DISCUSIÓN:
grupos polifuncionales de alto peso
Inicialmente se procedió a conocer el
principio fundamental y partes del HPLC y
posteriormente se procedió a preparar los
patrones de cafeína/ácido benzoico
correspondientes, para así obtener la curva
de calibración y obtener la concentración de
cafeína de la muestra de cocacola y té
negro.
Solución patrón
En química, una solución patrón es la
disolución de una sustancia utilizada como
referencia al momento de hacer una
valoración o estandarización. (Moore, 1978).
Curva de calibración
La curva de calibrado se construye midiendo
la señal analítica en cada uno de los
patrones previamente elaborados. (Higson,
2007).
Teniendo una muestra de concentración
desconocida, se puede medir la señal
analítica y estimar la concentración por
extrapolación sobre la gráfica obtenida.
(Higson, 2007).
Principios de la técnica
En la cromatografía líquida, la fase móvil es
un líquido que fluye a través de una columna
que contiene a la fase fija. La separación
cromatográfica en HPLC es el resultado de
las interacciones específicas entre las
moléculas de la muestra en ambas fases,
móvil y estacionaria. (Christian, 2009).
A diferencia de la cromatografía de gases, la
cromatografía de líquidos de alto
rendimiento (HPLC, de high-performance
liquid chromatography) no está limitada por
la volatilidad o la estabilidad térmica de la
muestra. (Valcarcel, 1988).
La HPLC es capaz de separar
macromoléculas y especies iónicas,
productos naturales lábiles, materiales
poliméricos y una gran variedad de otros
molecular. Con una fase móvil líquida
interactiva, otro parámetro se encuentra
disponible para la selectividad, en adición a
una fase estacionaria activa. (Christian,
2009).
La HPLC ofrece una mayor variedad de
fases estacionarias, lo que permite una
mayor gama de estas interacciones
selectivas y más posibilidades para la
separación.(Moore, 1978).
Fases estacionarias y móvil
Las partículas son de sílice de alta pureza,
con bajo contenido de trazas de metales, y
su diámetro típico es de 5 a 10 µm; sin
embargo, las partículas de 3 µm se están
usando cada vez más en la cromatografía de
alta velocidad (que se describirá adelante).
Los tamaños de poro están en el intervalo de
60 a 100 Å, aunque se usan tamaños de
poro de 300 Å o más con biomoléculas más
grandes, que les permiten penetrar los
poros. La mayor parte de las separaciones
con HPLC se lleva a cabo en el modo
líquidolíquido (cromatografía de partición),
aunque la cromatografía de adsorción es útil
para muchas aplicaciones. Las fases
estacionarias líquidas se encuentran
cubriendo a las partículas o químicamente
enlazadas. (Pasto, 1981).
La fase móvil se mueve en torno a las
partículas y el soluto se difunde entrando a
la fase móvil estancada dentro de los poros
e interactúa con la fase estacionaria; a
continuación, se difunde saliendo del poro y
entra a la fase móvil. (Moore, 1978).
El uso de partículas pequeñas reduce al
mínimo la longitud de la trayectoria de
difusión, y en consecuencia el
ensanchamiento de la banda. (Higson,
2007).
La de sílice tiende a disolverse a un pH
mayor que 8, y así para la separación de
bases se usan partículas poliméricas
entrecruzadas, por ejemplo, de poliestireno
o polimetacrilatos. Pueden resistir fases
móviles fuertemente básicas, pero tienen
eficiencias algo menores. Las partículas de
sílice tienen grupos silanol, -SiOH,
superficiales. Éstos se usan para unir
químicamente fases estacionarias mediante
reacciones de silanización con clorosilanos.
(Pasto, 1981).
Un aparato de cromatografía de líquidos de
alta eficiencia se compone de cuatro partes
principales:
1. Sistema de suministro de fase
móvil.
Este sistema tiene una bomba para llegar a
las altas presiones que se requieren, y suele
contener algún medio para producir un
gradiente de elución (es decir, cambiar
concentraciones del eluyente, por ejemplo
su disolvente, sus sales o su H+). (Pasto,
1981).
Los depósitos de disolvente se pueden llenar
con varios disolventes de diferentes
polaridades, siempre que sean miscibles, o
bien se pueden llenar con soluciones de pH
diferente que se mezclan en el volumen
amortiguador. Los disolventes deben ser
puros y estar desgasificados para evitar la
formación de burbujas, toda vez que
entorpecen el correcto funcionamiento de la
válvula de no retorno o pueden entrar a la
cámara del pistón. Además, generan
máximos falsos cuando llegan a pasar por el
detector. El problema es más grave cuando
se mezclan disolventes (en general,
acetonitrilo o metanol con agua), porque la
solubilidad de aire en mezclas es menor que
en la misma proporción de disolventes
puros; cuando se mezclan disolventes
saturados con aire, también se liberan
burbujas.(Moore, 1978).
2. Sistema de inyección de muestra.
Un sistema habitual de inyección. Se
compone de un anillo de acero inoxidable
con seis conexiones diferentes, una de las
cuales va a la columna. (Bolaños, 2003).
Las muestras se pueden introducir en forma
manual a la válvula con una jeringa que llena
el circuito de la muestra. Hoy se usan, de
manera sistemática, válvulas automáticas de
muestreo en las que las muestras se toman
de un muestreador automático y su
operación no requiere atención. (Valcarcel,
1988).
La principal limitante de los inyectores de
válvula es que el tamaño de la muestra es
fijo, y se debe cambiar el circuito para variar
la cantidad de muestra inyectada. (Pasto,
1981).
3. Columna.
Los tramos rectos de tubo de acero
inoxidable permiten la construcción de
columnas. Son de varios diámetros y
longitudes, los cuales dependen de la
aplicación. En general, el diámetro
interno tiene 3.9 o 4.6 mm. (Christian,
2009).
A continuación, se describirán algunas
reglas para seleccionar las fases
estacionarias y móviles en columnas. En
general, no es necesario controlar la
temperatura en la cromatografía líquido-
sólido, a menos que deba trabajarse a
temperaturas elevadas; pero en general
sí se requiere para otras formas de
cromatografía de líquidos (líquido-
líquido, exclusión de tamaño,
intercambio iónico). (Valcarcel, 1988).
4. Detector
En la cromatografía de líquidos de alta
eficiencia se requieren detectores con
gran sensibilidad, en general para
cantidades de microgramos a
nanogramos. Los detectores que más se
usan son refractómetros y detectores de
ultravioleta (UV). El detector de
refractómetro diferencial, llamado con
frecuencia “detector universal”, mide
cambios en el índice de refracción del
eluyente causados por la presencia de
solutos al salir de la columna. (Laitinen,
1982).
El detector ultravioleta tiene mucho
mejor selectividad, alrededor de 108
g/mL (0.01 ppm). No es sensible a la
temperatura, cuesta relativamente poco
y se puede usar con gradiente de
elución. Es sensible a una gran cantidad
de compuestos orgánicos. (Skoog,
2005).
Una característica común de los
instrumentos de HPLC es un detector de
serie de diodos, La adquisición
instantánea del espectro de absorción
proporciona una poderosa herramienta
cualitativa. La fuente de radiación focal
pasa a través de la celda de detector de
flujo y es dispersada por una rejilla a una
serie de fotodiodos para su
detección.(Bolaños, 2003).
La capacidad para resolver espectros
matemáticamente solapados
proporciona capacidad adicional de
separación cuando un máximo
cromatográfico consiste en dos o más
analitos. Los detectores de fluorescencia
pueden tener mejor selectividad que los
de absorción ultravioleta porque son
menos los compuestos que fluorescen
que los que absorben. Se alcanzan
sensibilidades cuando menos iguales, y
quizá mejores que las del detector de
UV, dependiendo de la geometría de la
disposición fuente de excitacióndetector,
la intensidad de la fuente y la eficiencia
cuántica del fluoróforo. (Pasto, 1981)
El detector amperométrico es adecuado
para detectar sustancias electroactivas,
y ha encontrado muchos usos en
aplicaciones biológicas, por ejemplo, en
la separación y detección de trazas de
catecolaminas en el cerebro mediante
HPLC. (Harvey, 2000).
BIBLIOGRAFÍA:
 Serie Académicos CBS.
Cromatografía de gases y de líquidos
de alta resolución México 2000. pag.
215-231 255-305
 Serrano, L. Apuntes química
cromatografía. [En línea] Sitio de
estudiantes y docentes universitarios
Copyright 1999-2001 Disponible en:
http://www.lafacu.com/apuntes/quimi
ca/cromatografia/default/.htm
 Valcarcel, M. (1988). Técnicas
analíticas de separación. Editorial
Reverté. España. pp 335-336, 597-
613.
 Pasto, D & Johnson, R. (1981).
Determinación de estructuras
orgánicas. Reverté, Madrid
 Laitinen, H & Harris, W. (1982).
Análisis químico. (4ta ed.) España.
Editorial Reverté.
 Bolaños, V. (2003). Química analítica
cuantitativa, (2da ed.). México.
 Christian, G. (2009). Química
Analítica. (6ta edición). México:
McGraw-Hill.
 Skoog, D., West, D., Holler, J.,
Crouch, S., (2005). Fundamentos de
Química Analítica, Internacional
Thompson Editores, México.
 Higson, S. (2007). Química Analítica.
1ª ed.
 Harvey, D. (2000). Química Analítica
Moderna. Ed. McGraw Hill.
 Moore W. (1978). Química Física.
Segunda edición. España.
 BURGET,C.A.; GREEN,L.E. and
BONELLI, E.J. Chromatographic
Methods in Gas Analysis. Hewlett
Packard. USA. 1979
 CRIPPEN, Raymond C. Identification
of Organic Compounds with Aid of
Gas Chromatography. Mc Graw-Hill.
USA. 1973.
 EWING, Galen. Instrumental
Methods of Chemical Analysis.
3rd Edition. Mc Graw-Hill. USA. 1969
CONCLUSIONES:

 Comprendimos que, el
principio de este tipo de
cromatografía es el resultado
de las interacciones
específicas entre las
moléculas de la muestra en
ambas fases, móvil y
estacionaria.
 Aprendimos el manejo y los
cuidados de un equipo HPLC.
 Determinamos que, la
cromatografía de líquidos de
alto rendimiento no está
limitada por la volatilidad o la
estabilidad térmica de la
muestra.
 Comprobamos que, el ácido
benzoico es más sensible en
rango de longitud de onda de
250-300 nm.
 Determinamos que la
muestra de cocacola posee
(concentración de cafeína) de
cafeína