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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

FISIOLOGÍA CELULAR

PRÁCTICA 1. ASPECTOS GENERALES DEL MANEJ DE ANIMALES DE LABORATORIO Y VIÁS DE ADMINISTRACIÓN”

DR. Fidel de la Cruz López

Dra. Linda Garcés Ramírez

M. en C. Oriana Hidalgo Alegria

EQUIPO 3:

Buendía Buendía Adriana

Martínez Guzmán Mariel Izbeth

Meza Castrejón Gibran de Jesús

Castro García Eduardo

Fecha de entrega: 18/04/19

INTRODUCCIÓN

El progreso científico ha promovido la introducción e incremento del uso de animales de laboratorio como una herramienta fundamental para la experimentación y enseñanza, de tal forma que ha aportado avances en investigación biomédica y producción de reactivos biológicos (vacunas, sueros heterólogos y fármacos).

Los experimentos con animales se fundamentan en el hecho de considerar a otras especies animales como modelos en miniatura de los problemas humanos, sin los cuestionamientos éticos que conlleva experimentar con humanos. Se entiende que un experimento empieza cuando se inicia la preparación del animal para su uso y termina cuando se acaban las observaciones a realizar sobre el mismo.

Se realizan experimentos con animales en tres campos principales: la docencia, la industria y la investigación; su uso como reactivos biológicos en el contexto de la investigación científica ha aportado numerosos beneficios y tiene por objetivo generar conocimiento científico que permita mejorar el futuro del hombre y/o de otros seres vivos. Pero para que esta experimentación sea científica debe cumplir una serie de condiciones y garantías en cuanto a la manera de llevarla a cabo y sobre la nueva información que va a generar. En este sentido, hay que tener en cuenta que sólo se deben usar animales cuando las respuestas a las cuestiones científicas no pueden obtenerse de otra manera. En otras palabras, utilizaremos animales en la investigación biosanitaria cuando necesitemos conocer qué pasa en el conjunto de un organismo vivo, y está claro que no podemos realizar ensayos en humanos por cuestiones éticas.

Entre otros muchos ejemplos, han contribuido de manera directa a incrementar la esperanza de vida del hombre, en la producción y validación de vacunas, en el estudio de las enfermedades, etc. En este sentido los animales actúan como modelos de diferentes enfermedades.

CARACTERÍSTICAS DE ANIMAL DE LABORATORIO

● Es engendrado y producido en condiciones controladas

● Mantenido en un entorno controlado

● Posee claros antecedentes genéticos y microbiológicos

● Existe una comprobación sistemática de estos antecedentes

Sin embargo, la utilización de animales en la investigación conlleva una serie de responsabilidades. Con el fin de lograr una buena práctica con los animales es necesario establecer una serie de normas o reglamentaciones. En México la norma que se encarga de regular el uso de animales de laboratorio es la Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999.

De acuerdo con esta norma en el apartado 4.6 comprende la identificación y registro se debe de considerar principalmente el tipo de especie con la que se va a trabajar o circunstancia, de aplicación rápida y de ser posible indoloros. De resultar invasivos, capaces de inducir molestias considerables al sujeto, deberán emplearse sustancias o fármacos sedantes o anestésicos a juicio veterinario. Los tipos de marcaje se divide en dos permanentes y temporales, en el primer tipo se encuentran: tatuaje, muesqueo, aretaje y pulseras, mientras que en el segundo tipo están las tintas y pinturas en diferentes partes del cuerpo.

La administración idónea de un medicamento pretende que el fármaco pueda llegar a la zona del organismo donde se requiere para ser activo, la biofase. En la mayoría de los casos, este acceso no se produce de manera directa e instantánea, sino que el fármaco presenta un tránsito específico por el organismo que tendrá implicaciones en cuanto a la intensidad y duración de la acción.

La eficiencia terapéutica estará influida entonces por la vía de administración y por la formulación del fármaco.

Las vías de administración se pueden clasificar en:

1. Vías enterales. Permite el acceso del fármaco de forma fácil. Su absorción se lleva a cabo a través del estómago e intestino. Algunas de esta son: Vía oral, vía rectal, vía intragástrica.

2. Vías Parenterales. Consiste en la administración de fármacos mediante inyección, utilizando jeringas y agujas. De esta forma el medicamento, se pone en contacto directo con el medio interno. Es una vía de absorción rápido. Algunas son: vía subcutánea, vía intravenosa, vía intraperitoneal.

Un barbitúrico es una sustancia nociva que actúa como depresor del sistema nervioso central con un efecto sedante y que en dosis elevadas presenta síntomas como una intoxicación por alcohol, el pentobarbital sódico es un barbitúrico de fácil absorción Se concentra en el hígado y riñón y posteriormente alcanza un equilibrio en el cerebro a los 4-5 minutos. Es utilizado para problemas del sueño, inducir el sueño antes de una operación y para tratar convulsiones en casos de emergencia.

Los reflejos que pueden ayudarnos a determinar el efecto del Pentobarbital sódico son: reflejo de enderezamiento y reflejo flexor. Donde el reflejo de enderezamiento actúa siempre que, estando de pie, se tiende a perder esta posición: los músculos erectores de la columna vertebral y los extensores de las piernas, cuando comienzan a flexionarse, despiertan un reflejo miotático que mantiene la posición erecta. Mientras que el reflejo flexor es respuesta de retirada ante un estímulo nocivo.

OBJETIVOS

● Aprender el marcado adecuado de los animales para su identificación

y la realización del experimento

● Manejo de animales de laboratorio (especialmente la rata)

● Aprender a administración de pentobarbital sódico por vías enterales

y parenterales

● Importancia del marcaje en los animales

● Calcular el volumen de pentobarbital sódico a administrar

● Determinar la vía de administración más efectiva como anestésico

FUNDAMENTO

En laboratorios de investigación los animales que más son utilizados como modelos experimentales son los ratones y las ratas, esto es debido a múltiples factores; fácil cuidado y mantenimiento, bajos costos de manutención, eficiencia reproductiva y por su vida relativamente corta es excelente para uso en ensayos de toxicología, farmacología, así como diversas investigaciones. El genoma de la rata consta de 2750 millones de pares de bases mientras que el del humano tiene 2900 millones de pares de bases, por lo que se ha observado que la rata tiene aproximadamente el número de genes que el humano, de tal forma que los genes conocidos a enfermedades humanas tienen su correspondiente gen en el genoma de la rata, por esta razón es utilizado en investigaciones. Un factor importante que considerar para la realización de la práctica es la temperatura central de la rata es de 38-39°C, que es similar a la del humano 36-37°C.

La vía de administración de fármacos se realiza en función del tiempo de acción en el que se requiere que actúe el fármaco, así como las características del fármaco, si se requiere que el fármaco sea de acción rápida se selecciona una vía de administración que permita su llegada a la circulación sanguínea y que no tenga que ser metabolizada por medio de otros órganos antes de llegar a la circulación sanguínea.

Para iniciar la práctica se distribuirá aleatoriamente 18 ratas en 6 equipos, mediante la generación de números aleatorios con una calculadora científica, por medio de la función Ran#. La finalidad de esta distribución es para obtener datos homogéneos.

La realización de la práctica se considera como un experimento agudo por tal motivo se marcará a las ratas mediante el método de manchado, que consiste en aplicar un colorante en diferentes regiones del cuerpo lo que permite la identificación de cada una. Una vez identificadas se procese a pesar las ratas.

Se utilizará pentobarbital sódico, el cual es un anestésico de tipo barbitúrico de duración corta (1hr), pertenece a los medicamentos de tipo depresor del sistema nervioso central. Induce somnolencia, alivian la tensión, sedación, es

hipnótico y en sobredosis puede producir la muerte. El pentobarbital sódico tiene una composición química de carácter lipofílico, lo que permite ser administrado por tres vías diferentes. La concentración de la solución de pentobarbital sódico es de 63 mg/Kg y la dosis anestésica en la rata es de 35 mg/kg. De modo que solo se calculara el volumen de pentobarbital sódico a administrar, dependiendo de cuanto pese la rata. Se tomará la temperatura colonal de la rata en su momento basal y después de la aplicación del anestésico, cada 5 minutos durante 25 minutos. El efecto anestésico se evaluará mediante tres vías de administración: Intraperitoneal, subcutánea e intragástrica. La acción de este fármaco debe alterar el sistema interno, por lo que debemos notar cambios en la temperatura central, el reflejo de enderezamiento y el reflejo flexor. La temperatura central es una variable regulada y se mantiene constante dentro de un límite estrecho, es la temperatura interna de un cuerpo, un cambio significativo podría ser indicio de una falla en su centro integrados, el hipotálamo. El reflejo flexor entra en acción al recibir un estímulo externo involucrando todos los músculos flexores de los miembros y requieren de la activación de las neuronas motoras en varios segmentos de la médula espinal. El reflejo de enderezamiento busca restablecer la postura correcta de un individuo que ha sido modificada de dicha posición, orientándose de la posición de su cabeza y su percepción visual, se integra en el mesencéfalo.

METODOLOGÍA

METODOLOGÍA

RESULTADOS

RESULTADOS Figura 1. Porcentaje de pérdida del reflejo de enderezamiento sobre tiempo, por efecto del pentobarbital

Figura 1. Porcentaje de pérdida del reflejo de enderezamiento sobre tiempo, por efecto del pentobarbital sódico administrado en tres vías: vía intragástrica, vía intraperitoneal y vía subcutánea. Los puntos, cuadros y triángulos representan la media. Los asteriscos indican diferencia significativa en los valores, mediante prueba Xi cuadrada.

*P<0.05, en vía intraperitoneal en el intervalo 5-25 min vs basal

*P<0.05, en vía subcutánea en el intervalo 20-25 min vs basal

Figura 2. Porcentaje de pérdida del reflejo flexor sobre el tiempo, ​ por efecto del

Figura 2. Porcentaje de pérdida del reflejo flexor sobre el tiempo, por efecto del pentobarbital sódico administrado en tres vías: vía intragástrica, vía intraperitoneal y vía subcutánea. Los asteriscos indican diferencia significativa en los valores, mediante prueba Xi cuadrada.

*P<0.05, en vía intraperitoneal en el intervalo 5-25 min vs basal

Figura 3. Efecto del pentobarbital sódico sobre la temperatura colonal en ratas, administrado por tres

Figura 3. Efecto del pentobarbital sódico sobre la temperatura colonal en ratas, administrado por tres vías diferentes (intraperitoneal, subcutánea e intragástrica) en un lapso de 25 min. Los datos representan la media ± el error estándar. Prueba estadística: ANOVA bifactorial de medias repetidas, n=6. Prueba post hoc: Student-Newman-Keuls. Los asteriscos (*) representan la diferencia significativa con respecto a la temperatura basal.

P<0.05, min 15-25 vs basal. Vía subcutánea. P<0.05, min 10-25 vs basal. Vía intragástrica. * P<0.05, min 5-25 vs basal. Vía intraperitoneal.

DISCUSIÓN

Efecto de pentobarbital sódico en el reflejo enderezamiento

En la gráfica (figura 1) de porcentaje de pérdida de reflejo enderezamiento indica que en la vía intragástrica presentó el porcentaje mínimo en la pérdida de este reflejo enderezamiento solo el 20% se perdió en el intervalo de tiempo 10-25 min. Mientras que en la vía subcutánea se perdió el reflejo enderezamiento en un 80% entre el intervalo de tiempo 20-25min, sin embargo, teniendo un cambio significativo. Mientras que en la vía intraperitoneal hay una diferencia significativa del intervalo de tiempo 5-10 min con un 80% de pérdida y de 20-25 min con la pérdida de reflejo enderezamiento de un 100%, se nota que

en el minuto 5 comienza el periodo de latencia del efecto anestésico de pentobarbital sódico solo en esta vía intraperitoneal se presentó el mayor porcentaje de efecto anestésico, notando que conforme avanzaba el tiempo la pérdida de dicho reflejo iba en aumento. Esto se debe a que en cada vía llegó una cantidad distinta del anestésico, así como la velocidad en que llegó al órgano integrador del reflejo enderezamiento, que es el mesencéfalo. El reflejo enderezamiento es aquel en el que las ratas buscan posarse en sus cuatro patas (posición prona) después de haber sido desequilibradas puestas en posición supina. Esta primera evaluación con el porcentaje de pérdida de reflejo flexor nos dice qué tan rápido actuó el anestésico, sin embargo, la pauta para determinar la efectividad nos lo indica la evaluación sobre el reflejo flexor.

Efecto de pentobarbital sódico en el reflejo flexor

El reflejo flexor al ser un reflejo defensivo que es producido por la contracción de los músculos flexores donde se hizo un estímulo nocivo (doloroso) y analizando la gráfica (Figura 2) se muestra el porcentaje de pérdida de reflejo flexor obtenido en el experimento, se observa que en el minuto 5 comienza el periodo de latencia del anestésico. Al transcurrir un tiempo en las tres vías de administración aumenta la pérdida de reflejo flexor. Es evidente que en la vía intraperitoneal nuevamente se obtiene los porcentajes más altos de pérdida de reflejo flexor, sin embargo, en la vía subcutánea es la segunda en presentar efecto del anestésico, pero no de la forma que se requiere. En cuanto la vía intragástrica fue la de menor efectividad. La cantidad de fármaco llegó en diferente cantidad y distinta velocidad a la médula espinal dado que es el órgano controlador del reflejo flexor. La última evaluación nos confirma que la vía adecuada es la intraperitoneal.

Efecto del pentobarbital sódico en la temperatura colonal

Los anestésico e hipnóticos son fármacos depresores del sistema nervioso central. Un fármaco anestésico disminuye la actividad, modera la excitación e inhibe el dolor, mientras que el fármaco hipnótico produce somnolencia y facilita el inicio y el manteniendo de un estado de sueño. El pentobarbital sódico es un barbitúrico de acción corta, tiene un efecto depresor no selectivo del sistema nervioso central. Actúa potenciando la acción GABA, provocando hiperpolarización que da como resultado sedación, inducción del sueño y depresión respiratoria.

En la gráfica (Figura 3) efecto de pentobarbital sódico sobre la temperatura colonal, conforme va transcurriendo el tiempo la temperatura colonal de las ratas va disminuyendo en las tres vías de administración. La disminución en la temperatura se debe a que el pentobarbital es un inhibidor del sistema nervioso central provocado al estimular el sistema inhibitorio del neurotransmisor en el cerebro (GABA). La regulación de la temperatura es realizada por el hipotálamo, dependiendo de la perturbación, este actuará para bajar o aumentar la temperatura corporal hasta volver al estado estable. Por lo tanto, sí existe una disminución de la temperatura, quiere decir que el pentobarbital sódico ha llegado hasta el sistema nervioso central y al hipotálamo, provocando

un bloqueo en las vías de respuesta. De modo que la gráfica (figura 3) nos dice que la vía intragástrica la temperatura no tuvo diferencia significativa como para decir que, si hizo efecto, esto se debe a que la absorción no es rápida en esta vía dado que el fármaco de tipo anestésico. La vía intragástrica es una vía enteral lo que quiere decir que el pentobarbital sódico se deposita en el estómago, para ser absorbido en el intestino, llega al hígado y posterior a la circulación sanguínea de tal forma que pueda llegar al hipotálamo, por esta razón es una vía lenta para el efecto de anestesia. En la vía subcutánea solo hay una diferencia significativa hasta el minuto 25, como el pentobarbital sódico es de naturaleza liposoluble este al ser administrado en un lugar que contiene grasas se disuelve y como esta parte del tejido también contiene irrigación sanguínea el fármaco va pasando lentamente a la circulación, por lo cual su efecto se retarda. Mientras en la vía intraperitoneal se obtuvo una diferencia significativa de temperatura desde el minuto 5 hasta a el minuto 25 con respecto a su basal, esto se debe a que le perineo es una membrana muy irrigada de vasos sanguíneos, por tanto, presenta una absorción rápida y esto hace que el pentobarbital sódico puede pasar directamente a torrente sanguíneo y por ende al sistema nervioso central para llegar al hipotálamo con rapidez y concentración de anestésico. Por ello se es que tanto el reflejo flexor como el reflejo enderezamiento presentan el mayor porcentaje de pérdida de reflejos en la vía intraperitoneal.

CONCLUSIONES

● Al aplicar el fármaco pentobarbital sódico, la rata no pudo regular su temperatura a partir del minuto 5 y bajó considerablemente en comparación con la basal

● La dosis administrada de pentobarbital sódico fue de efecto anestésico, para la vía intraperitoneal

● La ausencia del efecto flexor confirmaba un estado de anestesia inducido por el pentobarbital sódico

● La absorción efectiva del fármaco se ve reflejado en el decremento de la temperatura colonal, ausencia del reflejo flexor y de enderezamiento

● La vía intraperitoneal es la única vía para lograr un efecto anestésico

REFERENCIAS

Nicandro Mendoza Patiño, Farmacologia medica / Medical Pharmacology (2008), Editorial: Médica panamericana, pág.834.

Abraham Quezada Domínguez, Introducción Al Manejo de Animales de Laboratorio: Roedores Y Pequeñas Especies (1997), Editorial:

Universidad Autónoma de Yucatán, pág.6

Saénz Campos Desirée “Principios de Farmacología General y Administración de Fármacos” 1°Ed. San José. Costa Rica. Editorial de la Universidad de C.R. páginas 39-41

Programa de estudios teórico-práctico 1994-1995. Manuales Departamentales. Depto. De Farmacología, Facultad de Medicina, UNAM.