GUÍA DE LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA BÁSICA

Pautas para la elaboración y presentación de los informes de laboratorio

Durante los prácticos de laboratorio trabajarán en grupos y tendrán que elaborar informes
escritos sobre las distintas actividades realizadas. A modo de guía, se incluye la siguiente
lista de los ítems mínimos que deben ser incluidos en los informes:

Apellidos, nombres y comisión: Incluye los apellidos y nombres de todos los integrantes
del grupo de trabajo y la comisión a la que pertenecen.

Fecha: Se refiere a la fecha de elaboración del TP de laboratorio.

Título del informe: Debe relacionarse con la técnica a realizar.

Fundamento de la técnica: Define la técnica en general. Responde a la pregunta de cuál

es el principio inmunológico que explica el fenómeno que se visualiza como resultado de la
técnica en cuestión.

Objetivos: Se plantea teniendo en cuenta la/s muestra/s a evaluar y qué es lo que se

pretende conocer de ellas a través de la aplicación de la técnica.

Materiales y reactivos: Deben enumerarse los materiales (tubos, pipetas, etc.) y los
reactivos (PBS, glutaraldehído, etc.) utilizados en cada trabajo de laboratorio. Si no conoce
el nombre de alguno de los materiales a emplear, consulte a los docentes.

Muestras: Deben describirse sus características (tipo, origen, cantidad) y cualquier otro
dato que sea relevante para analizar los resultados (modo de transporte, conservación,
presencia de hemólisis, etc.). Para una mejor descripción, remitirse a la Guía de Trabajos
Prácticos, capítulo “Toma de Muestras”.

Metodología: Debe realizarse una descripción esquemática que incluya el fundamento y

las etapas más importantes de la/s técnica/s realizada/s. Esta descripción no debe ser la
trascripción literal de lo enunciado en la guía de trabajos prácticos sino una tarea de
elaboración, que se ajuste a la situación particular planteada en cada uno de los trabajos de
laboratorio.

Resultados: Corresponden a los datos cuantitativos (valores numéricos con sus unidades),
semicuantitativos (título) o cualitativos (descriptivos) obtenidos para cada muestra.

Discusión y Conclusiones: Ambas se refieren a la interpretación de los resultados

obtenidos y su importancia tanto desde el punto de vista teórico como práctico.

Bibliografía: Se debe citar la bibliografía consultada para la elaboración del informe. Cada
cita deberá incluir: Autor, Título, Edición, Editorial, páginas/capítulos, Fecha. Por ejemplo:
 ROITT I., “inmunología. Fundamentos”, 11va. ed., Editorial Panamericana. 2008.

1
 Laboratorio I

I. Obtención de muestras

A. Obtención de la capa leucocitaria a partir de sangre periférica

Al someter la muestra de sangre periférica extraída con anticoagulante a centrifugación
(durante 15-20 minutos a 1500-2000 rpm, que equivale a 500g), se produce la separación
de los componentes (células, plasma) por su densidad y se obtienen 3 porciones bien
diferenciadas (Figura 1): el plasma se ubica en la porción superior, mientras que los
eritrocitos se depositan en el fondo del tubo. La capa blanquecina que cubre los eritrocitos,
corresponde a los glóbulos blancos y las plaquetas (capa leucocitaria o buffy coat). Estas
células pueden ser utilizadas después para diferentes técnicas de laboratorio. La
manipulación de las mismas debe ser cuidadosa, dado que generalmente las pruebas
requieren de la viabilidad celular.

Figura 1: Esquema del tubo de sangre periférica tratada con anticoagulante luego de la
centrifugación

Plasma

Capa leucocitaria o buffy coat: leucocitos y plaquetas

Eritrocitos

Metodología:
1. Centrifugar el tubo que contiene sangre con anticoagulante durante 10 minutos a 2000
rpm previo balanceo de dos tubos con peso similar.
2. Acoplar un tip a una pipeta Pasteur y succionar la capa leucocitaria con mucho cuidado,
prestando atención a la forma en la que esta capa va disminuyendo.
3. Una vez que llegue al tope de succión de la pipeta, retirar y descargar el contenido en el
tubo tipo eppendorf que contiene PBS (solución salina buffereada). Repetir este
procedimiento tantas veces como sea necesario hasta terminar de levantar la capa
leucocitaria, identificada visualmente.
NOTA: Para conocer el número de células obtenido se puede realizar el recuento de
células viables mediante la tinción con Azul Tripán (tiñe las células que han perdido
integridad de membrana) y la lectura se realiza en cámara de Neubauer mediante
microscopia óptica.

B. Obtención de suero
Metodología:
 Recolectar la muestra de sangre periférica en un tubo sin anticoagulante.
 Esperar a que se forme el coágulo sanguíneo. Este proceso puede demorar de
minutos a horas, dependiendo de múltiples factores (temperatura ambiente, material
del tubo de recolección, especie animal y patologías de cada individuo, etc.). Es
posible acelerarlo mediante la incubación de las muestras primero a 37ºC durante
0,5 -1 hora (para favorecer la actividad de las enzimas de la cascada de coagulación)
y luego a 4°C durante toda la noche (para favorecer la retracción del coágulo).
 Despegar el coágulo sanguíneo de las paredes del tubo con un ansa metálica o de
plástico; cuanto antes se despegue menor es la hemólisis del suero.

2
  Equilibrar los tubos en la balanza y centrifugar durante 10 minutos a 2000 rpm.
 Extraer el suero, colocarlo en un tubo. Evaluar el grado de transparencia del suero
extraído.

Informe:
 No es necesario entregar un informe escrito de esta actividad.

II. Prueba del Glutaraldehído

Las Inmunoglobulinas en suero u otros fluidos pueden ser identificadas (presencia o
ausencia), semicuantificadas o cuantificadas, a través de diferentes metodologías. A modo
de aplicación de estos procedimientos, se plantea: la necesidad de conocer si la
transferencia calostral de tres equinos neonatos de 18-20hs de vida fue buena, a fin de
tomar medidas para la protección inmunológica de éstos. Para ello, se utiliza la prueba de
glutaraldehído.

Reactivos:
 Reactivo de glutaraldehído diluido al 12,5%.

Muestras:
 Muestras de sueros de potrillos neonatos: 1, 2 y 3.

Metodología:
La técnica consiste en colocar en un tubo de ensayo 0,5 ml de suero y agregar una gota de
glutaraldehído, agitar y controlar cada 10 minutos durante el transcurso de 1 hora. La prueba
debe realizarse a temperatura ambiente. El tiempo se toma desde la adición del reactivo
(minuto cero o tiempo cero) hasta que se forma un “gel semisólido” (coágulo). La
observación se facilita inclinando el tubo a 45º, y verificando que el contenido no se deslice
por las paredes (tomando la precaución de no volcarlo).

La interpretación de la técnica se esquematiza en el cuadro siguiente:

Tiempo de Concentración
Interpretación
reacción aproximada de IgG (mg/dl)
Buena transferencia calostral
Entre 0 y 10 minutos Mayor de 800
Valor normal
Entre 10 y 60 Falla parcial de transferencia calostral.
De 400 a 800
minutos Animal en riesgo potencial
Falla total de transferencia calostral.
Mayor de 60 minutos Menor de 400
Animal en alto riesgo

Informe: En el informe recuerde agregar todos los resultados y, en caso de que se detecte
que no hubo gelificación, explique cuáles podría ser las causas de la falla en la transferencia
y qué aconsejaría como medidas de manejo.

Autoevaluación (no es necesario incorporar las respuestas de este cuestionario al

informe):
1. El pasaje de las inmunoglobulinas por placenta no es igual para todas las especies
domésticas.
a) ¿En qué especies hay pasaje de inmunoglobulinas por placenta y en cuáles no?
b) ¿De qué depende este fenómeno?

3
 c) ¿Cuáles son los isotipos de inmunoglobulinas que atraviesan la placenta y cómo se
produce este pasaje?

2. El dueño de un haras compró calostro equino liofilizado en Alemania para tener un

banco de calostro. ¿Protegerá a un potrillo que nació en la provincia de Buenos Aires?
¿Por qué? ¿Qué le aconsejaría?

III. Evaluación de reacciones antígeno-anticuerpo

A. Hemoaglutinación (aplicada a la evaluación de compatibilidad entre

grupos sanguíneos)

Cuando se busca un resultado positivo o negativo se habla de hemoaglutinación cualitativa.

Este procedimiento puede ser útil en el caso de requerir la identificación de compatibilidad
sanguínea. A modo de ejemplo proponemos el siguiente ejercicio:

Un gato requiere una transfusión sanguínea en forma urgente y en la veterinaria tenemos

otro gato que podría ser donante de sangre. Antes de realizar la transfusión se realiza la
prueba de reactividad cruzada (Cross Match).

Muestras:
 Suspensión de glóbulos rojos del donante al 3 % en PBS (GRd)
 Suspensión de glóbulos rojos del receptor al 3 % en PBS (GRr)
 Suero del donante (Sd)
 Suero del receptor (Sr)

Metodología:
Placa 1:
1. Homogeneizar mediante movimientos delicados (por inversión) el tubo tipo eppendorf
que contiene la suspensión de glóbulos rojos del donante diluidos y colocar 50 l en una
placa de vidrio.
2. Agregar 50 L del suero del receptor.
3. Mezclar con un palillo realizando circunferencias de aproximadamente 2,0 cm de
diámetro.
4. Homogenizar la mezcla con movimientos rotatorios de la placa.
5. Incubar a temperatura ambiente.
6. Realizar la lectura cada 3 minutos por medio de movimientos de sobre un fondo blanco.

Placa 2:
I. Homogeneizar mediante movimientos delicados (por inversión) el tubo tipo eppendorf
que contiene la suspensión de glóbulos rojos del receptor diluidos y colocar 50 l en una
placa de vidrio.
II. Agregar 50 L del suero del donante.
III. Repetir los pasos 3-6 descritos arriba.

Informe: En el informe recuerde agregar todos los resultados. Además, indicar y justificar si
en este caso sería seguro realizar la transfusión.
Analice los posibles resultados e indique en cada caso, si es necesario realizar alguna otra
prueba con las muestras para tomar la decisión.

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B. Inmunodifusión (aplicada al diagnóstico serológico de una enfermedad
infecciosa)

Cuando se busca un resultado positivo o negativo se habla de precipitación cualitativa. Este

procedimiento puede ser útil en el caso de requerir la identificación de infecciones virales. A
modo de ejemplo proponemos el siguiente ejercicio:

La anemia infecciosa equina (AIE) es una enfermedad causada por un Lentivirus de la

familia Retroviridae, que afecta a todos los équidos y se transmite mecánicamente a través
de la picadura de insectos y/o la utilización de material contaminado con sangre infectada.
Muchos de los animales infectados desarrollan signos leves o inaparentes, por lo que pasan
desapercibidos. El riesgo que esto implica se debe a que permanecen como portadores
subclínicos y constituyen una fuente de infección constante para la tropilla. Al ser una
enfermedad para la que no existe tratamiento ni vacuna específica, el control se realiza
mediante la detección y eliminación de los animales infectados.
En nuestro país la normativa oficial del SENASA establece el control serológico de los
equinos a través del Test de Coggins. Esta técnica consiste en una inmunodifusión doble en
gel de agar, que evalúa la presencia de anticuerpos utilizando como antígeno la proteína
estructural p26 de la cápside viral. Para este práctico, vamos a suponer que somos un
laboratorio habilitado por SENASA para realizar la certificación de libre de AIE y se requiere
evaluar muestras de tres animales para poder trasladarlos.

Reactivos:
 Agar al 2% diluido en PBS.
 Suero Control Positivo (CP): suero de un equino confirmado como infectado con el virus.

Muestras:
 Muestras de sueros de tres equinos: 1, 2 y 3.

Metodología:
a) Preparación del gel:
a) Colocar 5 ml de agar al 2% con una pipeta serológica en placa de Petri (sobre la tapa
de diámetro más pequeño) y distribuir el volumen homogéneamente. Dejar reposar
sobre la mesada sin taparlo (para evitar la condensación) hasta que el agar
solidifique.
b) Realizar perforaciones en el gel a partir del siguiente modelo:

Colocar la placa de Petri sobre el dibujo del modelo y extraer los fragmentos de agar
por aspiración, utilizando una pipeta Pasteur sacabocados. De esta forma quedan
formados los hoyos.

b) Siembra:
a) Rotular la placa para su posterior identificación.
b) Hacer una marca en el agar antes de efectuar la siembra. Esto es importante para
poder identificar qué muestra contiene cada hoyo.
c) Sembrar la placa con una micropipeta, de acuerdo al siguiente esquema:
i. 10l de cada uno de los sueros controles positivos

5
 ii. 10l de cada una de las muestras
iii. 10l del antígeno p26 en el hoyo central

CP

3 1
p26
CP CP
2
d) Colocar la placa de Petri tapada en la cámara húmeda e incubar entre 24 y 48 hs a
temperatura ambiente. La cámara húmeda consiste en un recipiente con tapa
preferentemente hermética y un papel absorbente humedecido en el fondo. Así, a
través del ciclo evaporación-condensación, se mantiene la humedad ambiente.

5) Lectura de los resultados: consulte la guía de trabajos prácticos. La realizarán durante el

próximo trabajo práctico.

Informe: Se debe confeccionar siguiendo las “Pautas para la elaboración y presentación de

los informes de laboratorio”. Tener en cuenta: resultados obtenidos y discutir decisiones a
tomar en cada uno de los casos.

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 Laboratorio II

I. Evaluación de reacciones antígeno-anticuerpo

A. Inhibición de la hemoaglutinación (IHA; aplicada al diagnóstico

serológico de una enfermedad producida por un virus hemaglutinante)

El virus de la parvovirosis canina (Canine parvovirus: CPV) posee una proteína de la

cápside que produce la hemoaglutinación (HA) in vitro de glóbulos rojos de cerdo, la cual se
ve inhibida por la presencia anticuerpos específicos dirigidos contra esta hemaglutinina viral.
La respuesta inmune protectora contra el CPV es predominantemente humoral, siendo los
anticuerpos capaces de proteger al animal. Estos anticuerpos se pueden evaluar por la
técnica de Inhibición de la hemoaglutinación (IHA). Un título sérico igual o mayor a 80 es
considerado como protector contra la infección por CPV.
En este práctico se titularán los anticuerpos específicos a CPV presentes en el suero de un
cachorro vacunado. La determinación se realizará por la IHA.

Reactivos:
 Antígeno: virus CPV (obtenido mediante el cultivo en la línea celular de riñón felino
(Crandell Feline Kidney, CRFK).
 Suspensión de glóbulos rojos de cerdo 2 % en PBS (GRC)
 0,1% de seroalbúmina bovina diluida en solución salina tamponada (PBS)

Muestras:
 Suero de cachorro

Metodología:
Para poder realizar la evaluación del suero es necesario titular previamente el virus. En la
Guía de Trabajos Prácticos se encuentra detallada la metodología para realizarlo.

Titulación del suero: En la siguiente tabla se indican las evaluaciones que se realizarán en
clase (recuadros grises).
1. Colocar 50 L por hoyo de cada una de las diluciones del suero (diluciones en base 2
desde 1/10 - 1/160), o 50 L por hoyo de PBS (en los hoyos E6 y F6) .
2. Colocar 10 L por hoyo de la suspensión de CPV. Esta fue previamente titulada y se
sabe que contiene entre 4 y 8 Unidades Hemoaglutinantes (UHA).
3. Colocar 10 L de PBS (en los hoyos para el control de anticuerpos aglutinantes
inespecíficos: E2 y F2).
4. Homogenizar con ligeros movimientos de la placa. Incubar durante 30 minutos a 37°C.
5. Colocar 50 L de la suspensión de GRC en todos los hoyos.
6. Homogenizar con ligeros movimientos de la placa. Incubar durante 1 hora a 37°C.
7. Realizar la lectura de los controles (glóbulos rojos, titulo viral, control de suero positivo,
control de suero negativo y control de anticuerpos aglutinantes inespecíficos).
8. Decidir de acuerdo a los resultados de los controles si la determinación realizada tiene o
no validez, o hay que repetir la determinación. Y proceder luego a leer la lectura del título
de anticuerpos en la muestra del cachorro.

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Diseño de la placa IHA:

El texto dentro de cada recuadro indica la dilución de CPV y/o suero que cada hoyo contiene. En todos los hoyos se coloca la
suspensión de glóbulos rojos de cerdo. Los recuadros grises indican los que se evaluarán en clase.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
CPV CPV CPV CPV CPV
A CPV 1/2 CPV 1/4 CPV 1/8 CPV 1/16 CPV 1/32 CPV 1/64
1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048
CPV CPV CPV CPV CPV
B CPV 1/2 CPV 1/4 CPV 1/8 CPV 1/16 CPV 1/32 CPV 1/64
1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048
Suero Suero Suero Suero Suero
CSP 1/10 CSN 1/10
C 1/10 + 1/20 + 1/40 + 1/80 + 1/160 +
+ CPV + CPV
CPV CPV CPV CPV CPV
Suero Suero Suero Suero Suero
CSP 1/10 CSN 1/10
D 1/10 + 1/20 + 1/40 + 1/80 + 1/160 +
+ CPV + CPV
CPV CPV CPV CPV CPV
Suero Suero Suero Suero Suero
E PBS
1/10 1/20 1/40 1/80 1/160
Suero Suero Suero Suero Suero
F PBS
1/10 1/20 1/40 1/80 1/160
G
H
CPV: Parvovirus canino (expresado en diluciones o en 4-8 UHA) Filas E y F: control de anticuerpos aglutinantes inespecíficos (hoyos
Suero: suero problema (expresado en diluciones) 1 a 5) y control de sedimentación de glóbulos rojos (hoyo 6).
Filas A y B: Titulación Viral (control) CSP: control de suero positivo
Filas Cy D: Titulación de la muestra CSN: control de suero negativo

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B. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay; aplicada al diagnóstico
serológico de una enfermedad infecciosa)

La anaplasmosis es una enfermedad parasitaria transmitida por garrapatas que afecta a los
bovinos y es causada por el Anaplasma marginale. La enfermedad provoca grandes
pérdidas económicas en las regiones tropicales y subtropicales. Las pruebas serológicas
son de gran importancia para la realización de estudios epidemiológicos, principalmente en
zonas donde se practica el control intensivo de garrapatas, en los centros de inseminación y
transferencia de embriones, así como en los lugares donde se crían animales reproductores.
La identificación de anticuerpos específicos frente a proteínas expuestas del parásito
permite el diagnóstico serológico de la enfermedad.

Para este trabajo práctico, se propone evaluar las muestras de suero de 4 bovinos lecheros
provenientes de un establecimiento del noroeste del país. Esto se realizará mediante la
técnica de ELISA-Anaplasma, que utiliza como antígeno la proteína MSP5 de A. marginale.

Reactivos:
 PBS-Tween 20 al 0,05 % (solución de lavado).
 Anticuerpo anti-IgG bovina (H+L) producido en conejo conjugado con peroxidasa. Se les
entregará a la dilución de trabajo, utilizando PBS-leche descremada al 5 % como
diluyente (Ac anti-IgG bov conjugado).
 TMB (3,3´, 5, 5´Tetramethylbenzidine) y agua oxigenada (sustrato + cromógeno).
 H2SO4 0,16M (solución de frenado).

Muestras:
 Suero de 4 bovinos: 1, 2, 3 y 4.

Metodología:
1. Volcar el contenido de los hoyos por inversión de la placa sobre la jarra de descarte.
1. Lavado: Agregar solución de lavado a los hoyos utilizando pipeta Pasteur y volcar de la
misma manera que el paso anterior. Repetir 2 veces más. Descartar los restos de
solución de lavado, golpeando la placa en forma invertida sobre un papel tissue.
2. Colocar 50 L por hoyo del Ac anti–IgG bov conjugado con peroxidasa diluido 1/2000
en PBS con 5% de leche descremada. Incubar durante 45 minutos a 37°C, en cámara
húmeda.
3. Repetir el paso 2.
4. Colocar 50 L/hoyo del sustrato y cromógeno. Incubar durante 5 minutos en oscuridad
(cámara húmeda) a temperatura ambiente.
5. Colocar 50 L /hoyo de la solución de frenado.
6. Interpretar los resultados obtenidos; comparar con la planilla modelo que se entregará
impresa a cada grupo.

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Diseño de la placa ELISA:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A CCP CCN
B SRP SRP
C SRN SRN
D 1 1
E 2 2
F 3 3
G 4 4
H
Fila A, columna 2: control de conjugado positivo (CCP);
Fila A, columna 3: control de conjugado negativo (CCN);
Fila B, columnas 2 y 3: control positivo (suero de referencia positivo, SRP);
Fila C, columnas 2 y 3: control negativo (suero de referencia negativo, SRN);
Filas D - G, columnas 2 y 3: muestras de suero de los 4 bovinos a estudiar.

NOTA: las filas que se emplean de la placa pueden variar según la comisión.

A partir de la lectura de los resultados:

1. Esquematice el ELISA realizado y cada uno de los controles.

2. ¿Por qué es importante analizar cada muestra por duplicado o triplicado?
3. ¿Qué entienden por “suero de referencia positivo” y “suero de referencia negativo”?
4. El valor de corte histórico para este sistema en nuestro laboratorio es de 0,140. Con este
dato verifique la validez de su ELISA, explique.
5. Si la prueba resulta válida, determine qué animales son considerados positivos y cuales
animales son considerados negativos según este ensayo.

Las respuestas a estas preguntas deberán ser parte del informe a entregar.

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