Вы находитесь на странице: 1из 6

12/7/2009

Анализ генов

Технология ДНК

Секвенирование
РНК

Northern-blot
Белок

Western-blot

рекомбинантной ПЦР

Southern-blot
RT–ПЦР

Гибридизация
Секвенирование

Изучение

ДНК Гибридизация in situ


in situ функции
Гистохимический
анализ

Изучение нуклеиновых кислот Выделение и очистка ДНК


Изучение ДНК: • Сбор биологического материала (любая
Определение мутантных генов → точная диагностика ядросодержащая клетка; бактерии, вирусы)
наследственных болезней (пренатально, постнатально); • Лизис клеток в гипотоническом растворе
Определение индивидуальных полиморфизмов →
геномный отпечаток (филиация, криминалистика);
• Лизис клеток/ядер при помощи детергентов
Определение чужеродной ДНК (бактериальной вирусной)
→ диагностика инфекционных заболеваний и уровня • Депротеинизация: протеазы и органические солвенты
инфекции.
Изучение мРНК:
• Осаждение ДНК при помощи спиртов
Тканеспецифическая экспрессия;
Определение уровня экспрессии (для нормальных и
патологических генов).

ДНК человека

Выделение и очистка РНК


Плазмида –
Ген для
Расщепление вектор для
клонирования
•Сбор биологического материала (нужная ткать, на рестриктазами клонирования

необходимом этапе, в определенных условиях)


Лигирование

•Лизис клеток при помощи детергентов в присутствии Рекомбининтная


ингибиторов РНК-аз Рекомбинантная ДНК – ДНК

это молекула ДНК Генетическая трансформация

•Депротеинизация при помощи органических солвентов


содержащая Клетка -
хозяин

•Выборочное осаждение РНК при помощи солей (LiCl, двуцепочечные


CH3COONa) фрагменты разного
происхождения
•Конечное осаждение РНК при помощи этанола Клонирование

Экспрессия
гена человека

1
12/7/2009

Этапы получения рекомбинантной ДНК


Цели методов
рекомбинантной ДНК 1. Выделение необходимого фрагмента и векторной ДНК

2. Расщепление фрагмента ДНК и вектора при помощи


рестриктаз
Клонирование последовательности / гена: 3. Лигирование фрагмента ДНК и ДНК вектора
Увеличение количества;
4. Генетическая трансформация – внедрение
Получение библиотек ДНК; рекомбинантных молекул в клетку - хозяин
Молекулярного анализа. 5. Клонирование молекул при помощи репликации in vivo

Экспрессия гена: 6. Экспрессия гена и получение белка

Анализ функции гена; 7. Скрининг трансформированных клеток


Получение белков.

Компоненты необходимые для Векторы для клонирования


клонирования in vivo Длина клонируемого Клетка-
Вектор
- ДНК для клонирования: ФР, кДНК фрагмента хозяин
До 10 kb (геномная ДНК, Бактерии,
Плазмиды
кДНК) дрожжи
- Вектор для клонирования: До 25 kb (геномная ДНК, Бактерии
Бактериофаги
- молекула ДНК способная выжить в чужой клетке кДНК)
- способна переносить чужеродные фрагменты ДНК Космиды 30-45 kb (геномная ДНК) Бактерии
- способна реплицироваться самостоятельно
BAC (Bacterial artificial До 300 kb (геномная ДНК) Бактерии
chromosome)
- Ферменты рестрикции - рестриктазы YAC (Yeast artificial 0,2-2.0 Mb (геномная ДНК) Дрожжи
chromosome)
- Клетка-хозяин
Вектор для клонирования:
- Система скрининга клеток - Содержит точку ori
- Может переностить чужие фрагменты (содержит СР)
- Набор ферментов для работы с ДНК - Содержит гены устойчивости к антибиотикам

Лигирование вставки в векторную ДНК


Бактериальная клетка

2
12/7/2009

Получение рекомбинантной ДНК Получение рестриктных фрагментов


ДНК для клонирования ДНК – вектор для клонирования при помощи рестриктаз
СР
Определение сайтов BamH I
рестрикции Определение
СРBamH I СРBamH I СРBamH I СР СР BamH I СР Hae III
СР Hae III

Расщепление при Расщепление при


помощи помощи ФР BamH I Hae III
рестриктазы
Необходимый фрагмент

Рестриктные
РФ РФ РФ РФ РФ фрагменты (РФ)

Лигирование
РФ1 Липкие концы РФ2 Липкие концы РФ3

Рекомбинантная
ДНК

Сайты, узнаваемые разными


рестриктазами A. ДНК пациента X
СР Hae III СР Hae III

Определение СР
Расщепление при помощи ФР

РФ1X РФ 2X РФ 3X

B. ДНК пациента Z
СР Hae III

Определение СР
Расщепление при помощи ФР

РФ 1Z РФ 2Z

RFLPs – ПДРФ – Полиморфизм Длины Рестриктных


Фрагментов (Restriction Fragments Length Polymorphism)
пациентов X и Z

-
ФР – фермент рестрикции – сайт-специфическая 12 kb
эндонуклеаза которая распознает и расщепляет дцДНК
10 kb 10 kb
СР – сайт рестрикции – палиндромный участок
узнаваемый ФР 8 kb

РФ – рестриктный фрагмент – фрагмент дцДНК 2,5 kb


6 kb 6 kb
полученный после расщепления при помощи ФР 5 kb
10 kb

6 kb 4 kb
ПДРФ – Полиморфизм Длины Рестриктных
5 kb
Фрагментов 2,5 kb
2 kb
RFLPs – Restriction Fragments Length Polymorphisms
+
Рестриктная карта – физическая карта указывающая M
расположение СР для разных рестриктаз

3
12/7/2009

ДНК человека

Клонирование человеческих Этапы получения кДНК


Плазмида –
генов in vivo (комплементарной ДНК)
ДНК)))
Ген для
клонирования
Расщепление
рестриктазами
вектор для
клонирования Проблемы
 Величина генома •Выделение Poly(A)+ РНК
человека;
Лигирование
 Регуляторные области •Гибридизация poly(A) с
Рекомбининтная отличаются от
ДНК бактериальных; oligo(dT)
 Содержат интроны,
Генетическая трансформация
которые не вырезаются в •Синтез первой цепи кДНК при
Клетка -
хозяин
бактериальных системах. помощи ревертазы

•Расщепление мРНК

Решение:
Решение: •Синтез второй цепи ДНК при
Клонирование
синтез кДНК на основе помощи ДНК-полимеразы
Экспрессия
гена человека мРНК соответствующей
изучаемому гену

Обнаружение ДНК
Практическая роль анализа ДНК:
ДНК:
1. Научная – секвенирование ДНК, получение
При помощи красителей При помощи меченных зондов библиотек генов, изучение экспрессии генов, изучение
контроля экспрессии, определение мутаций.

2. Определение носителей мутаций – предупреждение


Основной Флуоресцентные Радиоактивные
фуксин (холодные) (горячие) рождения детей с серьезными нарушениями.
(in situ)

Бромистый этидий
3. Генная терапия (внедрение нормального гена в геном
(в гелях) носителя мутации).
4. Определение чужеродной ДНК (вирусной,
бактериальной) при диагностике инфекций.
Необходимо знать
Большое количество изучаемую 5. Определение индивидуального полиморфизма при
ДНК последовательность филиации, в криминалистике.

4
12/7/2009

Клонирование ДНК = многократная Клонирование in vitro – ПЦР


репликация (полимеразная цепная реакция)
PCR (polymerase chain reaction
eaction))
in vivo in vitro
 Рекомбинантная  ПЦР / PCR
ДНК  В искусственных
 Необходима клетка- условиях
хозяин  Репликация с
 Необходим вектор использованием
содержащий ori искусственных
 Есть возможность компонентов
получения белка

Компоненты необходимые для ПЦР


Этапы ПЦР
- ДНК для анализа A. Приготовление реакционной смеси

- Специфичные праймеры B. Денатурация – ренатурация – элонгация 30-35 цикла

- Taq-полимераза •Денатурация ДНК при 96oC


•Охлаждение до температуры отжига праймеров
- dNTP •Элонгация при 72oC
- Аппарат для контроля температуры: C. Изучение амплифицированных фрагментов
- Электрофорез
- tº денатурации ДНК - Окрашивание
- tº отжига праймеров - интерпретация результатов
- tº для полимеризации ДНК

Библиотеки генов
•Геномные библиотеки – содержат
последовательности всего генома организма

•Библиотеки кДНК – содержат фрагменты


ДНК соответствующих мРНК клетки / ткани

•Хромосомные библиотеки – содержат


фрагменты определенной хромосомы

5
12/7/2009

Этапы получения
геномных библиотек
Этапы получения библиотек кДНК
•Выделение мРНК
•Выделение геномной
ДНК •Синтез кДНК

•Рестрикция ДНК •Лигирование


линкеров к концам
•Лигирование
рестриктных •Рестрикция кДНК
фрагментов с вектором и вектора
•Лигирование
•Генетическая
кДНК-вектор
трансформация
•Генетическая
•Селекция клонов трансформация
•Селекция клонов