MANUAL PRÁCTICAS ANALÍTICA II

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

LABORATORIO DE ANALÍTICA II

PRÁCTICA N° 1

VERIFICACIÓN DE ESPECTOFOTÓMETROS UV (200- 400 nm)- VISIBLE (400-800

nm) UTILIZADOS EN EL ANÁLISIS DE SUELO Y AGUA.

1. INTRODUCCIÓN

La espectrometría es una técnica ampliamente utilizada en el laboratorio para el

análisis cuantitativo de numerosos compuestos, debido a su sencillez operativa y a
la rapidez en el análisis. En el análisis de muestra de suelos y agua, el
espectrofotómetro constituye una herramienta fundamental para la cuantificación de
nutrientes y contaminantes del correcto desempeño de este, dependerá en gran
medida la calidad de los resultados obtenidos, por lo que se considera un equipo
crítico en los ensayos del laboratorio y que deberá ser verificado periódicamente. La
mayoría de los instrumentos espectroscópicos como el espectrofotómetro están
constituidos por cinco componentes: lámpara o fuente luminosa, selector de longitud
de onda, celda para alojar la muestra, detector de radiación y amplificador de señal
con medidor o registrador.
La concentración de una sustancia puede ser calculada a partir de la cantidad de
luz absorbida por una muestra en el rango de un espectro en el ultravioleta (UV) y
visible (Vis) aplicando lay de Lambert-Beer. Estos estudios se basan en la estrecha
relación que existe entre la absorción de la radiación electromagnética de las
sustancia, tanto en la zona del espectro visible como en el ultravioleta e infrarrojo y
su concentración, haciendo que un haz de luz monocromático paralelo ( 𝑰𝟎 )
atraviese una cubeta de b cm de paso óptico conteniendo una solución de una
concentración c de una especie absorbente. A causa de interacción de la luz y de
las partículas absorbentes la intensidad del haz se atenúa de 𝑰𝟎 a 𝑰.
La transmitancia (T) de la solución es entonces la fracción de la radiación incidente
transmitida por la solución:

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𝐼 𝐼
𝑇= en forma porcentual 𝑇(%) = × 100
𝐼0 𝐼0

Con el fin de obtener ecuaciones de ajuste lineal se utiliza su transformada

logarítmica conocida como absorbancia (A)
𝑨 = − 𝐥𝐨𝐠 𝑻 = 𝒍𝒐𝒈𝑰𝟎 /𝑰

La absorbancia de una solución aumenta cuanto mayor es la atenuación del haz de

luz, ocurriendo lo inverso en la transmitancia. La absorbancia es directamente
proporcional a la longitud de b de la trayectoria a través de la solución, y a la
concentración c de la especie absorbente. Estas relaciones se expresan en la ley de
Lambert-Beer como:

A=Ɛbc
Ɛ= absortividad molar expresada en L mol-1 cm-1
b= distancia recorrida a través de la solución (paso) óptico expresada en cm
c= concentración de la solución expresada en mol L-1

Figura 1. Funcionamiento del espectrofotómetro.

2. OBJETIVOS

 Reconocer los principales parámetros para la verificación del correcto

funcionamiento de espectrómetros UV-Visible, para el análisis de suelo y agua.

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 Identificar las partes de los espectrofotómetros UV-Vis Milton Roy (spectrinic

20D+) del laboratorio.
 Preparar soluciones de Ho2O3 en acido perclórico, H2SO4, CuSO4.5H2O en ácido
sulfúrico, K2Cr2O7 y NaNO2.
 Comprobar experimentalmente la ley de Lamber- Beer.

3. MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES REACTIVOS

5 vasos de precipitado de 10 mL Oxido de holmio (Ho2O3)

1 matraz aforado de 1 L Ácido perclórico (HClO4)
6 matraces aforados de 100 mL Sulfato de cobre pentahidratado
10 tubos de ensayo. (CuSO4.5H2O)
3 peras Ácido sulfúrico (H2SO4)
Desecado Agua destilada
Estufa Dicromato de potasio (K2Cr2O7)
2 pipetas de 10 mL Nitrato de sodio (NaNO2)
1 pipeta de 5 mL
1 pipeta de 1 mL
Panola
2 agitadores
1 espátula

4. PROCEDIMIENTO

Las pruebas de verificación para el correcto funcionamiento de un espectrofotómetro

incluyen:
 Exactitud de la longitud de onda.
 La exactitud y precisión fotométrica.
 Linealidad fotométrica.
 Verificación de la luz difusa o parasita.

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EXACTITUD DE LA LONGITUD DE ONDA

La desviación de la longitud de onda puede causar errores en los resultados

cuantitativos de la lectura en el UV-Vis. En este control se verifica el grado de
concordancia entre la longitud de onda seleccionada para la máxima absorbancia y la
longitud de onda de referencia. Para la verificación de la longitud de onda podemos
usar filtros líquidos disponibles comercialmente de óxido de holmio en ácido perclórico
o proceder a preparar una solución de óxido de holmio. Se recomienda medir según el
rango espectral una longitud de onda para el espectro UV y tres longitudes de onda
para el espectro visible.

COMENTARIO ARTÍSTICO DE HOLMIO Y ÁCIDO PERCLÓRICO:

Estabilidad y reactividad del ácido perclórico

Puede explotar por calentamiento intenso. La sustancia se descompone al calentarla
intensamente. La sustancia se descompone al calentarla intensamente. La sustancia
es un oxidante fuerte y reacciona violentamente con materiales combustibles y
reductores, materiales orgánicos y bases fuertes, originando peligro de incendio y
explosión. Ataca a muchos metales formando un gas combustible (hidrógeno). El ácido
es inestable si la concentración es superior al 72%; puede explotar por shock o
sacudida cuando está seco o secándose. Mezclas con material combustible (como el
papel) pueden inflamarse espontáneamente a temperatura ambiente. Condiciones que
deben evitarse: Evitar la formación de niebla del producto. Evitar todo tipo de contacto
con el producto.
Materiales a evitar: Materiales combustibles y reductores, materiales orgánicos, bases
fuertes, metales. Productos de descomposición: El fuego puede producir gases
irritantes o venenosos.

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Reactividad y estabilidad química de óxido de holmio

Este material no es reactivo bajo condiciones ambientales normales.

El material es estable bajo condiciones ambientales normales y en condiciones
previsibles de temperatura y presión durante su almacenamiento y manipulación. Muy
comburente.

Solución de óxido de holmio en ácido perclórico

Disolver en una vaso de precipitado 4.0 gramos de óxido de holmio (III) en 96,0g de
ácido perclórico al 10% (V/V). Calentar suavemente para ayudar la disolución y agitar
toda la noche para su disolución, luego dejar en reposo durante 24 horas.
Para el rango Visible:
a. Con una misma cubeta, ajustar el cero (0) del instrumento con la solución de
ácido perclórico al 10%.
b. Seleccionar la longitud de onda de 438 nm .
c. Colocar la cubeta con la dilución preparada en el compartimiento de muestras.
Registrar la absorbancia.
d. Repetir los pasos 2 y 3, con incrementos de 2 nm hasta 458 y registrar la
absorbancia con cada graduación de la longitud de onda.
e. Trazar los resultados de absorbancia en función a la longitud de onda.
f. A partir del grafico tome nota de la longitud de onda máxima.
g. Dependiendo del ancho de banda del equipo, la máxima absorción de la
solución de óxido de holmio en acido perclórico se detectara a la longitudes de
onda de 451.4 nm.

EXACTITUD Y PRECISIÓN FOTOMÉTRICA

La exactitud fotométrica se determina comparando la absorbancia de una solución de

referencia con la lectura de ésta obtenida en el espectrofotómetro. Para cubrir
satisfactoriamente el rango UV-Vis del espectro, se utilizan dos soluciones diferentes:

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dicromato de potasio, para el espectro UV y sulfato de cobre, para el espectro Visible.

Se denomina precisión fotométrica a la medida de la dispersión de una serie de
mediciones de absorbancia alrededor de la media, y se expresa como coeficiente de
variación porcentual.

Solución de sulfato de cobre pentahidratado en ácido sulfúrico

Disolver en un vaso de precipitados 20,0 g de sulfato de cobre pentahidratado, de una
pureza mayor al 99,9%, en suficiente agua destilada. Adicionar, con cuidado, 10 ml de
ácido sulfúrico (d = 1,83 g cm-3), y trasvasar cuantitativamente la solución a un matraz
aforado de 1 litro. Enrasar con agua destilada y homogeneizar.
Para el rango Visible:
a. Con una misma cubeta, ajustar el cero de absorbancia del instrumento con la
solución de ácido sulfúrico al 0.01%(v/v), empleada para preparar las soluciones
de referencia.
b. Realizar 6 lecturas consecutivas de la solución de sulfato de cobre
pentahidratado en ácido sulfúrico a las longitudes de onda de 550, 600, 650,
700.
c. Registrar la absorbancia y confrontarlos con los valores de referencia
d. Calcular la precisión fotométrica con los datos obtenidos en el paso 2.

Soluciones de dicromato de potasio

a. Solución de concentración 0,10 g L-1

Secar aproximadamente 1 g de dicromato de potasio, de una pureza mínima de
99,95%, en estufa a 105°C por 2 horas y enfriar en desecador. Pesar 0,10 g y
disolver en un vaso de precipitados con la disolución de ácido sulfúrico 0.005
mol L-1. Trasvasar cuantitativamente a un matraz de un litro, envasar con la
solución de ácido con la solución de ácido sulfúrico 0.005 mol L -1 y
homogeneizar.
b. serie de soluciones de dicromato de potasio:

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Preparar cuatro soluciones de dicromato de potasio de diferente concentración,

requeridas para los controles, a partir de la solución de 0,10 g L -1, tal como se
indica en la tabla 1, enrasando a un volumen final de 100 mL con ácido sulfúrico
0,005 mol L-1

Concentración (g L-1) mL de solución de concentración 0,10 g L-

1

0,02 20
0,04 40
0,06 60
0,08 80

LINEALIDAD FOTOMÉTRICA

El estudio de la linealidad fotométrica permite establecer el rango de absorbancia en el

que el instrumento tiene respuesta proporcional a los cambios de concentración. Para
ello se determina la respuesta del espectrofotómetro a diferentes concentraciones de
una sustancia que cumpla con la ley de Lambert-Beer. Se evalúa la linealidad
fotométrica realizando lecturas de absorbancia de la serie de soluciones de sulfato de
cobre pentahidratado en ácido sulfúrico 0.01%(v/v) de concentración de 0,02; 0,04;
0,06; 0,08 y 0,1 M.
Utilizando la solución de ácido sulfúrico 0.01%(v/v), para realizar el ajuste a cero de
absorbancia del equipo.
Las longitudes de onda a que se realizan las lecturas serán: 650 y 750 nm.

VERIFICACIÓN DE LA LUZ DIFUSA O PARASITA

Se denomina así a toda radiación electromagnética de longitud de onda distinta a la

seleccionada por el monocromador, que alcanza el detector y por lo tanto queda
registrada por el instrumento.

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Solución de Nitrito de sodio

Secar aproximadamente 70 g de nitrito de sodio en estufa a 105ºC por 2 horas y enfriar
en desecador. Pesar 50 g, disolver en un vaso de precipitados con agua destilada y
trasvasar cuantitativamente a un matraz de un litro. Enrasar con agua destilada y
homogeneizar.
Este control se basa en la medida del porcentaje de transmitancia de una solución de
nitrito de sodio 50 g L-1. Esta sustancia tiene la propiedad de que sus soluciones
absorben toda la radiación incidente de longitudes de onda menores a los 390 nm, es
decir, que es ópticamente opaca a la luz. Por lo tanto, la transmitancia a 340 nm de esta
solución debe ser igual a cero, y toda transmitancia detectada corresponde a luz
parásita. El ajuste del equipo a 0 de transmitancia se realiza con aire, luego se mide la
transmitancia de la solución de nitrito de sodio a una longitud de onda de 340 nm.
Realizar las lecturas por triplicado.

5. CRITERIO DE ACEPTACIÓN
Los siguientes criterios de aceptación se aplicaran para los resultados ó obtenidos:

Parámetros Cálculos Resultados Absorbancias

(A)
Aceptable:
Exactitud de Exactitud = λ medida − λ referencia UV ± 1nm
longitud de Vis ± 3nm
onda
Error ± 2%
Exactitud Amedida − Areferencia Optima
%Error = × 100
fotométrica Areferencia Error ± 3%
Aceptable
% CV < 0.5%
Precisión SD Optima
%CV = × 100
x

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fotométrica % CV < 1.0%

Aceptable

Linealidad Graficar A medida vs Concentración. R ≥ 0.999

fotométrica Calcular “r” Aceptable

Luz difusa o Transmitancia

parasita < 0.01 ó
Absorbancia
>2

6. CUESTIONARIO

1. Consulte las partes que conforman un espectrofotómetro

2. Explique con qué periodicidad se hacen las verificaciones y calibraciones para los

espectrofotómetros UV- Visible.

3. ¿En qué se caracterizan las sustancias que cumplen con la ley de Lambert-Beer?
4. ¿A qué se debe que el nitrato de sodio absorba todas sus radiaciones incidentes a
longitudes de onda mayores a 390 nm. Hay otros compuestos que absorban a esta
misma longitud de onda?. Justifique su respuesta.
.ciencia direct

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