra en las hepatopatías (cirrosis) y nefropatías (síndrome nefrótico), donde
está disminuida. Se eleva en situaciones de deshidratación y por prolongación del tiempo
del torniquete a la hora de la extracción de la muestra. Una alteración cualitativa sin
significado patológico que se puede presentar es la bisalbuminemia, que puede tener un
origen genético o adquirido (generalmente debido a la toma de medicamentos).

Banda de la α1-globulina(alfa1)
Esta banda está formada por un conjunto de proteínas como la α1-antitripsina, la α1-
glucoproteína, la transcortina,5 la α1-lipoproteína,6 y la α-fetoproteína, siendo las dos
primeras las que representan el mayor porcentaje de la misma. Esta banda se eleva en
los procesos inflamatorios agudos, por lo que las proteínas que la integran se denominan
reactantes de fase aguda.

Mayor interés tiene su disminución, ya que indica un déficit de α1-antitripsina, sobre todo
en la deficiencia homocigota (PiZZ) en donde la concentración plasmática de esta
proteína está por debajo del 10-15% de su concentración en los sujetos sanos (MM). En
ausencia de proceso inflamatorio agudo, los sujetos homocigotos SS y los heterocigotos
MS, MZ y SZ tienen alrededor del 50% de las concentraciones encontradas en los sujetos
con el fenotipo MM.
Banda de la α2-globulina(alfa2)
Las tres principales proteínas que la integran son la α2-macroglobulina,7 la
haptoglobina8 y la ceruloplasmina.9 Se comportan también como reactantes de la fase
aguda positivos; la α2-macroglobulina tiene una función de antiproteasa sérica; la
haptoglobina se une a la hemoglobina en los procesos hemolíticos intravasculares donde
está disminuida y la ceruloplasmina tiene una misión transportadora del cobre, siendo
sus concentraciones bajas en la enfermedad de Wilson.

Bandas de las ß-globulinas(beta)

Las proteínas más importantes son la transferrin10a, la hemopexina,11 la ß-lipoproteína
y el c3 nativo.
La transferrina se eleva en situaciones de déficit de hierro y desciende en el síndrome
nefrótico y las hepatopatías; la hemopexina desciende en las anemias hemolíticas y se
eleva en las reacciones agudas; el c3 desciende en el LES activo y se eleva como
reactante de fase aguda positivo.

En esta banda pueden aparecer otras extras correspondientes a la hemoglobina de los

sueros hemolizados, el fibrinógeno12 (cuando el proteinograma se realiza con plasma)
y las gammapatías monoclonales, sobre todo IgA.

Banda de la δ-globulina(gamma)
Está formada por las tres principales inmunoglobulinas:13 IgG,14 IgA15 e IgM;16 en
ausencia de una gammapatía monoclonal, su estimación electroforética solamente
aportará información sobre la concentración sérica, sobre todo de la IgG. Su elevación
puede ser policlonal, donde todas las inmunoglobulinas se elevan dando lugar a una
curva simétrica, o bien monoclonal donde aparece un pico correspondiente a la síntesis
de una sola cadena de inmunoglobulinas. La elevación policlonal de la IgA15 da lugar a
lo que se llama puente ßδ-globulina.

Las elevaciones policlonales suelen deberse a una activación de la inmunidad humoral,

inducida por múltiples mecanismos patológicos, como las infecciones, las enfermedades
autoinmunes, las hepatopatías y los procesos inflamatorios agudos y crónicos.
Las elevaciones monoclonales se deben, sobre todo, al mieloma múltiple,17 la
enfermedad de Waldeströn, la enfermedad de las cadenas pesadas y, con mucha
frecuencia, a las denominadas gammapatías monoclonales de significado incierto.
Factores que afectan la electroforesis
En general la electroforesis depende directamente del campo eléctrico y este depende
de distintos parámetros. Basándose en la ley de Ohm se tiene que V=IR
Diferencia de potencial (V): define el campo eléctrico; la velocidad de avance es
directamente proporcional a ella.
Resistencia (R): la movilidad de las moléculas es inversamente proporcional a ella.
Intensidad (I): cuantifica el flujo de carga eléctrica, se relaciona directamente con la
distancia recorrida por las moléculas.
Por último, otro factor que afecta significativamente a la electroforesis es la temperatura,
esta es importante puesto que por el efecto Joule el paso de una corriente eléctrica va a
producir calor y este es directamente proporcional a la diferencia de potencial y a la
resistencia. Por lo tanto, es necesario controlar de manera estricta la temperatura para
que esta no afecte a la muestra desnaturalizándola.

Ventajas
La inducción del alto potencial eléctrico permite: 1) que la separación sea más sensible
entre las diferentes moléculas (aumento de la resolución) y 2) que el tiempo de análisis
sea más corto.
La eficacia y la velocidad de la separación se pueden mejorar mediante la optimización
de diferentes factores como son la temperatura, el voltaje aplicado, el medio de
separación, el disolvente en el que se encuentra disuelta la muestra, etc.
Generalmente se obtienen tiempos de análisis bastante bajos si se compara con otras
técnicas separativas como la cromatografía de gases o la de líquidos. Además, el
consumo de muestra y reactivos es muchísimo menor por lo que se la puede considerar
una técnica más limpia.
Es muy versátil ya que se puede emplear para separar cualquier tipo de compuesto
eligiendo bien el detector; se puede acoplar a un detector UV, de fluorescencia, un
espectrómetro de masas, etc.
Todas estas características convierten a la EC en un método eficiente y económico,
capaz de separar cientos de componentes de forma simultánea, empleando cantidades
mínimas de muestras y reactivos.
Aplicaciones
Pueden analizarse las proteínas contenidas en diferentes líquidos biológicos: sangre,
plasma (el líquido sanguíneo sin células), suero (plasma sin fibrinógeno), orina, LCR,
líquido sinovial, saliva, lágrimas. Así como alimentos, especialmente lácteos y cereales.
Este tipo de análisis electroforético tiene aplicaciones en investigación y en clínica, tanto
humana como animal. Además, es una técnica muy empleada para el análisis de
proteínas alimentarias y últimamente se empleando para realizar genotipado y detección
de OMG (organismos modificados genéticamente).

Muestra: