Metabolic Engineering of Algae

Hola. soy Mike Burkart, profesor de química, y bioquímica en la UC San Diego, y

Director Asociado del Centro para la Biotecnología de Algas de California. Y estoy
aquí hoy para hablarte sobre la ingeniería metabólica de algas. Entonces, ¿por qué nos
interesamos en la ingeniería de algas? Básicamente, el metabolismo central de todas las
plantas y algas depende de las vías de pequeñas moléculas dentro del organismo, las
cuales inician con la obtención de energía a través de la fotosíntesis y el ciclo de Krebs,
pasando hacia el ciclo del ácido cítrico. Y todas esas vías canalizan la energía del
Sol hacia el crecimiento del organismo. Y queremos ser capaces de tomar alguna de
esas vías y usar esa energía para hacer moléculas que son importantes para
nosotros. Ahora, existe realmente una diferencia entre metabolismo primario y
secundario. Metabolismo primario son esas vías que son básicas para el sustento de la
vida, mientras que las vías del metabolismo secundario son las que realmente producen
moléculas que dan a un organismo alguna ventaja selectiva. Y esto puede incluir cosas
como pequeñas moléculas para el sabor o el olor o las toxinas, etc. Pero en ingeniería
metabólica estamos interesados en todas esas vías como posibles rutas para hacer
valiosas moléculas pequeñas.
Ahora, la ingeniería metabólica es esencialmente un modo de tomar los genes de
diferentes organismos y ponerlos en un sólo organismo receptor para conseguir que este
último fabrique la pequeña molécula que nos interesa. Y esto realmente comienza con el
dogma central de la vida, el cual es que el ADN se traduce en ARN que a su vez se
transcribe en proteínas, y esas proteínas luego pueden fabricar pequeñas moléculas, en
el caso de enzimas metabólicas. Y entonces lo que queremos es desactivar genes, o
poner nuevos genes, como un modo de modificar las vías de esos metabolitos. Y en
realidad esto empieza con decidir qué gen es de interés, cuál te interesa. Y lo puedes
clonar ya sea con PCR, o ya se puede realmente sintetizar genes, los ponemos en un
vector y luego tomamos ese gen y lo ponemos dentro en el genoma de nuestro
organismo receptor. OK, entonces, esto es básicamente lo que tratamos de hacer para
empezar a manipular estas vías básicas. Entonces, en principio, nos interesa, tratar de
hacer ingeniería en el metabolismo de ácidos grasos de algas, para cambiar las
moléculas y poder usarlas como bio-combustibles. Y efectivamente, lo que e importante
es el flujo de carbón que pasa a través del organismo. Iniciamos con C1s y estos vienen
como producto de la fotosíntesis a partir del Sol, estos pasan a ser glucosa para el uso de
la célula y luego se rompen en pequeños cabonos y en realidad es la vía del C2 la que
nos interesa, en término de la producción de ácidos grasos. Y estos Ácidos Grasos se
convierten en, ya sea Triacilglicéridos - siendo grasas o aceites - o en lípidos de
membrana. Y es sobre los Triacilglicéridos de lo que realmente les voy a hablar ahora
mismo.
La microalga es realmente una planta prometedora para fabricar para propósitos de bio-
combustibles. ¿Por qué querríamos hacer ingeniería de lípidos? Básicamente son
moléculas ideales en cuanto a su densidad de energía. Les consideran combustibles
compatibles porque pueden convertise en moléculas que se conviertan en gasolina o
diesel que ponemos en nuestros motores actuales. Y de hecho, el petróleo es en realidad
lípidos antiguos de algas milenarias.
Entonces, lo que tratamos de hacer es usar ingeniería metabólica para hacer moléculas
que tengan el perfil correcto. Y en particular estamos muy interesados en ácidos grasos
de cadena media. Y queremos estos ácidos porque tienen propiedades ideales
para producción de biodiesel. Los ácidos grasos de cadena más pequeña tienen mejor
calidad de flujo en frío. Básicamente, en el frío, los ácidos grasos de cadena larga
usados para fabricar biodiesel se tornan gelatinosos y eso es un rasgo
indeseable. Entonces, entre más corta la cadena que tengamos, mejores propiedades
tendremos que los hagan útiles como diesel. Y así, de nuevo, la idea es que queremos ir
al interior del organismo, encender genes de ingeniería, que provienen de otras rutas,
para tratar de fabricar los ácidos grasos de cadena media ideales. Y nos enfocaremos en
el sistema de la tioesterasa que fabrica cadenas medianas y en su ingeniería al interior
de nuestras algas hospederas. Esto ya se ha hecho en plantas vasculares y y se ha
llevado a cabo con cierto éxito. Muchas de esta enzimas que nos interesan, y se las
mostraré en un minuto, están diseñadas para fabricar estos ácidos grasos de cadena
mediana para convertirse en tricilglicéridos o aceites. Entonces, la idea detrás de este
proyecto es tomar la biosíntesis de ácidos grasos que ocurre en las algas, en el
cloroplasto del alga. Haremos ingeniería en la tioesterasa de una planta vascular la cual
es específica para fabricar ácidos grasos de cadena mediana, y veremos si podemos
derivar algunos de estos, que normalmente tienen 18 carbonos (C18) o más y tratar de
que el organismo haga ácidos grasos de cadena más corta. Algo entre C8 y C12 sería
ideal ¿ok? Y entonces estos pueden ser convertidos en biodiesels mejorados,
ok. Entonces, lo que hicimos fue iniciar con una lista de genes que salieron de diferentes
plantas vasculares. Primariamente estas plantas pusieron estos ácidos grasos de
cadena media y corta en sus semillas. Y así, nosotros sintetizamos 12 de estos genes. Y
también avanzamos más y sintetizamos el gen endógeno a partir de Chlamydomonas
reinhardtii que es el alga que nos interesa. Y sintetizamos todos estos. Hicimos ingeniría
en ellos dentro de un vector de expresión, - sé que ya Steve Mayfield les ha hablado de
cómo se hace esto - Y luego los introducimos en nuestra Chlamydomonas reinhardtii
usando una pistola de genes y el ADN es fijado a partículas de oro. Son bombardeados
dentro de las células y luego esas células crecen y son escogidas para que expresen el
gen que nos interesa. OK, lo que es bueno es que esto es una muy bien establecida
plataforma para introducir genes al alga y expresarlos, Y así podemos iniciar lentamente
su crecimiento, su cultivo y su escalamiento. Y entonces empezamos a ver si lo genes
introducidos tienen el resultado esperado en el metabolismo. Y lo que hacemos es
básicamente tomar estas células, y vamos a extraer los lípidos de ellas y vamos a hacer
metilésteres de ácidos grasos a partir de ellos, de los cuales les hablaré en un minuto. Y
esos son analizados con cromatografía de gases/espectrometría de masas. Así, estas son
grasas y aceites., son los triacilglicéridos que surgen de estos organismos. Lo que
hacemos es tratarlos con ácido y metanol, y lo cual nos resulta en metilésteres de ácidos
grasos. Tenemos una reacción de transesterificación para hacer un metiléster a partir de
nuestro ácido graso. Esto es ya un biodiesel y puede ser extraída en etanol y analizados
en un cromatógrafo de gas para poder decir exactamente qué tipo de molécula hemos
producido en el organismo.
Entonces, estos son los resultados de ese estudio. Tenemos todos estos 12 genes más la
tioesterasa endógena proveniente de la Chlamydomonas rheinhardtii y para nuestra
sorpresa ninguno de estos genes cambió el perfil de los lípidos en el alga. Sin embargo,
cuando sobre-expresamos el gen endógeno a partir de la biosíntesis de ácidos grasos en
Chlamydomonas, en realidad vemos un cambio en los fati-ácidos resultantes. Y aquí
está el perfil GC/MS Lo que vemos a partir de la ingeniería es una pequeña cantidad de
cadena extra corta, o debo decir ácidos grasos de cadena media. Vimos un ligero
incremento en los ácidos grasos C16 y un decremento en los ácidos grasos C18. Y esto
era un verdadero acertjjo para nosotros. La idea es, ¿qué está pasando en el
mundo? ¿Cómo es que sólo el gen endógeno hace una diferencia, y los genes
procedentes de plantas vasculares, están haciendo nada? Y, nuestra hipótesis para esto
es que en estas vías existen estas enzimas que tienen que juntarse tanto que forman
estas interacciones proteína-proteína, que determinan el resultado de la vía. Entonces, si
miras este dibujo, se ve que cuando hacemos ingeniería en una tioesterasa de planta
vascular, esta no es capaz de acercare suficiente a la proteína portadora, la cual está
pegada al ácido graso conforme este se va alargando, para crear un resultado viable. Sin
embargo cuando sobre-producimos la tioesterasa endógena en
Chlamydomonas, básicamente lanzamos más tijeras ahí. Lo que esto ocasiona es que se
une muy bien a la proteína portadora y empieza a alterar el resultado del perfil del ácido
graso.
Y lo que esto significa es que, quizá si pudiéramos empezar a ver las interacciones
proteína-proteína, potencialmente tendríamos modo de diseñar nuevas enzimas, dentro
de organismos donde podrían no haber sido compatibles antes, a través de entender esas
interacciones. Pero lo que queríamos hacer primero realmente es demostrar si
esta hipótesis era real. Y la manera en que hicimos esto es, en mi laboratorio, hacemos
mucha síntesis de moléculas, y en particular sintetizamos moléculas que actúan como
sondas que nos ayudan a entender cómo funcionan las enzimas. Así, lo que hacemos en
nuestro laboratorio es sintetizar estas 2 diferentes sondas. Estas son básicamente partes
de coenzima A; una que contiene cloroacrilato, y otra que contiene una alfa bromo-
amida. Y, básicamente, las "cosemos" a las proteínas portadoras. En este caso, lo que
hacen estas sondas es imitar un ácido graso elongado. Y entonces les agregamos los
dominios de tioesterasa, ya sea la proteína de tioesterasa endógena de las
Chlamydomonas, o la que proviene de la planta vascular. Si estas cosas se acercan
bastante como para comunicarse entre ellas, lo que pasa es que el lado activo de la
enzima va a atacar y a formar una proteína de fusión. Entonces , si se están realmente
comunicando y son catalíticamente interactivas podemos esperar que queden atrapadas
juntas y seríamos capaces de ver esto sobre un gel de la proteína. Con esta tecnología a
la mano, podemos luego ir a ver cómo esto está afectando el sistema natural. Esta es
una diapositiva que expone la demostración del reticulado en acción, donde tenemos a
la tioesterasa, en este caso la que proviene del alga Chlamydomonas
rheinhardtii, interactuado con la proteína portadora del alga misma. Y lo que vemos es
que, sin reticulante alguno, lo que vemos es una banda que proviene de la tioestersa
misma. Esta banda aquí, es un regulador de la tioesterasa que sabemos no es
reactiva. Cuando agregamos el primer reticulador vemos una pequeña cantidad de
proteína reticulada. Esta es la proteína portadora estando unida a la tioesterasa. Cuando
usamos el reticulador 2, este es un mucho mejor reactivo para esta reacción de
reticulación. Vemos la conversión completa de la tioesterasa hacia las especies
reticuladas. Así, ahora tenemos una herramienta que puede ayudarnos a observar
realmente las interacciones proteína-proteína. Y lo que puedo decir de esto es que es
una actualización, cuando agregamos la tioesterasa de la planta vascular no vemos
reticulación en absoluto. Lo que esto significa es que ahora tenemos armado un buen
ensayo, para poder empezarr a hacer mutagénesis en tioesterasas que son de otros
organismos para tratar de mejorar la interacción proteína-proteína. Y una vez que
tenemos una interacción funcional, creemos que estaremos en posibilidad de ya diseñar
nuevas vías de biosíntesis de ácidos grasos de algas.
Ok, bueno Mike. Muchas gracias por la charla. Obviamente, hay una gran variedad de
preguntas que nos vienen a la cabeza. Pero creo que lo primero y más importante es, y
este es un debate que se está dando ahora mismo, en términos de la totalidad de las
algas, ya sabes, los biocombustibles, ya sabes, áreas de investigación.
De acuerdo, te fijas en el metabolismo primario y este está fijando el CO2, eso está
bien, e introduciendo lípidos, etcétera. Nos mostraste que puedes manipular estas cosas
para crear diferentes, ya sabes, lípidos con cadenas más cortos que son biocombustibles
mejores. Pero en muchos aspectos, ya sabes, esas super sofisticada ingeniería molecular
que estás empleando para crear un combustible que vamos a quemar puede parecer un
poco como una pérdida de tiempo. Si vas a manipular una, ya sabes, una molécula
realmente bonita, entonces crea algo que tenga un gran valor. Así que cuáles son
algunas de las otras cosas que sé que tu laboratorio piensa cuando cuando estás
manipulando a estos tipos. >> Seguro, y ciertamente este es uno de los conflictos al
intentar crear de verdad biocombustibles renovables aptos para aplicaciones de
mercado. Necesitas tener productos con un valor añadido. Y prácticamente, el
combustible líquido es una de las cosas más baratas que posiblemente puedas crear. Así
que, en verdad estamos pensando en moléculas de un gran valor. Si sólo quieres pensar
en ácidos grasos, entonces hay una lista de ácidos grasos dietéticos que son realmente
importantes. Como los suplementos dietéticos. Cosas como los DHA y los EPA del
Omega-3. Esas son, sin duda, moléculas que encontramos muy interesantes. Hay otro
montón de vías metabólicas secundarias relacionadas con la biosíntesis de ácidos
grasos. Por ejemplo, los policétidos y péptidos, son vías metabólicas secundarias
que han derivado evolutivamente de vías biosintéticas de ácidos grasos. Así que, toda la
plataforma de la proteína transportadora y la interacción proteína-proteína se ha
conservado en estas vías. Y de esta manera podemos usar los principios que estamos
aprendiendo de los ácidos grasos y aplicarlos en estos otros metabolitos secundarios. Y
estas comprenden moléculas muy valiosas, tales como sabores y fragancias, antibióticos
o medicamentos contra el cáncer. En definitiva, moléculas que realmente querríamos
tener y ser capaces de producir en un alga huésped. >> Y esto, mencionaste que estos
están relacionados con las enzimas. No son exactamente enzimas, pero están
estrechamente relacionadas. Los ácidos grasos y los policétidos. Cuando hablábamos
antes de que había algún indicio de que quizás, eso es lo que las interacciones proteína-
proteína que limitan la capacidad para usar otras tioesterasas y ponerlas ahí, podría
tener algo que ver con eso. ¿Puedes explicar esto un poco mejor? >> Claro, por
supuesto. Esto no ha sido demostrado necesariamente en las algas, pero se ha probado
bien en ciertos cadenas de bacterias que vas a tener... Podrías tener dos vías
potencialmente. La biosíntesis de ácidos grasos que crea ácidos grasos y, por otro lado,
una biosíntesis de polipéptidos evolutivamente relacionada con esa biosíntesis de ácidos
grasos ocurriendo al mismo tiempo. Y de esta manera, la interacción proteína-proteína
realmente, un mecanismo para mantener estas vías separadas la una de la otra porque,
de verdad, no quieres estar creando estas raras moléculas quiméricas que no tienen
ninguna función. Así que la interacción proteína-proteína básicamente mantiene la
actividad bastante regulada entre las dos vías permitiendoles estar sepradas la una de la
otra de tal manera que en realidad puedan ser activadas o desactivadas o usarse en la
producción de ciertas moléculas.
Algo así a voluntad del medio. >> Ok. Y entonces, para plantas más altas, sin embargo,
este no parece ser el caso. Pero la idea quizás es así debido a que estas enzimas están
aisladas en compartimentos diferentes o sólo se activan en ciertas
circunstancias. ¿Porqué, cuál es la impresión acerca de que las plantas más altas acepten
en cierto modo diferentes tiro esteroides y las algas no? >> Hemos realizado un gran
número de estudios en mi laboratorio para intentar entender este principio
básico. Hemos cogido estos mismos genes y los hemos introducido en bacterias. Hemos
cogido genes de planta y los hemos introducido en ambos, bacterias y algas, para
intentar entender que sucedía. Así que, en el proceso evolutivo lo que ocurrió y lo que
descubrimos es que las algas en realidad divergieron de las plantas vasculares hace
bastante tiempo. Y sus proteínas portadoras, mutaron de tal manera que realmente no
son funcionalmente compatibles, al menos con los tiro esteroides. En realidad hemos
descubierto que hay algunas enzimas en esa vía de ácidos grasos que son
compatibles. Por ejemplo, la cetosintasa, que es otra enzima de ese ciclo de ácidos
grasos, es compatible. >> Si. >> Así que ahora estamos intentando entender el por qué
de esta diferente en ellas. Y cómo es que esa evolución llegó a estos cambios. De
acuerdo. Así que obviamente el objetivo final es ser capaz de manipular las algas de
manera que puedas crear cualquier ácido graso que quieras. O cualquier sabor de
fragancia, o cualquier de las guías de alto valor. Vale, y claramente la ingeniería que
estás utilizando va a lograr alguna de es estas cosas. Pero, ya sabes, como biólogo,
siempre soy curioso en cuanto a, ya sabes, el alga no está fabricando esos ácidos grasos
para que puedas cogerlos y quemarlos o puedas cogerlos y fabricar algún producto de
gran valor. Los están fabricando para una función celular que es importante para
ellas. Y, por eso, supongo que la primera pregunta es, ¿existe algún fenotipo al reducir
estas cosas del C18 al C12? Y si aún no has visto uno, ¿qué es lo que crees que va a
pasar cuando comprimas realmente un alto porcentaje del aceite en algo pequeño? >>
Eso nos supone verdaderamente una preocupación. No vemos un fenotipo más relevante
en eso del que vimos en el cambio metabólico. Y ten en cuenta, que el cambio fue en
realidad bastante conservativo, así que estábamos creando más C16 que C18. Y eso no
cambia mucho, digamos, en la integridad de las paredes celulares o, en lo lípidos que
hay en el organismo. No obstante, ciertamente si comienzas tomando el grupo principal
de ácidos grasos del C18, y convirtiéndolo en C10 esperarías ver algún cambio
fenotípico significativo. Te preocuparías por la integridad de la membrana celular y, por
eso, estas son cosas en las que verdaderamente pensamos. Y una manera de abordar esto
es ver si esos tipos de metabolitos modificados se pueden empujar en una cierta
dirección. Por ejemplo, se podrían convertir en triglicéridos y juntarse en cuerpos
lipídicos o o en determinados orgánulos que almacenasen triglicéridos. Eso es lo que
algunos organismo hacen seguro. Conocemos algunas plantas marinas que hacen
eso, cuando inyectan estas medio-cadenas de ácidos grasos en las semillas. Pero la otra
cosa en la que realmente tenemos que pensar es cuáles van a ser los resultados en la
producción. Si estamos intentando cultivar un estanque de estos chismes, cómo va a
afectar eso, cómo esos organismos interactúan pongamos con especies invasivas o
depredadores. Cosas como esas. Estas son cosas realmente primordiales para crear estas
alternativas realistas. >> Por supuesto. Pero eso en realidad nos lleva a otro punto, que
es ya sabes, en cierto modo... sé que tenías que mantener esta conferencia de manera
sencilla. Así que sólo hablaste sobre que vamos a convertir los ácidos grasos para crear
combustibles superiores. Pero a decir verdad, al manipular estas cosas también puedes
proporcionar al alga moléculas protectoras. Así que una de las cosas que mencionaste en
el metabolismo secundario que se utiliza con bastante frecuencia en algas al igual que
en plantas más altas, son pequeñas moléculas que actúan como defensa frente a otros
organismos. Sé que se te ocurren algunas de esas y quizás podrías simplemente
mencionar algunas de ellas y su manera de actuar. >> Claro, por supuesto. Una de las
cosas en las que hemos estado pensando durante mucho tiempo, es que algunas de estas
vías crean moléculas que se han denominado como antibióticas o antifúngicas. Y resulta
que, gracias a nuestra colaboración con la compañía Sapphire Energy, han descubierto
que en realidad estas ciertas cepas de hongos son muy perjudiciales para el cultivo a
gran escala de algas. Y por eso, una de las cosas que hemos estado sopesando es diseñar
ciertas vías anti-hongos en las algas y utilizarlo como defensa frente a estas especies
invasivas. Así que la idea es que o bien tendrías un metabolismo antifúngico que
podrías activar selectivamente, o podrías añadir esta cepa a un gran estanque si,
digamos, una infección fúngica empezara a ocurrir. Y por eso, creemos que podemos
emplear estos como un tipo de estrategia protectora de cultivos para el cultivo a gran
escala de algas. >> Así que, estos son vías de origen natural que tienen lugar en
conjuntos de encimas similares en otros organismos para proporcionarles protección
frente a hongos. Y la idea es introducirlas en la producción de cepas de algas. >>
Absolutamente. >> Bien, ¿sabes qué? Vamos a finalizar la charla ahí. Te deseo mucha
suerte en vuestra investigación. Ya sabes, espero que crees algunos productos de gran
valor que huelan realmente bien y quizás los veamos en el mercado en un corto plazo. Y
después a largo plazo, obviamente que este tipo de biología sintética, la ingeniería de
algas, no proporcione realmente un camino hacia la fabricación de combustibles
superiores. Gracias por la charla y mucha suerte con la investigación. >> Gracias.