I.

INTRODUCCIÓN

Desde hace muchos años se ha usado el color como ayuda para

reconocer las sustancias químicas; al reemplazar el ojo humano por otros
detectores de radiación se puede estudiar la absorción desustancias, no
solamente en la zona del espectro visible, sino también en ultravioleta e
infrarrojo.

Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de

energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de
onda de la radiación, y a las mediciones a una determinada longitud de onda.
Para entender la espectrofotometría necesitamos repasar la terminología que se
utiliza para caracterizar la energía radiante, considerando en forma elemental la
interacción de la radiación con las especies químicas y comprender de manera
general como funcionan los instrumentos.

1.1. OBJETIVOS

 Comprender la diferencia entre transmisión y absorción.

 Conocer la ley de Lambert-Beer.
 Elaborar una curva estándar o de calibración a partir de un espectro de
absorción.
 II. REVISION DE LITERATURA

2.1 LA ESPECTROFOTOMETRIA

El espectro fotometría es el conjunto de técnicas que utilizan la luz

para medir concentraciones químicas. El articulo más citado de la revista
Analytical Chemistry desde 1945 hasta 1999 es un procedimiento usados
por los bioquímicos para medir azucares.

2.1.1 Trasmitancia
. Es conveniente describir la luz tanto en términos de partículas como
de ondas. Las ondas de luz constan de capos eléctricos y magnéticos que
oscilan en planos perpendiculares entre sí.

Desde el punto de vista de la energía, es más conveniente concebir

la luz como partículas llamadas fotones que transportan la energía (Daniel-
Analisis-quimico-cualitativo)

La figura muestra un haz de radiación paralela antes y después de

que ha pasado a través de una capa de solución que tiene un espesor de b
cm y una concentración c de una especie absorbente.

Como consecuencia de interacciones entre los fotones y las

partículas absorbentes, la potencia del haz es atenuada. La transmitancia T
de la solución es entonces la fracción de la radiación incidente transmitida
por la solución:
Fuente Selector de longitud Detector de
de onda Muestra la luz
de luz
(monocromador )

La transmitancia se expresa a menudo como porcentaje:

2.1.1 Absorción de la luz

Cuando una molécula absorbe un fotón aumenta la energía de la

molécula. Se dice que la molécula ha pasado a un estado excitado. Si una
molécula emite un fotón, disminuye la energía de la molécula. El estado de
mínima energía de una molécula e llama estado fundamental (.Daniel-
Analisis-quimico-cualitativo).
La absorción A de una solución se define mediante la ecuación:

2.1.1 Medida de absorbancia

La luz procedente de una fuente continua pasa a través de un

monocromador, que selecciona una banda estrecha de longitud de onda del
haz incidente. Esta luz monocromática atraviesa una mezcla de camino óptico
y mide la irradiación de la luz que emerge.

En espectroscopia visible y UV se coloca un muestra liquida

normalmente es una celda llamada cubeta, que tiene paredes lisas de sílice
fundida (SiO2). El vidrio es adecuado para espectroscopia visible. Pero no
para UV, porque absorbe radiación UV. Las cubetas más utilizadas tienen una
 longitud de camino óptico de 1000 cm, y se venden en juegos calibrados para
muestras y la referencia (Daniel-Analisis-quimico-cualitativo.pag.415).

Ley de Beer

Consideremos un bloque de materia absorbente (sólido, líquido

o gas). Un haz de radiación monocromática paralelo con intensidad I0 llega al
bloque perpendicular a la superficie; luego pasa a través de la longitud b del
material, que contiene n partículas absorbentes (átomos, iones o moléculas),
la intensidad del haz disminuye a I como resultado de la absorción.
Consideremos ahora una sección transversal del bloque que tiene un área S
(X x Y) y un espesor infinitesimal dx. Dentro de esta sección hay dn partículas
absorbentes; asociada a cada partícula podemos imaginar una superficie en
que ocurrirá la captura del fotón. Esto es, si un fotón alcanza una de esas
áreas por casualidad, ocurrirá inmediatamente la absorción. El área total de
esas superficies de captura dentro de la sección se designa ds; la relación del
área de captura al área total es ds/S.

En un promedio estadístico, esta relación representa la

probabilidad para la captura de fotones dentro de la sección.

La intensidad del haz que entra en la sección, Ix es proporcional

al número de fotones por cm2 y por segundo, y dIx representa la cantidad
removida por segundo dentro de la sección, la fracción absorbida es entonces
-dIx/Ix y esta relación también es la probabilidad promedio por captura. El
término tiene signo negativo para indicar que la intensidad del haz disminuye
(Química Analítica Cuantitativa, Day and Underwood).

Curva de Calibración

Denominamos espectro de una sustancia a la representación de

absorbancia (A) en función de longitud de onda (λ), este gráfico presenta
ondulaciones con máximos y mínimos.

Para hacer las determinaciones cuantitativas se elige, en general,

la longitud de onda correspondiente a un máximo, pues el error de medición es
mínimo y la sensibilidad máxima. Para verificar el cumplimiento de la ley de Beer,
se debe realizar la curva de calibración; absorbancia (A) en función de
concentración (c), para lo cual se preparan soluciones de la sustancia de
concentraciones conocidas y se mide la absorbancia a la longitud de onda
elegida

Si es válida la ley de Beer, para esa sustancia a esas

concentraciones, la relación debe ser una recta, que pase por el origen de los
ejes cartesianos; a menudo se observan desviaciones debidas a diversos
factores.
 III. MATERIALES Y METODOS

3.1. Materiales por mesa:

 Datos de absorbancia de una solución patrón obtenida en un

espectrofotómetro a 280 nm.
 Papel milimetrado.
 Lápiz.
 Regla

3.2. PROCEDIMIENTO

 A partir del cuadro 1, calcule las concentraciones de Albumina de

suero bovino (BSA).

 Palotee en un papel milimetrado los valores de ABSORBANCIA

(eje Y) versus la CONCENTRACION (eje X).

 Mediante una aproximación visual, grafique una línea recta que

inicie desde el punto (0,0).

 Determine la ecuación de la línea recta.

 Halle la concentración de BSA en la solución problema que tiene

un volumen de 10 ml, usando la ecuación o gráficamente.

 IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

Volumen (Ul) Volumen (ul)

Concentración Valor
# usado de BSA utilizado de Aps. 1 Aps.2 Aps.3
final de BSA promedio
conc. 10mg/ml H2O destilada

1 0 500 0 0 0 0 0
2 10 490 0.2 0.013 0.018 0.02 0.017
3 25 475 0.5 0.09 0.093 0.091 0.091
4 50 450 1 0.15 0.2 0.18 0.17
5 75 425 1.5 0.29 0.31 0.32 0.3
6 125 375 2.5 0.46 0.45 0.48 0.46
7 150 350 3 0.56 0.58 0.6 0.58
8 200 300 4 0.74 0.76 0.75 0.75
Solución
25 475 1.48 0.22 0.27 0.35 0.28
problema

Concentración de BSA:

25ul a 100 1.48

10 ml X
X=5.92x𝟏𝟎−𝟑
 V. CONCLUSIONES

 La trasmitancia nos indica la cantidad de energía que logro atravesar el

medio absorbente y la apsorbancia expresa la cantidad de energía que
quedo absorbida en las moléculas del medio absorbente.

 La ley de LAMBERT nos explica que Cuando un rayo de luz

monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad
disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio
absorbente aumenta.

 LEY DE BEER: Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de

un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a
medida que la concentración del medio absorbente aumenta.

 Se logró elaborar la curva estándar o de calibración

VI. RECOMENDACIÓN

 Recomendaría se recomienda usar un eclímetro para mayor precisión al

momento de elabora la curva estándar.
 VII. CUESTIONARIO

a) Consulte las aplicaciones de la espectrofotometría en las áreas

agropecuarias

 Uso de la espectrofotometría de reluctancia en el infrarrojo cercano

para el análisis de calidad de ensilaje de maíz.

 Espectrofotometría en la medición de concentración de semen

bovino, equino, porcino, ovino y canino.

b) ¿será la foto colorimetría un método analítico apropiado para

cuantificar compuestos en donde se presenta interferencia por color
de otros componentes presentes en la muestra que presenta
reactividad hacia el acomplejan te que realce el color?

Si. Pero tendríamos que purificar la muestra para no tener problemas con
otros componentes en la muestra que deán falsos resultados.
 VIII. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

 ANALISIS QUIMICO CUANTITATIVO-Daniel C. Harris-Tercera edición-

Editorial Reverte, SA.

 Análisis Instrumental, Douglas R. Skoog and Donald M. West

 Modern Analytical Chemistry-David Harvery.